專利名稱：一個簇毛麥6vs染色體特異的分子標記6vs-ssd及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學和遺傳育種科學技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一個特異追蹤簇毛麥6VS染色體的分子標記及其用法。
背景技術(shù)：
小麥是全球三大糧食作物之一，也是我國總產(chǎn)第一的糧食作物，是保障我國糧食安全的重要決定因素之一。小麥在其生育進程中常會受到生物或非生物脅迫的影響。小麥白粉病是一種世界性小麥病害，近年來隨著我國農(nóng)田水利設施改善和水肥條件提高，其危害逐年加重。通過遠緣雜交和染色體工程技術(shù)手段育成的小麥-簇毛麥T6AL. 6VS易位系對目前已發(fā)現(xiàn)的白粉病生理小種均表現(xiàn)高抗或免疫，其抗白粉病基因位于簇毛麥6V染色體短臂上(6VS)，是目前對小麥白粉病抗譜最廣、抗性最強的基因。近年來T6AL. 6VS易位系在小麥抗白粉病新品種選育中得到廣泛利用，目前已育成20多個抗白粉病小麥新品種，·推廣面積超過5000萬畝。T6AL. 6VS易位系是在普通小麥遺傳背景中由簇毛麥6V染色體短臂(6VS)替換了普通小麥6A染色體的短臂(6AS)，從而形成T6AL. 6VS易位染色體。由于簇毛麥與普通小麥親緣關(guān)系較遠，導致二者不發(fā)生染色體重組，T6AL. 6VS易位染色體始終以易位的形式出現(xiàn)在后代中。目前，未發(fā)現(xiàn)利用T6AL. 6VS易位系培育的新品種或新品系中出現(xiàn)染色體易位形式的改變。因此，簇毛麥6VS控制的性狀及其載有的DNA序列均以協(xié)同傳遞的方式出現(xiàn)在后代中。目前，部分研究已公布了部分與6VS上抗白粉病基因Pm21連鎖的相關(guān)分子標記OPT171400,OPT171900 ,SCAR1400,SCAR1265,NAU/XiBao15902 和 NAU/XiBaol61586。但是，總體而言，這些標記在標記輔助選擇育種中都存在不穩(wěn)定的缺點，一個原因是由標記類型決定的，如RAPD標記0PT1714QQ和0PT1719QQ ;其次是由于標記序列過長(大多接近或超過lOOObp)、PCR反應體系和反應條件要求苛刻，PCR結(jié)果可重復性差造成的。這些缺點均不利于標記輔助選擇技術(shù)在小麥育種實踐中的應用。EST (expressed sequence tag,表達序列標簽)是指從植物不同組織來源的cDNA文庫中隨機挑選克隆，對其5’和3’端進行測序獲得的短cDNA序列。EST-STS(sequence-tagged site, STS)標記是直接依據(jù)已經(jīng)定位于基因組物理圖上的EST序列設計引物，對基因組或者cDNA進行擴增，從中尋找與目的基因連鎖或具有染色體特異性的EST標記。由于EST-STS標記直接來源于表達基因序列，保守性較高，特別有利于界定物種之間的差異。因此，基于比較基因組學原理，利用普通小麥EST圖譜，同樣可以開發(fā)普通小麥親緣物種簇毛麥特定染色體的特異性分子標記。本發(fā)明就是基于上述思想指導下，利用比較基因組學原理，根據(jù)普通小麥bin-map圖譜上第6部分同源群短臂上的EST序列設計以PCR技術(shù)為基礎的EST-STS標記，篩選簇毛麥6V染色體短臂(6VS)特異性分子標記，用于快速檢測和追蹤普通小麥遺傳背景中T6AL. 6VS易位染色體及其控制的抗白粉病性狀，為小麥抗白粉病分子標記輔助選擇育種提供新型、實用、高效的分子標記。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種特異追蹤簇毛麥6VS染色體的分子標記及其用法，它利用比較基因組學原理，根據(jù)普通小麥bin-map圖譜上第6部分同源群短臂的EST序列，設計以PCR技術(shù)為基礎的EST-STS標記引物，篩選簇毛麥6VS染色體特異性分子標記，為抗白粉病小麥-簇毛麥T6AL. 6VS易位系在小麥抗白粉病新品種培育中的應用提供一種新型、實用、高效的分子標記輔助選擇技術(shù)。為了解決背景技術(shù)所存在的問題，本發(fā)明是采用以下技術(shù)方案它是根據(jù)普通小麥bin-Map圖譜第6部分同源群短臂的EST序列BE585684設計得到的，標記引物擴增出的一段約350bp的DNA條帶位于簇毛麥6VS染色體，可以特異地追蹤6VS染色體及其控制的抗小麥白粉病性狀，標記引物序列為
6VS-SSDF :5’-CCAACTCTAGCTGACCGCAGACTA-3’ (SEQ ID NO. I),
6VS-SSDR :5’ -ATTCCATGGTGTAATAGCTCCAACTAC-3’ (SEQ ID NO. 2)。本發(fā)明還公開了所述的簇毛麥6VS染色體特異的分子標記6VS-SSD在追蹤小麥-簇毛麥T6AL. 6VS易位染色體中的用途。用所述的簇毛麥6VS染色體特異的分子標記6VS-SSD追蹤小麥-簇毛麥T6AL. 6VS易位染色的方法，是用該分子標記引物對待測材料進行PCR擴增，擴增出350bp條帶的材料，為含有小麥-簇毛麥T6AL. 6VS易位染色體的材料。本發(fā)明所述分子標記的具體用法為
(1)PCR反應體系:10μ L 反應體系中含約 10 — 20ng模板DNA，IXPCR buffer, I. 5mmolΓ1 MgCl2, 200mmol Γ1 dNTP，兩條引物終濃度各為 0. 2 μ mol Λθ. 5U Taq DNA 聚合酶，用無菌蒸懼水補充反應體系至IOyL;
(2)PCR反應程序94°C預變性3分鐘；94°C變性20秒，58°C退火30秒，72°C延伸30秒，32個循環(huán)；72°C延伸5分鐘；4°C保存；
(3)PCR產(chǎn)物檢測PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)8%非變性聚丙烯酰胺凝膠上電泳分離，用銀染法染色。本發(fā)明在利用T6AL. 6VS易位系為親本進行抗白粉病性狀的追蹤時，凡是擴增出350bp條帶的材料，都含有小麥-簇毛麥T6AL. 6VS易位染色體，并對白粉病表現(xiàn)高抗；凡是不能擴增出350bp條帶的材料，都不具有T6AL. 6VS易位染色體，相應丟失由6VS染色體控制的白粉病抗性。本發(fā)明具有以下有益效果
I、本發(fā)明的分子標記6VS-SSD在鑒定簇毛麥6VS染色體時特異性強已開發(fā)的分子標記0PT1714(i(i和0PT1719(i(i都非6VS特異性標記，只有在親本間存在與6VS的多態(tài)性時，才可以利用，而使用6VS-SSD時，無論涉及何種親本，只要出現(xiàn)350bp條帶，就可以確定材料中含有6VS染色體。2、本發(fā)明的6VS染色體特異性EST-STS標記相較SCAR標記更易于識別PCR擴增失敗導致的“假陰性”:本發(fā)明的標記為共顯性標記，在普通小麥遺傳背景中，無論是否具有T6AL. 6VS易位染色體，都可以擴增出兩條約為500bp的背景條帶，可用于判斷PCR擴增是否成功，排除“假陰性”。3、本發(fā)明的分子標記穩(wěn)定性好，容易為育種實踐利用本發(fā)明的標記由于目標條帶較短，僅350bp，PCR擴增時對DNA模板質(zhì)量的要求不高，在部分降解的DNA模板中仍能有效擴增出目標產(chǎn)物，而且PCR反應的延伸時間僅需30秒，有利于提高標記輔助選擇的效率。


圖I :分子標記 6VS-SSD 的 PCR 擴增結(jié)果。M DNA marker DL2000 ；1 :簇毛麥；2 普通小麥；3 :小麥-簇毛麥易位系T6AL. 6VS ；Γ12 :寧麥9號與T6AL. 6VS易位系雜交組合的分離群體。箭頭所示為350bp的特異性條帶。
具體實施方式

本發(fā)明具體實施方式
采用以下技術(shù)方案根據(jù)普通小麥bin-Map圖譜第6部分同源群的EST序列BE585684設計一對標記引物，利用PCR技術(shù)擴增出的一段350bp的DNA條帶，該條帶可位于簇毛麥6VS染色體，能特異地追蹤6VS染色體及其控制的抗小麥白粉病性狀。實施例
I、引物的設計與合成
根據(jù)美國農(nóng)部網(wǎng)站http://wheat. pw. usda. gov的信息,搜索定位于普通小麥第6部分同源群的EST序列,利用Primer Premier 5. O軟件進行引物設計，引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。2、簇毛麥6VS染色體特異性EST-STS標記的篩選
(I)PCR擴增以簇毛麥、普通小麥、小麥-簇毛麥易位系T6AL. 6VS為材料(均為公知公用種質(zhì)材料，由南京農(nóng)業(yè)大學細胞遺傳研究所提供)，提取基因組DNA后進行PCR擴增，IOyL PCR 反應體系中含約 10 — 20ng 模板 DNA，1XPCR buffer, I. 5mmol Γ1 MgCl 2,200mmol Γ1 dNTP，兩條引物終濃度各為O. 2 μ mol Γ',Ο. 5U Taq DNA聚合酶，用無菌蒸餾水補充反應體系至10 μ L ；PCR反應程序為94°C預變性3分鐘；94°C變性20秒，58°C退火30秒，72 °C延伸30秒，32個循環(huán)；72°C延伸5分鐘；4°C保存。(2) PCR產(chǎn)物的檢測PCR擴增產(chǎn)物在8%非變性聚丙烯酰胺凝膠(29:1)上進行電泳分離，采用銀染法染色。 (3)PCR結(jié)果分析本發(fā)明篩選到一個簇毛麥6VS染色體特異的分子標記6VS-SSD，標記引物是根據(jù)定位于小麥第6部分同源群短臂的EST序列BE585684設計，具體序列為6VS-SSDF :5’ -CCAACTCTAGCTGACCGCAGACTA-3’ (SEQ ID NO. I),
6VS-SSDR :5’-ATTCCATGGTGTAATAGCTCCAACTAC-3’ (SEQ ID NO. 2)。以該標記引物進行PCR擴增，能在普通小麥中擴增到兩條約為500bp的DNA條帶，在簇毛麥中擴增到一條約為350bp的DNA條帶，而在小麥-簇毛麥易位系T6AL. 6VS中，既能擴增到兩條約500bp條帶,也能擴增到一條約350bp條帶(見圖I中1 3),表明350bp條帶可定位于簇毛麥6VS染色體，因此，分子標記6VS-SSD能在小麥背景中特異性追蹤簇毛麥6VS染色體。
3、簇毛麥6VS染色體特異性標記6VS-SSD在分子標記輔助選擇育種中的應用利用篩選到的簇毛麥6VS染色體特異性標記引物6VS-SSD，對寧麥9號(公知公用，由江蘇省農(nóng)業(yè)科學院培育)與抗白粉病T6AL. 6VS易位系(公知公用，由南京農(nóng)業(yè)大學細胞遺傳研究所創(chuàng)制并提供)雜交組合的分離群體進行鑒定，結(jié)合白粉病抗性鑒定，結(jié)果顯示在所有供試材料中，凡具有350bp條帶的材料，都表現(xiàn)高抗白粉病；凡缺失350bp條帶的材料都表現(xiàn)高感白粉病(見圖I中4 12)。該結(jié)果表明，本發(fā)明開發(fā)的EST-STS標記6VS-SSD能有效追蹤小麥背景中的簇毛麥6VS染色體，在分子標記輔助選擇育種中具有潛在的應用價值?！?br> 權(quán)利要求
1.一個簇毛麥6VS染色體特異的分子標記6VS-SSD，其特征在于該分子標記引物的序列為6VS-SSDF :5’ -CCAACTCTAGCTGACCGCAGACTA-3’，6VS-SSDR :5’ -ATTCCATGGTGTAATAGCTCCAACTAC-3’。
2.權(quán)利要求I所述的簇毛麥6VS染色體特異的分子標記6VS-SSD在追蹤小麥-簇毛麥T6AL. 6VS易位染色體中的用途。
3.一種用權(quán)利要求I所述的簇毛麥6VS染色體特異的分子標記6VS-SSD追蹤小麥-簇毛麥T6AL. 6VS易位染色的方法，是用該分子標記引物對待測材料進行PCR擴增，擴增出350bp條帶的材料，為含有小麥-簇毛麥T6AL. 6VS易位染色體的材料。
全文摘要
本發(fā)明公開了一個特異追蹤簇毛麥6VS染色體的分子標記6VS-SSD及其用法，它涉及分子生物學和遺傳育種科學技術(shù)領(lǐng)域。該標記引物是根據(jù)小麥第6部分同源群短臂的EST序列BE585684設計，具體序列為6VS-SSDF5’-CCAACTCTAGCTGACCGCAGACTA-3’，6VS-SSDR5’-ATTCCATGGTGTAATAGCTCCAACTAC-3’，以標記引物進行PCR時能擴增出一條350bp的特異性DNA條帶，能快速有效地追蹤簇毛麥6VS染色體及其控制的抗小麥白粉病性狀，在小麥抗白粉病分子標記輔助選擇育種中具有較強的實用價值。
文檔編號C12Q1/68GK102943073SQ20121029471
公開日2013年2月27日 申請日期2012年8月20日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月20日
發(fā)明者何華綱, 別同德, 朱姍穎, 胡向均, 李晶晶 申請人:江蘇大學