一種適用于dna擴增技術(shù)的中藥材基因組dna提取方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種適用于擴增技術(shù)的基因組DNA快速提取方法，僅采用氫氧化鈉溶液和Tris-HCl溶液，極為簡單經(jīng)濟。本發(fā)明采用的提取方法，15min就可以完成樣品DNA提取的全過程，該法通用性強，對于植物藥、動物藥的飲片及其炮制品均具有良好的提取效果。所提取的DNA質(zhì)量滿足了下游PCR擴增的需要，解決了目前中藥材普通PCR反應(yīng)模板DNA提取時間長、工作量大的問題，適用于科研和生產(chǎn)過程中快速提取DNA的要求。
【專利說明】—種適用于DNA擴增技術(shù)的中藥材基因組DNA提取方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種快速提取中藥材基因組DNA的方法，屬于分子生物學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】。【背景技術(shù)】
[0002]1985年問世的PCR反應(yīng)(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))是一種體外核酸擴增技術(shù)，因其具有敏感性高、特異性強、操作簡便、重復(fù)性好，易于自動化的特點，已被廣泛用于生命科學(xué)、醫(yī)學(xué)、藥學(xué)的各個領(lǐng)域，成為醫(yī)藥研究不可或缺的手段。除此之外，等溫擴增技術(shù)包括Q復(fù)制酶反應(yīng)(QBRA)、鏈置換擴增技術(shù)(SDA)、切口酶恒溫擴增技術(shù)(NEMA)、轉(zhuǎn)錄依賴的擴增技術(shù)(TASTMA、3SR、NASBA)、解旋酶擴增技術(shù)(HAD)、滾環(huán)擴增技術(shù)(RCA)、環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)(LAMP)、單引物等溫擴增技術(shù)(SPIA)等簡化了對儀器和實驗室條件的要求、縮短了檢測時間，在中藥鑒定領(lǐng)域具有很好的發(fā)展前景。(Walker GT, Fraiser MS, Schram JL, etal.Strand displacement amplification 「is othermal, in vitro DNA amplificationtechnique.Nucleic Acids Research,1992,20 (7):1691-1696 ;Notomi T, Okayama H,Masubuchi H,ct al.Loop「mediated isothermal amplification of DNA.Nucleic AcidsResearch,2000,28(12):63.)
[0003]DNA擴增技術(shù)的第一步是模板DNA的制備，即樣品中DNA的提取。長期以來DNA的提取一直是PCR檢測過程中最耗時，繁瑣的步驟，嚴(yán)重影響了檢測的速度。對于中藥研究來說，中藥材品種繁多，各品種差異大，基因組DNA提取的工作量非常巨大。傳統(tǒng)的CTAB(十六烷基三甲基溴化銨)法或SDS (十二烷基硫酸鈉)法通過使用CTAB或SDS裂解細胞，酚/氯仿抽提蛋白質(zhì)，異丙醇沉淀DNA，乙醇洗滌，適用于大多數(shù)中藥材基因組DNA的提取。然而，CTAB法或SDS法流程繁瑣、操作復(fù)雜，一般需要5小時以上才能提取出DNA。并且操作過程中使用了大量的酚/氯仿、β_巰基乙醇、異丙醇的有機溶劑，有損于操作人員的身體健康。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種可大規(guī)模、簡單快速的中藥材基因組DNA提取方法，用于DNA擴增技術(shù)鑒別中藥材及研究遺傳多樣性。本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實現(xiàn):
[0005](I)取供試品中藥材20-50mg，置于粉碎機中研磨至可過40目篩，放入2.0mL的微
量離心管內(nèi)。
[0006](2)加入 200-400 μ L、0.25-0.6mol/L 的氫氧化鈉溶液，混勻 2_3min。
[0007](3)加入 1600 μ LU00mmol/L 的 Tris-HCl 溶液(pH = 8.0)，溫和混勻。
[0008](4) 12000rpm 下離心 2min。
[0009](5)取 50 μ L 上清至一新的 1.5mL 離心管，加入 450 μ L、100mmol/L 的 Tris-HCl 溶液(pH = 8.0)。取I μ L上清，加入PCR反應(yīng)體系內(nèi)進行PCR擴增。
[0010]本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在:(I)本方法具有簡單、快速、節(jié)約試劑及耗材、污染小等特點，可用于規(guī)模化提取。(2)本方法通用性強，對于植物藥、動物藥的飲片及炮制品均具有良好的提取效果。[0011]為了能更清晰地說明本發(fā)明的提取方法，下面結(jié)合具體實施案例，對本發(fā)明的提取方法進行進一步闡述。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0012]圖1:植物類中藥材PsbA-trnH片段PCR擴增電泳圖
[0013]1，金銀花；2，紅花；3，辛夷；4，藿香；5，人參；6，蒼耳子；7，枸杞子；8，車前子；9，葶藶子；10，菟絲子；11，石楠葉；12，紫蘇葉；13，苦參；14，葛根；15，當(dāng)歸；16，預(yù)知子；17，白芍；18，厚樸(發(fā)汗)；19，竹葉；20，黃芩；21，丹皮；22，龍膽；23，大黃(酒制)；24，吳茱萸(甘草制)；25，大血藤；26，黃連；27，鴨趾草；28，草烏(煮制)；29，苦參；30，山藥(蒸制)；31，槐米；33，草豆蘧；34，甘草(炙)；35，姜黃；36，決明子。
[0014]圖2:動物類中藥材COI片段PCR擴增電泳圖
[0015]M，DL2000DNA marker ；N,陰性對照；1，烏梢蛇；2，金錢白花蛇；3，土鱉蟲；4，地龍；
[0016]圖3:烏梢蛇特異性鑒別引物PCR擴增電泳圖
[0017]M，DL2000DNA marker ；N,陰性對照；1，烏梢蛇；2，金錢白花蛇；3，地龍；4，全蝎；5，全蝎。
[0018]具體實施例1
[0019]1.材料和方法
[0020]1.1 材料
[0021]所用材料如表1所示,包括:
[0022]表1中藥材相關(guān)樣品基本情況
[0023]
【權(quán)利要求】
1.一種快速提取中藥材基因組DNA的方法，其特征包括以下步驟: (I)取供試品中藥材20-50mg，置于粉碎機中研磨至可過40目篩，放入2.0mL的微量離心管內(nèi)；(2)加入200-400 μ L、0.25-0.6mol/L的氫氧化鈉溶液，混勻2-3min ;(3)加入1600 μ L> 100mmol/L 的 Tris-HCl 溶液(pH = 8.0),溫和混勻；(4) 12000rpm 下離心 2min ；(5)取50 μ L上清至一新的1.5mL離心管,加入450 μ L、100mmol/L的Tris-HCl溶液(pH =8.0)。取I μ L上清，加入PCR反應(yīng)體系內(nèi)進行PCR擴增。
2.如權(quán)利要求書I所述中藥材基因組DNA快速提取方法，其中所述的供試品中藥材包括動物類中藥材和植物類中藥材。
3.如權(quán)利要求書I所述中藥材基因組DNA快速提取方法，其中所述的供試品中藥材包括無霉變的新鮮植物藥材，干性粉末，愈傷組織，飲片及炮制后的動植物藥材。
4.如權(quán)利要求書I所述中藥材基因組DNA快速提取方法，其中所述的氫氧化鈉溶液濃度為 0.25-0.6mol/L, Tris-HCl 溶液的濃度為 100mmol/L，pH 為 8.0。
【文檔編號】C12N15/10GK103627699SQ201210296810
【公開日】2014年3月12日 申請日期:2012年8月21日 優(yōu)先權(quán)日:2012年8月21日
【發(fā)明者】黃璐琦, 袁媛, 蔣超 申請人:中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所