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芍藥脫氧木酮糖-5-磷酸合酶(pldxs)基因及其編碼產(chǎn)物和應(yīng)用的制作方法

文檔序號(hào):506596閱讀:232來(lái)源:國(guó)知局
芍藥脫氧木酮糖-5-磷酸合酶(pldxs)基因及其編碼產(chǎn)物和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種芍藥脫氧木酮糖-5-磷酸合酶(PLDXS)基因及其編碼蛋白與用途,該基因?yàn)槭状卫脴?gòu)建cDNA文庫(kù)從芍藥中克隆而得,填補(bǔ)了從我國(guó)傳統(tǒng)中藥材芍藥中分離克隆出脫氧木酮糖-5-磷酸合酶基因的空白。本發(fā)明所提供的芍藥脫氧木酮糖-5-磷酸合酶(PLDXS)基因具有SEQ?ID?NO.1所示的核苷酸序列或者添加、取代、插入或缺失一個(gè)或多個(gè)核苷酸的同源序列或其等位基因及其衍生的核苷酸序列。所述基因編碼的蛋白質(zhì)具有SEQ?ID?NO.2所示的氨基酸序列或者添加、取代、插入或缺失一個(gè)或多個(gè)氨基酸的同源序列。本發(fā)明提供的芍藥脫氧木酮糖-5-磷酸合酶(PLDXS)基因可以通過(guò)生物技術(shù)提高芍藥中脫氧木酮糖-5-磷酸(DXP)途徑代謝產(chǎn)物的含量,在藥材芍藥的品質(zhì)改良、活性成分合成生物學(xué)等方面,具有很好的應(yīng)用前景。
【專利說(shuō)明】芍藥脫氧木酮糖-5-磷酸合酶(PLDXS)基因及其編碼產(chǎn)物
和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】,主要涉及利用芍藥cDNA文庫(kù)克隆脫氧木酮糖-5-磷酸合酶基因及其編碼產(chǎn)物與應(yīng)用,尤其涉及生物合成有藥理活性成分的有機(jī)酸、萜類酶基因及其編碼產(chǎn)物與應(yīng)用,屬于藥用植物基因工程領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]藥用植物活性成分的形成是植物次生代謝途徑中特有基因群的產(chǎn)物。隨著植物功能基因組研究的廣泛與深入,獨(dú)具特色又有廣闊應(yīng)用前景的藥用植物次生代謝合成相關(guān)功能基因的研究逐漸成為研究的熱點(diǎn),這些基因的克隆將為解析藥用植物有效成分的生物合成途徑及其調(diào)控機(jī)制和解釋藥材品質(zhì)的形成提供理論基礎(chǔ),同時(shí)為利用生物技術(shù)提高目標(biāo)成分含量或直接生產(chǎn)有效成分或中間體帶來(lái)廣闊的應(yīng)用空間。藥用植物的化學(xué)成分復(fù)雜、種類繁多,其中主要含有有機(jī)酸類、黃酮類、揮發(fā)油、萜類、二萜類、微量元素等多種成分,芍藥Paeonia lactif 1ra不僅是名花,還是一味常用中藥,其根可供藥用。其中白茍具有鎮(zhèn)痙、鎮(zhèn)痛、通經(jīng)等作用。芍藥根中含有芍藥苷、安息香酸等活性成分,其中芍藥苷屬于單萜類化合物,具有顯著的鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、抗驚厥、,解痙、解熱、抗炎、抗?jié)?、抗過(guò)敏、降血糖、調(diào)節(jié)免疫、保護(hù)肝臟等作用(楊俊,方紅編。芍藥[M]。北京:中國(guó)中醫(yī)藥出版社,2001,113)。
[0003]脫氧木酮糖-5-憐酸合酶(l-deoxy-D-xylulose-5-phosphatesynthase, DXS)是位于質(zhì)體中的萜類化合物生物合成途徑脫氧木酮糖-5-磷酸(DXP)途徑的起始酶,能將丙酮酸和甘油醛-3-磷酸轉(zhuǎn)化生成DXP,現(xiàn)在普遍認(rèn)為DXS是DXP途徑的關(guān)鍵酶和限速酶,其表達(dá)量可能 與芍藥苷等萜類成分的含量密切相關(guān)。芍藥脫氧木酮糖-5-磷酸合酶(PLDXS)基因的克隆,為利用基因工程提高芍藥活性成分含量提供重要物質(zhì)基礎(chǔ),在藥材芍藥的品質(zhì)改良、活性成分合成生物學(xué)等方面,具有很好的應(yīng)用前景。在本發(fā)明被公布之前,尚未有任何公開(kāi)或報(bào)道過(guò)本專利中請(qǐng)中所提及的芍藥中脫氧木酮糖-5-磷酸合酶基因及其氨基酸序列。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供一種芍藥脫氧木酮糖-5-磷酸合酶(PLDXS)基因。
[0005]本發(fā)明第二個(gè)目的是提供該基因編碼的蛋白質(zhì)。
[0006]本發(fā)明還提供了含有該基因的重組載體和宿主細(xì)胞。
[0007]本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供該基因的應(yīng)用。
[0008]本發(fā)明所提供的芍藥脫氧木酮糖-5-磷酸合酶(PLDXS)基因,為以下核苷酸序列之一:
[0009](I)具有SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列;
[0010](2) SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列添加、取代、插入或缺失一個(gè)或多個(gè)核苷酸的同源序列或者其等位基因及其衍生的核苷酸序列。[0011]該基因所編碼的蛋白質(zhì)為芍藥脫氧木酮糖-5-磷酸合酶(PLDXS)基因,是以下氨基酸序列之一:
[0012](I)具有SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列;
[0013](2) SEQ ID N0.2添加、取代、插入或缺失一個(gè)或多個(gè)氨基酸的同源序列。
[0014]本發(fā)明所提供的脫氧木酮糖-5-磷酸合酶(PLDXS)基因是首次從芍藥中克隆制備的,體外實(shí)驗(yàn)表明,PLDXS具有催化丙酮酸和甘油醛-3-磷酸生成DXP的活性。利用本發(fā)明可以通過(guò)基因工程技術(shù)來(lái)提高芍藥等植物中萜類物質(zhì)含量。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】:[0015]圖1:PLDXS功能域預(yù)測(cè)分析(來(lái)源于NCBI數(shù)據(jù)庫(kù));
[0016]圖2 =PLDXS系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(鄰接法);
[0017]圖3:表達(dá)載體pET32-PLDXS構(gòu)建;
【具體實(shí)施方式】
[0018]實(shí)施例1、芍藥cDNA文庫(kù)的構(gòu)建
[0019]1、芍藥總RNA的分離和檢測(cè)
[0020]取茍藥(Paeonia Iactiflora)的根2g,在研缽中用液氮快速研磨成粉末,快速轉(zhuǎn)移至 65°C預(yù)熱的 IOmL 提取緩沖液中(CTAB (ff/V)2%, Tris-HCl (pH8.0) IOOmmol.l-1,EDTA25mmol.?Λ NaCl 2.0mol.?Λ PVP402%,亞精胺 0.5g/L,巰基乙醇 2% ),充分振蕩混勻;用等體積氯仿抽提兩次,7500g離心15分鐘。上清液加入1/4體積的IOM LiCl,混勻后放置 4°C沉淀過(guò)夜;7500g 離心 20 分鐘,沉淀用 500yL SSTE (SDS 0.5%, NaCl Imol.?ΛTris-HCl (ρΗ8.0) IOmmol.?Λ EDTA lmmol.?Λ 在 65°C溶解 5 分鐘。用等體積氯仿抽提,13000g離心5分鐘;上清液加入2倍體積無(wú)水乙醇,_70°C放置2小時(shí);4°C 13000g離心20分鐘,沉淀室溫干燥10分鐘后溶于IOOy L DEPC處理的水中,用1.0%瓊脂糖電泳檢測(cè)RNA的完整性,用GenQuant核酸定量?jī)x測(cè)定Α260、Α280比值和濃度。置于_80°C冰箱備用。
[0021]2、cDNA文庫(kù)的構(gòu)建
[0022]米用mRNA 純化試劑盒(QuichprepTM Micro mRNA Purification Kit,Pharmacia公司)分離 mRNA 后,米用 Clontech 公司的 Creator Smart cDNA Library ConstructionKit (Cat.N0.634903)進(jìn)行建庫(kù),原理為 SMART (switch mechanism at 5 ' end of mRNAtemplate)。
[0023]實(shí)施例2:芍藥相關(guān)基因的克隆
[0024]隨機(jī)挑取5000個(gè)單克隆進(jìn)行菌落PCR鑒定。取適量PCR薄壁管,置于冰上,每管先加入17.3ul的滅菌水。用滅過(guò)菌的IOul小槍頭挑取單克隆白斑至滅菌水中,振蕩混勻。依次加入:Taq buffer 2.5 μ L, MgCl2 (25mM) 1.8μ L, dNTP (2.5mM) I μ L, M13+ 引物(IOpmol) I μ L,M13-引物(IOpmol) I μ L,Taq SI 0.4 μ L0 PCR 反應(yīng)條件為 94°C預(yù)變性 5 分鐘后,94°C 40秒,54°C 40秒,72°C 4分鐘,35個(gè)循環(huán)后72°C延伸10分鐘,4°C保存。待PCR反應(yīng)進(jìn)入4°C后,取下PCR薄壁管,取7ulPCR產(chǎn)物加入3ul溴芬蘭進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳,半小時(shí)后照相,觀察膠圖,根據(jù)膠圖粗略鑒定插入片段的大小及小片段率。選擇條帶單一擴(kuò)增產(chǎn)物送至華大基因公司進(jìn)行測(cè)序,獲得芍藥相關(guān)基因序列。[0025]實(shí)施例3、PLDXS基因的生物信息學(xué)分析
[0026]本發(fā)明涉及的芍藥脫氧木酮糖-5-磷酸合酶基因全長(zhǎng)cDNA的長(zhǎng)度為2160bp,詳細(xì)序列見(jiàn)序列表中的序列1,其中開(kāi)放讀碼框位于l_2160bp。將芍藥全長(zhǎng)cDNA序列用 BLAST 程序在 Non-redundant GenBank+EMBL+DDBJ+PDB 和 Non-redundant GenBankCDS translation+PDB+Swissprot+Superdate+PIR 數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行核苷酸同源性檢索。該基因在氨基酸水平上與其它物種中的DXS有較高的同源性,同時(shí)具有典型的l-deoxy-D-xylulose-5-phosphate synthase 結(jié)構(gòu)域。如圖1。
[0027]實(shí)施例4、PLDXS基因功能的研究
[0028]1.重組質(zhì)粒的構(gòu)建
[0029]以PLDXS cDNA 為模板,利用引物 Pl:5' -GGATCCATGGGTACTGCTTCTGCTCATTAC-3',P2:5/ -GGTACCCTAGCACATCAAAAGGAGAGCTTCA-3'進(jìn)行 PCR 反應(yīng),反應(yīng)體系同實(shí)驗(yàn)例 2。取5ul擴(kuò)增產(chǎn)物加入3ul溴芬蘭進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳,半小時(shí)后照相,觀察膠圖,擴(kuò)增片段為2172bp。用BamH I和Kpn I在37°C下雙酶切擴(kuò)增產(chǎn)物2小時(shí),利用回收試劑盒(Takara公司,中國(guó))純化酶切產(chǎn)物。同時(shí)利用BamH I和Kpn I在37°C下酶切pMD19_T載體2小時(shí),加入5ul溴芬蘭進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳,觀察膠圖,并利用回收試劑盒回收片段。
[0030]回收片段經(jīng)T4連接酶在8°C連接過(guò)夜。電擊轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞,在含有氨芐青霉素的LB平板上篩選重組子。含PLDXS克隆的pMD19質(zhì)粒經(jīng)PCR和限制性內(nèi)切酶酶切鑒定和DNA序列分析,保存具有正確目標(biāo)序列的重組質(zhì)粒pMD 19-PLDXS。
[0031]2.原核表達(dá)及載體構(gòu)建
[0032]BamH I和Kpn I雙酶切pMD 19-PLDXS質(zhì)粒和pET 32a質(zhì)粒,分別回收目標(biāo)片段PLDXS和開(kāi)環(huán)的pET32a片段?;厥掌蜳LDXS和pET 32a于16°C連接過(guò)夜,獲得重組質(zhì)粒,經(jīng)PCR和限制性內(nèi)切酶酶切鑒定和DNA序列分析,證明含有正確序列的PLDXS,該表達(dá)載體命名為 pET32-PLDXS(圖 3)。
[0033]用目標(biāo)質(zhì)粒pET32-PLDXS利用CaCl2方法轉(zhuǎn)入E.coli BL21感受態(tài)細(xì)胞,培養(yǎng)篩選含有pET32-PLDXS質(zhì)粒的陽(yáng)性菌株。挑取單菌落的工程菌于3ml含100 μ g/ml氨芐青霉素LB培養(yǎng)基中振搖培養(yǎng)過(guò)夜,按1: 100的濃度吸取培養(yǎng)液于新的LB培養(yǎng)基(含100 μ g/ml氨芐青霉素)中培養(yǎng)約3小時(shí),至0D600達(dá)0.5后,取Iml菌液作為誘導(dǎo)前對(duì)照,然后加入終濃度為lmmol/L的異丙基硫代-β -D-半乳糖苷(IPTG),在37°C振蕩培養(yǎng)中誘導(dǎo)工程菌表達(dá),于誘導(dǎo)3h后取樣1ml,以含有pET32a空載體的E.coli BL21培養(yǎng)物為陰性對(duì)照。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果表明,在分子量約為78.89kD處,出現(xiàn)一條明顯的特異蛋白質(zhì)表達(dá)條帶,與理論值一致。
[0034]3.PLDXS基因功能分析
[0035]BamH I和Kpn I雙酶切pMD 19-PLDXS質(zhì)粒和pTrc-AtlPI質(zhì)粒,分別回收目標(biāo)片段PLDXS和大片段pTrc骨架,于16°C連接回收片段,獲得重組質(zhì)粒,經(jīng)PCR和限制性內(nèi)切酶酶切鑒定和DNA序列分析,證明含有正確序列的PLDXS,
[0036]將pTrc-PLDXS轉(zhuǎn)化攜帶pAC_LYC質(zhì)粒的大腸桿菌XLl-Blue,并在含有Amp (100 μ g/ml)和Cm(50 μ g/ml)的LB培養(yǎng)基上篩選陽(yáng)性克隆。
[0037]將攜帶番茄紅素生物合成途徑上香葉基香葉基焦磷酸合成酶(crtE)、八氫番茄紅素合成酶(crtB)、八氫番茄紅素脫飽和酶(crtl)3個(gè)關(guān)鍵酶基因的原核表達(dá)載體pAC-LYC導(dǎo)入大腸桿菌菌株XLl-Blue后,可以在本底水平上表達(dá)番茄紅素。當(dāng)把pTrc-PLDXS導(dǎo)入上述重組菌后,由于突破了上游途徑的代謝瓶頸,推動(dòng)代謝流向番茄紅素合成的方向流動(dòng),使該菌能大量積聚番茄紅素。
[0038]本發(fā)明挑取分別含有Ll-Blue+pTrc-PLDXS、XLl-Blue+pTrc-PLDXS+pAC-LYC 的大腸桿菌單克隆,在含有Απιρ(100μ g/ml)和Cm(50yg/ml)的LB培養(yǎng)基上,于28 °C倒置暗培養(yǎng),2~3天后觀察菌落顏色變化情況。以含有XLl-Blue、XLl-Blue-+pAC-LYC、XLl-BIue+pTrc+pAC-LYC大腸桿菌單克隆為對(duì)照。
[0039]實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,72h培養(yǎng)后,XLl-Blue 空菌、XLl-Blue+pTrc-PLDXS、XLl-Blue+pAC-LYC都不能生長(zhǎng);XLl-Blue+pTrc+pAC_LYC未攜帶PLDXS,不能過(guò)量表達(dá)番茄紅素,所以菌落仍呈現(xiàn)XL1-Blue本身的淡黃色;只有XLl-Blue+pTrc-PLDXS+pAC-LYC由于能大量表達(dá)番茄紅素,經(jīng)培養(yǎng)后,菌落呈現(xiàn)番茄紅素特有的紅色。從而證明了 PLDXS可以推動(dòng)代謝流向番茄紅素合成的方向流動(dòng),使該菌能大量積聚番茄紅素。
[0040]4.突變DXS活性測(cè)定
[0041]以PLDXS cDNA 為模板,利用突變引物 P3:5' -GGATCCATGGGTACCGCTTCTGCTCATTAC-3/ , P4:5/ -GGTACCCTAGCACATCAAAAGGAGAGCTTCA-3'進(jìn)行 PCR 反應(yīng),重組質(zhì)粒的構(gòu)建、原核表達(dá)及載體構(gòu)建、PLDXS功能分析方法同上,結(jié)果表明突變PLDXS轉(zhuǎn)基因工程菌株與正常PLDXS沒(méi)有顯著差異。
【權(quán)利要求】
1.一種芍藥脫氧木酮糖-5-磷酸合酶(PLDXS)基因,其特征在于,它是下列核苷酸序列之一:
(1)SEQID N0.1 的 DNA 序列; (2)SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列添加、取代、插入或缺失一個(gè)或多個(gè)核苷酸的同源序列或者其等位基因及其衍生的核苷酸序列。
2.—種芍藥脫氧木酮糖-5-磷酸合酶(PLDXS),其特征在于,是以下氨基酸序列之一: (1)具有SEQID N0.2所不的氣基酸序列; (2)SEQ ID N0.2添加、取代、插入或缺失一個(gè)或多個(gè)氨基酸的同源序列。
3.重組載體,其特征在于:含有權(quán)利要求1所述的芍藥脫氧木酮糖-5-磷酸合酶(PLDXS)基因全序列或部分序列。
【文檔編號(hào)】C12N9/10GK103627717SQ201210296844
【公開(kāi)日】2014年3月12日 申請(qǐng)日期:2012年8月21日 優(yōu)先權(quán)日:2012年8月21日
【發(fā)明者】黃璐琦, 袁媛, 汪周勇 申請(qǐng)人:中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所
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