一種提高流感病毒疫苗毒株產(chǎn)量的方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種提高流感病毒疫苗毒株產(chǎn)量的方法，其是通過(guò)在用于生產(chǎn)流感疫苗毒株的細(xì)胞中過(guò)表達(dá)FMRP蛋白或含有KH2結(jié)構(gòu)域的功能性截短體蛋白，從而提高流感病毒疫苗毒株在細(xì)胞生產(chǎn)中的產(chǎn)量。結(jié)果表明，通過(guò)在用于生產(chǎn)流感疫苗毒株的細(xì)胞（如Vero、MDCK細(xì)胞）中以瞬時(shí)或穩(wěn)定表達(dá)的方式過(guò)表達(dá)FMRP蛋白可將流感病毒復(fù)制效率提高2倍以上，將收獲的病毒制備成疫苗，以滿足市場(chǎng)對(duì)流感疫苗的需求。
【專利說(shuō)明】一種提局流感病毒疫苗毒株產(chǎn)量的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及流感病毒疫苗毒株的制備，具體地說(shuō)，涉及一種提高流感病毒疫苗毒株產(chǎn)量的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]流行性感冒(流感)是人類最常見(jiàn)的傳染病之一，頻繁的區(qū)域性暴發(fā)與不確定的流感大流行嚴(yán)重危害著人類健康并造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。由于流感病毒易發(fā)生抗原突變和基因重組,易產(chǎn)生耐藥株等特性，因此流感疫苗接種成為控制季節(jié)性流感流行和流感大流行所必需的措施之一。
[0003]傳統(tǒng)的流感疫苗生產(chǎn)大多是在9至12日齡的受精雞蛋中進(jìn)行。2007年歐盟批準(zhǔn)了諾華公司在哺乳細(xì)胞中生產(chǎn)的流感疫苗上市，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中生產(chǎn)流感疫苗比在雞蛋中生產(chǎn)疫苗具有更大的擴(kuò)展性，同時(shí)可以消除在雞蛋中生產(chǎn)流感疫苗所引發(fā)過(guò)敏反應(yīng)等副作用。然而現(xiàn)階段，受到生產(chǎn)技術(shù)的限制，利用細(xì)胞來(lái)生產(chǎn)流感疫苗的產(chǎn)率較低，極大限制了流感疫苗的開(kāi)發(fā)和利用，特別影響到流感大流行期應(yīng)急疫苗的快速生產(chǎn)與接種。
[0004]流感病毒(Influenza viruses)是分八節(jié)段的單負(fù)鏈RNA病毒，編碼12個(gè)病毒蛋白，流感病毒是在細(xì)胞核中實(shí)現(xiàn)病毒基因組的轉(zhuǎn)錄(vRNA —mRNA)與復(fù)制(vRNA — cRNA — vRNA)，行使轉(zhuǎn)錄與復(fù)制的最小功能單位是病毒的核衣殼或核糖核蛋白體(ribonucleoprotein，RNP)，它是由病毒 RNA 聚合酶復(fù)合體(PBl、PB2、PA)、病毒 RNA (vRNA)及多個(gè)拷貝的核蛋白(NP)組成的。從流感病毒通過(guò)其表面糖蛋白HA與宿主細(xì)胞受體結(jié)合，經(jīng)細(xì)胞的內(nèi)吞融合作用脫去病毒的外膜，將病毒vRNPs組釋放到細(xì)胞胞漿中后開(kāi)始，vRNPs即在宿主因子(如核轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白)的協(xié)助下向核內(nèi)運(yùn)輸，在核內(nèi)又在與一系列宿主因子(P0LI1、轉(zhuǎn)錄因子、剪切因子等)的相互作用和博弈下，對(duì)病毒RNA進(jìn)行轉(zhuǎn)錄與復(fù)制及新生鏈RNA的剪切加工，然后新生的`vRNPs在其它病毒蛋白(NS2、M)和宿主因子(核輸出蛋白等)的協(xié)助下向核外運(yùn)輸，在胞漿中，病毒mRNA又在宿主因子作用下被優(yōu)先翻譯成蛋白質(zhì)，其中新合成的某些病毒蛋白，如聚合酶復(fù)合體的三個(gè)亞單位PBl、PB2、PA及NP各自需要不同宿主因子的協(xié)助轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞核中并裝配出RNA聚合酶復(fù)合體，繼續(xù)進(jìn)行病毒基因組的轉(zhuǎn)錄與復(fù)制。由此可見(jiàn)，流感病毒的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制過(guò)程是在與宿主蛋白密切地相互作用下進(jìn)行的，利用這一特性，開(kāi)發(fā)出新的技術(shù)手段來(lái)提高流感病毒疫苗毒株在細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)中的產(chǎn)量。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是利用FMRP蛋白在流感病毒轉(zhuǎn)錄復(fù)制時(shí)具有促進(jìn)RNP裝配的特性，提供一種提高流感病毒疫苗毒株產(chǎn)量的方法。
[0006]為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的一種提高流感病毒疫苗毒株產(chǎn)量的方法，其是通過(guò)在用于生產(chǎn)流感疫苗毒株的細(xì)胞中過(guò)表達(dá)FMRP蛋白或含有KH2結(jié)構(gòu)域的功能性截短體蛋白，從而提高流感病毒疫苗毒株在細(xì)胞生產(chǎn)中的產(chǎn)量。其中，所述FMRP蛋白的氨基酸序列如Seq IDN0.1所示,編碼該蛋白的核苷酸序列如Seq ID N0.2所示。KH2結(jié)構(gòu)域位于FMRP蛋白第280-422位氨基酸上，其氨基酸序列如Seq ID N0.3所示。
[0007]前述的方法中，所述用于生產(chǎn)流感疫苗毒株的細(xì)胞為Vero或MDCK細(xì)胞等。
[0008]前述的方法中，其是將攜帶有編碼FMRP蛋白的基因或編碼含有KH2結(jié)構(gòu)域的功能性截短體蛋白的基因的真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)入用于生產(chǎn)流感疫苗毒株的細(xì)胞中，隨宿主細(xì)胞的生長(zhǎng)復(fù)制過(guò)表達(dá)蛋白(可以是瞬時(shí)表達(dá)，或通過(guò)建立穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞系)，然后用流感病毒疫苗毒株感染細(xì)胞，培養(yǎng)細(xì)胞并收獲細(xì)胞上清液，從而提高其在細(xì)胞生產(chǎn)中的產(chǎn)量。
[0009]前述的方法中，所述真核表達(dá)載體的出發(fā)載體為pCMV6_entry、pcDNA3.1或通過(guò)慢病毒載體構(gòu)建穩(wěn)定細(xì)胞系，如PQCXIP。
[0010]前述的方法中，所述真核表達(dá)載體為pCMV6-entry-FMRP-myc/flag,購(gòu)自北京傲銳東源生物科技有限公司(cat.No RC222699)。
[0011 ] 通過(guò)RNAi篩選技術(shù)，發(fā)現(xiàn)FMRP蛋白是一種由FMRl基因編碼的RNA結(jié)合蛋白，定位于細(xì)胞漿和細(xì)胞核中，可以在流感病毒轉(zhuǎn)錄復(fù)制的過(guò)程中，促進(jìn)RNP的裝配。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)FMRP蛋白的KH2結(jié)構(gòu)域?qū)τ诹鞲胁《綬NP的裝配起到尤為關(guān)鍵的作用。實(shí)驗(yàn)表明，通過(guò)在用于生產(chǎn)流感疫苗毒株的細(xì)胞(如Vero、MDCK細(xì)胞)中以瞬時(shí)或穩(wěn)定表達(dá)的方式過(guò)表達(dá)FMRP蛋白可將流感病毒復(fù)制效率提高2倍以上，將收獲的病毒制備成疫苗，以滿足市場(chǎng)對(duì)流感疫苗的需求。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0012]圖1為本發(fā)明實(shí)施例中涉及的pCMV6-entry-FMRP_myc/flag質(zhì)粒圖譜。
[0013]圖2為本發(fā)明實(shí)施例中Western Blot檢測(cè)FMRP蛋白表達(dá)的結(jié)果。
[0014]圖3為本發(fā)明實(shí)施例中流感病毒疫苗毒株在Vero細(xì)胞培養(yǎng)中的產(chǎn)量。
【具體實(shí)施方式】
[0015]以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段，所用原料均為市售商品。
[0016]實(shí)施例
[0017]I質(zhì)粒來(lái)源
[0018]本實(shí)施例中使用的FMRP蛋白過(guò)表達(dá)質(zhì)粒pCMV6-entry-FMRP_myc/flag (cat.NoRC222699,質(zhì)粒圖譜見(jiàn)圖1)購(gòu)自北京傲銳東源生物科技有限公司(www.0rigene.com.cn),該質(zhì)粒將人源的FMRlcDNA克隆到真核表達(dá)載體pCMV6-entry中，酶切位點(diǎn)為sgf I和MluI。該質(zhì)粒在表達(dá)過(guò)程中會(huì)在FMRP蛋白的竣基端引入myc和flag標(biāo)簽,便于后續(xù)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)。
[0019]2細(xì)胞培養(yǎng)
[0020]本實(shí)施例中使用Veix)細(xì)胞作為生產(chǎn)流感病毒疫苗毒株的細(xì)胞。待細(xì)胞在T75培養(yǎng)瓶中長(zhǎng)成致密單層，基本上飽和后，吸除培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)舊培養(yǎng)液，用5毫升PBS洗一遍細(xì)胞，以去除殘余的血清，向瓶?jī)?nèi)加入0.25%胰蛋白酶4毫升，覆滿瓶底，于37°C、5%C02培養(yǎng)箱中放置3分鐘，當(dāng)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)回縮，細(xì)胞變圓，細(xì)胞間隙增大后，向瓶?jī)?nèi)加入含有10%胎牛血清的DMEM (完全培養(yǎng)基)，輕輕反復(fù)吹打，使細(xì)胞從瓶壁脫離形成細(xì)胞懸液。將細(xì)胞懸液移至15毫升離心管中，離心1000rpm，5分鐘。棄上清，向離心管中加入5毫升完全培養(yǎng)基，將細(xì)胞團(tuán)打散成單細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度，將細(xì)胞鋪至六孔板中，每孔6 X IO5個(gè)細(xì)胞，待轉(zhuǎn)染質(zhì)粒。剩余細(xì)胞轉(zhuǎn)移至新T75培養(yǎng)瓶中繼續(xù)37°C、5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
[0021]3細(xì)胞轉(zhuǎn)染
[0022]鋪細(xì)胞16-24小時(shí)后，轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pCMV6-entry-FMRP-myc/flag和對(duì)照空質(zhì)粒 pCMV6_entry。取 5 微升 lipo2000 (Invitrogen)混入 95 微升 opt1-MEM (LifeTechnologies),輕輕混勻室溫放置5分鐘。取3微克質(zhì)粒，混入97微升opt1-MEM，輕輕混勻，室溫放置5分鐘。將上述質(zhì)粒混合液加入到lipo2000混合液中，室溫放置20分鐘。將六孔板中的培養(yǎng)基更換為新鮮的DMEM培養(yǎng)基，將轉(zhuǎn)染混合液輕輕加入六孔板中，輕輕搖晃，于37°C、5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30小時(shí)后，感染流感病毒。
[0023]用Western Blot檢測(cè)FMRP蛋白的表達(dá)情況。細(xì)胞轉(zhuǎn)染30小時(shí)后，用細(xì)胞刮將一個(gè)孔的細(xì)胞刮下，PBS洗兩遍后，用80微升RIPA裂解液裂解細(xì)胞，冰上30分鐘，然后12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心15分鐘。取20微升細(xì)胞裂解液上清加入5微升5XSDS上樣緩沖液，95°C煮10分鐘后，冷卻至室溫，簡(jiǎn)單離心后進(jìn)行SDS-PAGE電泳。電泳結(jié)束后，以80伏的電壓，2小時(shí)將膠中蛋白樣品電轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜上。5%脫脂奶粉封閉I小時(shí)，一抗鼠源flag抗體(sigma) 1:4000稀釋孵育2小時(shí),二抗孵育I小時(shí)后顯影。Western Blot檢測(cè)結(jié)果如圖2所示。
[0024]4病毒感染
[0025]以MOI 0.001感染轉(zhuǎn)染后的Vero細(xì)胞。取流感病毒毒株A/WSN/1933，根據(jù)原始病毒毒株的滴度(3.6 X IO6個(gè)/毫升)，向Iml病毒維持液(含有0.5%胎牛血清，I微克/毫升TPCK-胰蛋白酶的DMEM)中加入每孔細(xì)胞所需的病毒量(0.33微升)。吸除Vero細(xì)胞中的培養(yǎng)基，用PBS洗兩遍。向每孔中 加入Iml含有所需病毒的病毒維持液，室溫吸附I小時(shí)。吸除含原始病毒的病毒維持液，用PBS洗兩遍,加入2毫升不含病毒的病毒維持液。分別在感染病毒后的24小時(shí)、36小時(shí)、48小時(shí)、60小時(shí)和72小時(shí)取細(xì)胞培養(yǎng)上清200微升用于蝕斑試驗(yàn)(plaque assay)方法檢測(cè)病毒滴度,并同時(shí)補(bǔ)入200微升新鮮病毒維持液。
[0026]5蝕斑試驗(yàn)
[0027]測(cè)定以上5個(gè)時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞培養(yǎng)上清中的病毒滴度。提前一天準(zhǔn)備MDCK細(xì)胞，12孔板鋪板(大約每孔2 X IO5個(gè))，細(xì)胞密度大約在70%-80%。用病毒維持液按1_10_6的濃度梯度稀釋病毒。每個(gè)稀釋度制備250微升病毒液體。稀釋過(guò)程中使用vortex旋渦混勻器保證病毒混勻。吸走M(jìn)DCK細(xì)胞的培養(yǎng)基，用PBS洗兩遍。按實(shí)驗(yàn)需要，每孔加入250微升病毒稀釋液，輕輕晃勻，室溫孵育I小時(shí)，每隔15分鐘輕輕搖晃。2%低熔點(diǎn)瓊脂糖(LMT)用微波爐融化后放入37°C水浴中保溫。用預(yù)熱的病毒維持液按1:1的體積比稀釋2%LMT，使其終濃度為1%。病毒孵育后，用PBS洗兩遍，洗去未吸附的病毒顆粒。每孔加入1.5毫升稀釋后的1%瓊脂。室溫放置30分鐘，待瓊脂完全凝固后，倒置放入孵箱培養(yǎng)。72小時(shí)后觀察結(jié)果。用4%甲醛固定，放入冰內(nèi)里有助于瓊脂凝固，然后除去瓊脂，用結(jié)晶紫染色10分鐘，自來(lái)水沖洗，觀察結(jié)果。計(jì)算各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞上清的病毒滴度。計(jì)算公式為:
[0028]
PFU (個(gè)/毫升)=X稀釋倍數(shù)


0.25? 升
[0029]如圖3所示，流感病毒在過(guò)表達(dá)FMRP蛋白的Vero細(xì)胞上清中的滴度較對(duì)照細(xì)胞(轉(zhuǎn)入空質(zhì)粒pCMV6-entry)中的病毒滴度顯著提高。通過(guò)本發(fā)明的方法可以將流感病毒疫苗毒株在細(xì)胞培養(yǎng)中的產(chǎn)量提高2倍。將收獲的病毒制備成疫苗，以滿足市場(chǎng)對(duì)流感疫苗的大量需求。
[0030]另外，本發(fā)明還驗(yàn)證了將編碼含有KH2結(jié)構(gòu)域的功能性截短體蛋白的基因轉(zhuǎn)入Vero或MDCK細(xì)胞中，也能夠達(dá)到提高流感病毒疫苗毒株產(chǎn)量的效果。
[0031]雖然，上文中已經(jīng)用一般性說(shuō)明及具體實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對(duì)之作一些修改或改進(jìn)，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn)的。因此，在不偏離本發(fā)明精 神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。
【權(quán)利要求】
1.一種提高流感病毒疫苗毒株產(chǎn)量的方法，其特征在于，通過(guò)在用于生產(chǎn)流感疫苗毒株的細(xì)胞中過(guò)表達(dá)FMRP蛋白或含有KH2結(jié)構(gòu)域的功能性截短體蛋白，從而提高流感病毒疫苗毒株在細(xì)胞生產(chǎn)中的產(chǎn)量； 其中，所述FMRP蛋白的氨基酸序列如Seq ID N0.1所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述用于生產(chǎn)流感疫苗毒株的細(xì)胞為Vero或MDCK細(xì)胞。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，其是將攜帶有編碼FMRP蛋白的基因或編碼含有KH2結(jié)構(gòu)域的功能性截短體蛋白的基因的真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)入用于生產(chǎn)流感疫苗毒株的細(xì)胞中，隨宿主細(xì)胞的生長(zhǎng)復(fù)制過(guò)表達(dá)蛋白，然后用流感病毒疫苗毒株感染細(xì)胞，提高其在細(xì)胞生產(chǎn)中的產(chǎn)量。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述真核表達(dá)載體的出發(fā)載體為pCMV6-entry、pcDNA3.1 或pQCXIP。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述真核表達(dá)載體為pCMV6-entry-FMRP-myc/flag。
【文檔編號(hào)】C12N5/10GK103627675SQ201210299497
【公開(kāi)日】2014年3月12日 申請(qǐng)日期:2012年8月21日 優(yōu)先權(quán)日:2012年8月21日
【發(fā)明者】鄧濤, 郭陽(yáng), 周卓 申請(qǐng)人:中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院病原生物學(xué)研究所