甜瓜雜交種紅優(yōu)指紋圖譜的建立的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明為一種甜瓜雜交種“紅優(yōu)”及其親本DNA指紋圖譜的建立方法和應(yīng)用。建立方法包括：1)甜瓜DNA的提取及純化；2)用獲得的高純度甜瓜DNA為模版進(jìn)行ISSR和SRAP分析；3)選擇有代表的多態(tài)性擴(kuò)增帶構(gòu)建供試材料DNA指紋圖譜；在該DNA指紋圖譜中“紅優(yōu)”甜瓜雜交種及其親本都有特異的DNA指紋，可以相互區(qū)分開(kāi)來(lái)。由于本發(fā)明DNA指紋圖譜是用圖的形式表示，看起來(lái)比較直觀、易懂；并將其轉(zhuǎn)換成數(shù)碼表示形式，便于計(jì)算機(jī)識(shí)讀和分析。本發(fā)明能從遺傳本質(zhì)上對(duì)“紅優(yōu)”甜瓜雜交種的種子進(jìn)行純度鑒定，結(jié)果準(zhǔn)確、可靠，檢測(cè)迅速。
【專利說(shuō)明】甜瓜雜交種紅優(yōu)指紋圖譜的建立
一、【技術(shù)領(lǐng)域】:
[0001]本發(fā)明涉及甜瓜種子純度鑒定技術(shù)，具體的說(shuō)是甜瓜的DNA指紋圖譜的建立方法和應(yīng)用。
二、【背景技術(shù)】:
[0002]甜瓜(Cucumis melo L.)是葫蘆科甜瓜屬中的栽培種，為重要的經(jīng)濟(jì)作物之一，雜種一代在國(guó)內(nèi)外廣泛栽培。但是在人工雜交制種過(guò)程中由于去雄不及時(shí)或不徹底，?；煊心副咀越幌捣N子，同時(shí)甜瓜品種較為繁雜，且一些品種之間植物形態(tài)非常接近，很難鑒別。傳統(tǒng)的鑒定方法是通過(guò)表型特征判斷，耗時(shí)耗力，通過(guò)同工酶和種子蛋白電泳技術(shù)進(jìn)行鑒別也受環(huán)境或發(fā)育階段等方面影響，存在較大的缺點(diǎn)，而分子標(biāo)記技術(shù)檢測(cè)的是在基因組DNA水平上的差異，不受外界環(huán)境的影響，因此結(jié)果非常穩(wěn)定。在已建立的分子標(biāo)記技術(shù)中，ISSR(簡(jiǎn)單序列重復(fù)區(qū)間)標(biāo)記是一種基于微衛(wèi)星序列發(fā)展起來(lái)的十分有效的分子標(biāo)記，具有模版需要量少、無(wú)需試劑盒、結(jié)果記錄方便、試驗(yàn)成本低、操作簡(jiǎn)單、試驗(yàn)穩(wěn)定性較高等優(yōu)點(diǎn)；SRAP (序列相關(guān)擴(kuò)增多態(tài)性)是一種新型的基于PCR的標(biāo)記系統(tǒng)，具有簡(jiǎn)便、穩(wěn)定、中等產(chǎn)率、可產(chǎn)生共顯性標(biāo)記及便于克隆測(cè)序目標(biāo)片段等特點(diǎn)，且擴(kuò)增結(jié)果的多態(tài)性豐富。
三、
【發(fā)明內(nèi)容】
:
[0003]本發(fā)明的目的是提供一種用于甜瓜種子鑒定技術(shù)的DNA指紋圖譜及其建立方法和應(yīng)用，以克服現(xiàn)有技術(shù)存在的不足。
[0004]本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思如下:
[0005]利用DNA指紋圖譜鑒定種子是以DNA的多態(tài)性為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記方法，可以彌補(bǔ)和克服在種子純度的形態(tài)學(xué)鑒定及同工酶、種子蛋白電泳鑒定的許多缺陷和難題。本發(fā)明利用ISSR和SRAP技術(shù)構(gòu)建了上海等南方地區(qū)甜瓜設(shè)施栽培品種“紅優(yōu)”與其親本的DNA指紋圖譜，可以為此品種的鑒定和純度檢測(cè)提供科學(xué)依據(jù)，進(jìn)而保護(hù)生產(chǎn)者和使用者的合法權(quán)益。
[0006]本發(fā)明的甜瓜雜交種“紅優(yōu)”及其親本的DNA指紋圖譜，是由“I”和“0”組成，ISSR引物1-19父本為110011，母本為111010，“紅優(yōu)”為1111111 ；SRAP引物Mel5-Em8父本為111011，母本為110111，“紅優(yōu)”為111111。其中所述數(shù)字“I”表示圖譜中某個(gè)位置上有擴(kuò)
增帶存在，數(shù)字“ 0 ”表示在某個(gè)位置上沒(méi)有擴(kuò)增帶存在。
[0007]所說(shuō)的“紅優(yōu)”甜瓜雜交種是上海是農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所公開(kāi)銷售的產(chǎn)品。
[0008]甜瓜DNA指紋圖譜的建立方法，包括如下步驟:
[0009]I)提取及純化甜瓜基因組的DNA ；
[0010]2)用獲得的甜瓜DNA為模版進(jìn)行ISSR和SRAP分析；
[0011]3)選擇有代表性的多態(tài)性擴(kuò)增帶，根據(jù)所選擇條帶的有、無(wú)構(gòu)建供試材料DNA指紋圖譜。
[0012]其中所述“紅優(yōu)”甜瓜雜交種及其親本都有其特異的DNA指紋，可以相互區(qū)分開(kāi)來(lái)。所述的ISSR擴(kuò)增中采用的引物1-19堿基序列為(TC)7CC;SRAP擴(kuò)增中采用的引物Mel5-Em8，其堿基序列為 5' TGAGTCCAAACCGGTAC-3'，5' GACTGCGTACGAATTCTG-3'，由上海生工生物工程有限公司合成。
[0013]本發(fā)明的DNA指紋圖譜可以應(yīng)用于“紅優(yōu)”甜瓜種子純度的鑒定。
[0014]本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn):
[0015]1.本發(fā)明創(chuàng)建了“紅優(yōu)”甜瓜雜交種及其親本的DNA指紋圖譜，公開(kāi)了用DNA指紋分析技術(shù)對(duì)甜瓜種子鑒定的研究結(jié)果，建立的方法能從遺傳本質(zhì)上對(duì)甜瓜種子進(jìn)行鑒定，因此準(zhǔn)確、可靠,具有法律效應(yīng)。
[0016]2.采用本發(fā)明，在對(duì)“紅優(yōu)”甜瓜種子樣品進(jìn)行真實(shí)檢測(cè)時(shí)，用目前廣泛應(yīng)用的快速、微量DNA提取法提取待測(cè)樣品的DNA，用提取的DNA作為模版，進(jìn)行ISSR或SRAP分析，
[0017]在幾個(gè)小時(shí)內(nèi)就可以知道該DNA指紋，因此，能迅速判斷出他的真實(shí)性。
[0018]3.由于本發(fā)明DNA指紋圖譜是用圖的形式表示，看起來(lái)比較直觀、易懂；并由于轉(zhuǎn)換成了數(shù)碼形式，便于計(jì)算機(jī)識(shí)讀和分析。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】:
[0019]圖1為本發(fā)明建立SRAP引物Mel5_Em8的指紋圖譜，圖2為本發(fā)明建立ISSR引物1-19的指紋圖譜。其中I為“紅優(yōu)”父本；2為“紅優(yōu)”母本；3為“紅優(yōu)”;M為Mark。
四、【具體實(shí)施方式】:
[0020]實(shí)施例1
[0021]1 材料
[0022]甜瓜雜交種“紅優(yōu)”及其親本由上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝所提供。
[0023]2 試劑
[0024]試驗(yàn)所用的提取DNA、PCR試劑和瓊脂糖均購(gòu)自上海生工生物工程有限公司。
[0025]3 方法
[0026]3.1DNA的提取及檢測(cè)。
[0027]DNA采用CTAB微量法提取步驟:
[0028](l)2ml離心管加入離心管蓋大小的新鮮葉片I~2片。
[0029](2)加入700ulCTAB緩沖液,用研磨機(jī)進(jìn)行研磨5min。
[0030](3)65。〇水浴111。
[0031](4)置于4°C冰箱或室溫冷卻至15°C以下。
[0032](5)加入700 ill 24: I氯仿/異戊醇，上下混勻5min，保證樣品和氯仿充分混
八
口 o
[0033](6) 13000rpm 離心 lOmin。
[0034](7)取上清液500 iil，加入預(yù)先加好500 ill異丙醇的1.5ml離心管中，輕輕上下顛倒混勻。
[0035](8)4°C冰箱靜置30min以上。
[0036](9) 13000rpm 離心 IOmin,棄上清液。
[0037](10)吹干DNA，讓異丙醇揮發(fā)干凈。[0038](11)加入 100 U I ddH20 (含 I U 110mg/ml 的 RNase)溶解 DNA。
[0039](12) 37 °C水浴或室溫I小時(shí)去除RNA。
[0040](13)配置％的瓊脂糖凝膠(稱取Ig瓊脂糖，加入100mlTBE Buffer加熱溶解后，冷卻到50~60°C )，加入一滴EB(0.g/ml)倒入膠槽中，插入梳子，待膠凝固后檢測(cè)。取5u I的DNA，加入IiU Lodading Buffer，進(jìn)行檢測(cè)，在3個(gè)點(diǎn)樣孔分別點(diǎn)入4 yl、5 yl、6u I ADNA(45ng/u I)作為對(duì)照，進(jìn)行樣品DNA濃度的檢測(cè)。一般濃度在50~IOOng之間。
[0041]附:CTAB溶液成分:
[0042]100ml IM TRIS pH7.5140ml 5M NaCl
[0043]20ml 0.5M EDTA pH8.0740ml MiliQ H2O
[0044]20g CTAB (65°C水浴溶解)(注意:切忌樣品量過(guò)多和吸取過(guò)量的上清)
[0045]3.2PCR擴(kuò)增及產(chǎn)物檢測(cè)
[0046]SRAP 擴(kuò)增反應(yīng)采用 20ii L 的反應(yīng)體系，其中 25mmol/L MgCl22.0 u L, IOXPCRBuffer 2.0ii L，10mmol/L dNTP 0.4u L,5U/u L Taq DNA 聚合酶 0.2 y L，0.liimol/L 弓丨物各3.0 ii L, IOng/ V- L模板DNA 3.0 u L,滅菌雙蒸水6.4 ii L。反應(yīng)程序:94°C預(yù)變性5min ；94°C變性 lmin, 35°C退火 lmin, 72°C延伸 1.5min, 5 個(gè)循環(huán)；94°C變性 lmin, 50°C退火 lmin,72°C延伸1.5min,35個(gè)循環(huán)；72°C延伸IOmin后4°C保存。
[0047]ISSR擴(kuò)增反應(yīng)采用20ii L的反應(yīng)體系，其中包含25mmol ? [1MgClJ yl，10XPCRBuffer2.0u I, IOmmol ? I^dNTP0.4u 1,5U ? L-1Taq E 0.2u I, IOng ? L-1 模板 DNA 3u I,
0.1iimol ? [1Primerf iil，滅菌雙蒸水9.4u 10擴(kuò)增程序:94 °C預(yù)變性5min ;94°C變性lmin, 52°C退火 lmin, 72°C延伸 1.5min, 35 個(gè)循環(huán)，72°C延伸 IOmin 后 4°C保存。
[0048]PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在2.0%瓊脂糖凝膠(含E B)電泳分離，電壓120V，時(shí)間約1.5h，GelDoctmEQ 170-8060凝膠成像儀進(jìn)行觀察并拍照分析。
[0049]4引物篩選及擴(kuò)增結(jié)果分析
[0050]用40對(duì)SRAP和40個(gè)ISSR引物對(duì)供試材料進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其中40對(duì)SRAP弓丨物和15個(gè)ISSR引物均能得到較為穩(wěn)定的擴(kuò)增圖譜，但大多數(shù)引物的擴(kuò)增結(jié)果在雙親及雜種之間是一致的，不能起到鑒別作用。最終篩選出一對(duì)SRAP特異引物Mel5-Em8(圖1)和I個(gè)ISSR引物1-19(圖2)可以把雜交種與其父母本分開(kāi)。
[0051]5數(shù)字指紋的建立
[0052]根據(jù)上述擴(kuò)增結(jié)果，以I和0分別代表某個(gè)等位基因位點(diǎn)擴(kuò)增出的DNA條帶的有無(wú)，按照從上到下即由小片段向大片段的讀帶方向，將指紋圖譜轉(zhuǎn)換為由I和0組成的字符串，即構(gòu)成數(shù)字指紋。ISSR引物1-19父本為110011，母本為111010，“紅優(yōu)”為1111111 ；SRAP引物Mel5-Em8父本為111011，母本為110111，“紅優(yōu)”為111111。其中所述數(shù)字“I”表示圖譜中某個(gè)位置上有擴(kuò)增帶存在，數(shù)字“0”表示在某個(gè)位置上沒(méi)有擴(kuò)增帶存在。
[0053]實(shí)施例2
[0054]本發(fā)明的DNA指紋圖譜用于“紅優(yōu)”雜交種純度的鑒定:從制種基地生產(chǎn)的雜交種隨機(jī)抽取100粒，進(jìn)行發(fā)芽，用微量CTAB法提取DNA，用提取的DNA作為模版，用引物1_19和Mel5-Em8分別進(jìn)行ISSR和SRAP擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物在2.5%的瓊脂糖上進(jìn)行電泳分析。如果利用ISSR引物1-19標(biāo)記分析查出的單株DNA指紋是1111111，即為“紅優(yōu)”真雜交種，DNA指紋是110011或111010，即為“紅優(yōu)”親本自交種，也就是假雜交種。如果利用SRAP弓丨物Me 15-Em8標(biāo)記分析查出的單株DNA指紋是111111，即為“紅優(yōu)”真雜交種，DNA指紋是111011或110111，即為“紅優(yōu)”親本自交種，也就是假雜交種。然后用假雜交種數(shù)除以100，即可獲得制種基地生產(chǎn)的甜瓜雜交種的純度，較大田種植調(diào)查純度既省時(shí)又便捷，可以為甜瓜雜交種子的銷售及時(shí)的提供純度信息。如果鑒定的純度低于95%，就不能夠作為商品種子進(jìn)行銷售，就可能避免假`種子事件的發(fā)生。
【權(quán)利要求】
1.甜瓜DNA指紋圖譜的建立方法，其特征在于，包括如下步驟: 1)提取及純化甜瓜基因組的DNA； 2)用獲得的甜瓜DNA為模版進(jìn)行ISSR和SRAP分析； 3)選擇有代表性的多態(tài)性擴(kuò)增帶，根據(jù)所選擇條帶的有、無(wú)構(gòu)建供試材料DNA指紋圖P曰。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，甜瓜雜交種“紅優(yōu)”及其親本都有其特異的DNA指紋，可以相互區(qū)分開(kāi)來(lái)，具體的指紋數(shù)據(jù)是由“ I ”和“0”組成，ISSR引物1-19父本為110011，母本為111010，“紅優(yōu)”為1111111 ；SRAP引物Mel5-Em8父本為111011，母本為110111，“紅優(yōu)”為111111。其中所述數(shù)字“I”表示圖譜中某個(gè)位置上有擴(kuò)增帶存在，數(shù)字“ 0 ”表示在某個(gè)位置上沒(méi)有擴(kuò)增帶存在。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述ISSR擴(kuò)增中采用的1-19堿基序列為(TC)7CC ;SRAP 擴(kuò)增中采用的引物 Mel5-Em8，其堿基序列為 5' TGAGT CCAAACCGGTAC-3'，5' GACTGCGTACG AATTCTG-3'。
4.權(quán)利要求2所述的方法所建立的DNA指紋圖譜的應(yīng)用，其特征在于，用于甜瓜雜交種“紅優(yōu)”種子純度的鑒定 。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103627780SQ201210300585
【公開(kāi)日】2014年3月12日 申請(qǐng)日期:2012年8月22日 優(yōu)先權(quán)日:2012年8月22日
【發(fā)明者】張永平, 陳幼源, 楊少軍, 陳緋翔 申請(qǐng)人:上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院, 上?？茍@種子有限公司