專利名稱：一種高活性殼聚糖酶及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，提供了一種高活性殼聚糖酶及其分離純化工藝。
背景技術(shù)：
甲殼素有“人體生命第六大要素”之 美譽(yù)，是地球上僅次于纖維素的第二大天然類高分子化合物。殼聚糖是幾丁質(zhì)脫乙酰后的產(chǎn)物，含有游離氨基，是天然多糖中唯一的堿性多糖，但由于殼聚糖水溶性差，難以發(fā)揮其應(yīng)有的生物學(xué)活性，大大限制了殼聚糖的應(yīng)用范圍。近年來發(fā)現(xiàn)殼聚糖降解產(chǎn)物殼寡糖具有獨(dú)特的生理功能，生物學(xué)活性是相等質(zhì)量殼聚糖的10倍，因此，有關(guān)殼寡糖的研究已經(jīng)受到各國(guó)政府和科研人員的高度重視。我國(guó)這方面的研究雖然起步較晚，但經(jīng)過十幾年的努力，在殼寡糖的制備和應(yīng)用領(lǐng)域取得了豐碩的成果。傳統(tǒng)化學(xué)方法生產(chǎn)殼寡糖存在環(huán)境污染等重大問題，而且反應(yīng)條件不易控制，產(chǎn)品質(zhì)量難以保證。生物酶法制備殼寡糖具有反應(yīng)條件溫和、整個(gè)降解過程中無其他反應(yīng)試劑加入、不至于發(fā)生其它副反應(yīng)、降解過程及降解產(chǎn)物相對(duì)分子質(zhì)量分布易于控制、殼寡糖得率高、不造成環(huán)境污染等優(yōu)點(diǎn)，代表了殼寡糖制備工藝的發(fā)展方向。殼聚糖酶廣泛分布于細(xì)菌、真菌、病毒以及植物等生物群中。國(guó)外對(duì)殼聚糖酶產(chǎn)生菌的許多菌株做了較多研究，報(bào)道較多的主要是酶的純化、作用機(jī)理和理化性質(zhì)方面。Isabelle Boucher等對(duì)鏈霉菌屬菌株產(chǎn)殼聚糖酶進(jìn)行了分離純化和特性研究，所得純化酶分子量為29. 5kDa，該酶最適溫度為65°C，最適pH值為5. 5,能降解脫乙酰度在44% 99%的殼聚糖,但不能降解幾丁質(zhì)和纖維素。國(guó)內(nèi)關(guān)于微生物殼聚糖酶的研究仍較少。孫金鳳等從自然界中篩選到I株芽孢桿菌產(chǎn)酶活力為O. 59U/mL，經(jīng)硫酸二乙酯(DES)誘變處理后，得到I突變菌株，產(chǎn)酶活力達(dá)到I. 60U/mL。孫玉英等報(bào)道了從土壤中分離得到的I株殼聚糖酶高產(chǎn)菌株，是目前國(guó)內(nèi)報(bào)道中產(chǎn)酶量最多的菌株，經(jīng)鑒定該酶屬微桿菌Microbacterium,酶活力達(dá)到118U/mL,培養(yǎng)基初始pH值為
6.3，培養(yǎng)溫度為30°C，培養(yǎng)時(shí)間為96h?？傊?，經(jīng)過國(guó)內(nèi)外學(xué)者不斷努力，近年來發(fā)現(xiàn)了許多產(chǎn)殼聚糖酶微生物菌株，也對(duì)一些重要的產(chǎn)殼聚糖酶菌株進(jìn)行了深入研究，但總體來說，酶活力還普遍較低，產(chǎn)酶周期長(zhǎng)，很難實(shí)現(xiàn)商品化，真正產(chǎn)酶量大、適用于工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)的菌株尚未見報(bào)道。利用生物學(xué)方法和基因工程技術(shù)，篩選出產(chǎn)酶活性高、易于培養(yǎng)的殼聚糖酶工業(yè)菌種是解決制約生物酶法制備殼寡糖的關(guān)鍵所在。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對(duì)上述技術(shù)存在的不足，提供一種高活性殼聚糖酶的分離純化工藝，所涉及的微生物菌株為一株蠟狀芽孢桿菌Bacillus cereus JBSH-003，保藏號(hào)為CGMCCNo. 6129。本發(fā)明以該菌株為出發(fā)菌株，經(jīng)液體發(fā)酵制備種子液，再經(jīng)液體發(fā)酵或固體發(fā)酵方法制備殼聚糖酶粗酶，在一定條件下分離、純化制備純度較高的高活力、食品級(jí)殼聚糖酶。該酶可應(yīng)用于水解殼聚糖制備醫(yī)藥級(jí)、食品級(jí)殼寡糖。純化的殼聚糖酶制劑酶活達(dá)25000U/g以上。該制備工藝簡(jiǎn)單、條件易控制，酶活收率高，適合工業(yè)化生產(chǎn)。
本發(fā)明提供的具體技術(shù)方案是首先獲得了一株新的菌株，該菌株分離自黃河三角洲地區(qū)的腐敗落葉和淺表層土壤中，經(jīng)UV和化學(xué)誘變劑的反復(fù)誘變處理篩選而來，為一株殼聚糖酶高產(chǎn)菌株。發(fā)明人最終確定該菌種為臘狀芽胞菌株，Bacillus cereus,并對(duì)其進(jìn)行了生物保藏,其保藏號(hào)為CGMCC No. 6129。并通過該菌株進(jìn)行發(fā)酵后獲得了殼聚糖酶。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，該菌株所產(chǎn)殼聚糖酶對(duì)酸堿度適應(yīng)范圍較廣，在pH值為4. 5-6. 5均表現(xiàn)很高的酶學(xué)活性；且該菌株所產(chǎn)酶在40°C _65°C溫度范圍內(nèi)均具有較高的生物學(xué)活性；該菌株深層液體發(fā)酵粗酶活性為227U/mL，固體發(fā)酵粗酶活性高達(dá)2732U/g，固體發(fā)酵比深層液體發(fā)酵產(chǎn)酶水平高10倍以上。在培養(yǎng)基中有無殼聚糖均對(duì)其產(chǎn)酶能力不會(huì)產(chǎn)生太大的影響，證明該菌株具有非誘導(dǎo)產(chǎn)酶活性。采用該菌株制備高活性殼聚糖酶精酶的制備方案如下·(I)菌種發(fā)酵產(chǎn)酶菌種活化后，經(jīng)液體發(fā)酵擴(kuò)繁種子液，再利用發(fā)酵方法生產(chǎn)得到殼聚糖酶粗酶液；其中所述的發(fā)酵方法為液體發(fā)酵或固體發(fā)酵；所述的粗酶液為液體發(fā)酵的發(fā)酵液，或固體發(fā)酵后的鮮料或干燥粉碎后的干料，用緩沖液抽提出的酶液；(2)殼聚糖酶純化步驟(I)獲得的粗酶液，經(jīng)離心除雜、微濾除菌、超濾膜超濾濃縮得酶濃縮液，將所得到的濃縮液用乙醇醇沉，收集沉淀，得濕固酶；(3)干燥對(duì)濕固酶進(jìn)行低溫真空干燥，即得高活性殼聚糖精酶；具體的方法如下I.菌種發(fā)酵產(chǎn)酶(I)菌種活化將低溫保存的CGMCC No. 6129試管斜面菌種轉(zhuǎn)移到室溫條件下，對(duì)菌種活化4-8h ；(2)液體菌種擴(kuò)繁取活化的試管菌種，在無菌操作臺(tái)上，用IOmL滅菌蒸餾水將試管斜面表面的菌落沖洗入裝有滅菌培養(yǎng)基的三角瓶中，每只試管接種I個(gè)三角瓶；33 35°C下振蕩培養(yǎng)12-18h，轉(zhuǎn)速50-300r/min得到液體菌種即種子液；(3)固體發(fā)酵產(chǎn)酶將步驟(2)制備的液體菌種，按O. 5-10% (v/w)的接種量接入固體發(fā)酵的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度為25 39°C，發(fā)酵時(shí)間40 100h，中間每隔15小時(shí)翻曲一次；固體發(fā)酵培養(yǎng)基原料為廉價(jià)易得的農(nóng)作物副產(chǎn)品，具體按重量份計(jì)為65 80份麩皮，10 20份豆柏，8 15份玉米粉，I 3份硫酸銨，固體物料與水的重量比為I: I. 05 1.5 ;初始pH值自然；(4)干燥粉碎固體發(fā)酵培養(yǎng)結(jié)束后，對(duì)發(fā)酵濕固料進(jìn)行低溫真空干燥，溫度不高于50°C，粉碎過80目篩后，得到高活性固體殼聚糖酶粗酶產(chǎn)品。2.殼聚糖酶粗酶液的制取制取殼聚糖酶粗酶液的原料為干燥粉碎后的固體殼聚糖酶產(chǎn)品或直接用固體發(fā)酵完成后不經(jīng)干燥的鮮料，用pH=4. O的含10-30%(w/w)硫酸銨酸性緩沖液或NaAC-HAC緩沖液或磷酸鹽緩沖液在常溫下進(jìn)行提取，料液比1:10-40( 八)(折合成干品計(jì))，時(shí)間lh-3h，過濾、離心或壓濾去除固體殘?jiān)?，收集濾液，即為殼聚糖酶的粗酶液。殼聚糖酶的粗酶液生產(chǎn)還可用菌株直接采用液體三級(jí)發(fā)酵的方式獲得。首先采用液體發(fā)酵的方法對(duì)活化的CGMCC No. 6129試管斜面菌種進(jìn)行擴(kuò)繁，并以此為菌種再進(jìn)行二級(jí)、三級(jí)液體發(fā)酵，逐級(jí)放大，放大比例為1:10 ;對(duì)三級(jí)發(fā)酵罐中的發(fā)酵液經(jīng)高速離心去除固體殘?jiān)蠹礊闅ぞ厶敲傅拇置敢骸＝?jīng)檢測(cè)菌株CGMCC No. 6129深層液體發(fā)酵粗酶活性為227U/mL，所述三級(jí)發(fā)酵的方式均采用現(xiàn)有的技術(shù)完成。3.殼聚糖酶的純化(I)對(duì)液體發(fā)酵獲得的發(fā)酵液或固體發(fā)酵提取獲得的殼聚糖酶粗酶液經(jīng)離心除雜，再進(jìn)行微濾，進(jìn)一步去除菌體和微小顆粒雜質(zhì)，微濾液再經(jīng)6000Dalton的超濾膜組件超濾濃縮，濃縮倍率為1/5-1/10，收集超濾內(nèi)液；(2)用95%的乙醇常溫下進(jìn)行醇沉，乙醇和超濾內(nèi)液的體積比為2-3:1，過濾、離心或壓濾，收集沉淀。 4.干燥經(jīng)步驟3沉淀析出的濕固酶在50°C條件下真空干燥，即為純度較高的精酶。提取過程中，利用乙酰丙酮法對(duì)每個(gè)步驟所得產(chǎn)物進(jìn)行酶活測(cè)定，以固體殼聚糖酶粗酶的總活力為100%計(jì)算，每步操作完成后分別取樣檢測(cè)酶活，計(jì)算出每步操作后酶活力的回收率。結(jié)果顯示整個(gè)工藝過程酶活的綜合回收率為35%以上，所制得的精酶活性可以達(dá)到25000U/g以上。本發(fā)明采用了自主篩選的高活性殼聚糖酶生產(chǎn)菌株，所制備的殼聚糖酶酶活可達(dá)2732U/g。該酶溫度和酸堿度適應(yīng)范圍廣，在40-65°C范圍內(nèi)均具有較高的生物學(xué)活性，在pH值4. 5-6. 5之間均有很強(qiáng)的酶學(xué)活性。而且針對(duì)該菌株的特性設(shè)計(jì)酶提取工藝，該工藝既不需要復(fù)雜的設(shè)備，也不需要特定的操作環(huán)境，大部分生化企業(yè)均可以生產(chǎn)。本發(fā)明中采用95%的乙醇常溫條件下進(jìn)行醇沉，不需要對(duì)乙醇進(jìn)行預(yù)冷處理和添加保護(hù)劑，節(jié)約了制冷操作費(fèi)用和操作時(shí)間，且酶活收率沒有因此受到顯著的影響。一般酶制劑提純過程中需要控制嚴(yán)格的低溫環(huán)境、所用有機(jī)溶劑和待提取的粗酶液均需要進(jìn)行低溫處理。本發(fā)明的制備工藝可大幅度降低處理成本。綜上所述，本發(fā)明提供了一種溫度和酸堿度適應(yīng)范圍廣，在40°C -65°C范圍內(nèi)均具有較高的生物學(xué)活性，在pH值4. 5-6. 5之間均有很強(qiáng)的酶學(xué)活性的殼聚糖酶，其生產(chǎn)工藝既不需要復(fù)雜的設(shè)備，也不需要特定的操作環(huán)境，大部分生化企業(yè)均可以生產(chǎn)，可以廣泛的推廣。保藏信息保藏時(shí)間2012年5月22日保藏單位名稱中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏編號(hào)CGMCCNo. 6129保藏單位地址北京市朝陽區(qū)北辰西路I號(hào)院中科院微生物研究所分類命名臘狀芽孢桿菌Bacillus cereus
具體實(shí)施例方式以下通過實(shí)施例形式的具體實(shí)施方式
，對(duì)本發(fā)明的上述內(nèi)容做進(jìn)一步的詳細(xì)說明，但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實(shí)例。凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容所實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例I酶活性檢測(cè)DNS法。殼聚糖酶配制取制備的殼聚糖精酶lg，溶解到80ml蒸餾水中，定容到100ml，得到殼聚糖酶溶液。準(zhǔn)確稱取O. Ig殼聚糖粉末于試管中，加IOmLO. 2M的乙酸溶液，制成1%的殼聚糖溶液，震蕩lOmin，于50°C水浴中保溫lOmin。準(zhǔn)確量取上述配制的殼聚糖酶溶液lmL，加入殼聚糖溶液的試管中，50°C下保溫30min，用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值到8，離心去除沉淀。吸取上清液lmL，加入9mL 2M/mL的鹽酸，100°C水解2h，DNS法測(cè)定其還原糖含量，計(jì)算得到酶活。以每分鐘內(nèi)產(chǎn)生I μ mol還原糖所需要的酶量為一個(gè)酶活單位U。實(shí)施例2固體發(fā)酵
固體發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基組成及培養(yǎng)條件的確定采用單因子試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，通過改變溫度、初始pH值、接種量、裝料量和培養(yǎng)時(shí)間，確定了液體種子最佳培養(yǎng)條件和固體發(fā)酵最佳產(chǎn)酶條件；采用單因子試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，通過改變培養(yǎng)的碳氮源和無機(jī)鹽組成確定該菌株液體種子最佳培養(yǎng)基組成和固體發(fā)酵的最佳產(chǎn)酶培養(yǎng)基組成。通過上述試驗(yàn)方法確定的固體發(fā)酵培養(yǎng)基組成和產(chǎn)酶條件固體培養(yǎng)基組成成分，按重量份計(jì)為65 80份麩皮，10 20份豆柏，8 15份玉米粉，I 3份硫酸銨，固體物料與水的重量比為I: I. 05 I. 5 ;固體發(fā)酵條件接種量為5% (v/m), pH值自然，培養(yǎng)溫度為33 35°C，發(fā)酵時(shí)間40 50h,中間每隔15h翻曲一次。具體的固體發(fā)酵方法如下菌種活化將4°C條件下保存在營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上的CGMCC No. 6129試管斜面菌種移至室溫條件下(20-25 °C )活化4-8h ；液體種子制備在無菌操作臺(tái)上，用IOmL滅菌后的蒸餾水將經(jīng)過活化的CGMCCNo. 6129試管斜面菌種制成菌體懸浮液，沖洗入裝有滅菌液體培養(yǎng)基的三角瓶中，I只試管菌種接種I個(gè)三角瓶，培養(yǎng)溫度33 35°C，搖床轉(zhuǎn)速150r/min，培養(yǎng)時(shí)間為12 18h，得到種子液；其中種子培養(yǎng)基組成按重量份計(jì)為1 3份牛肉膏，O. 5 I份酵母粉，I 2份葡萄糖，O. 5-1份硫酸銨，3 5份豆柏，2 3份玉米粉，85-92份軟化水；將上述獲得的種子液，也就是液體菌株，按照確定的固體發(fā)酵條件進(jìn)行固體發(fā)酵，固體發(fā)酵結(jié)束以后，將殼聚糖酶鮮料于50°C條件下真空干燥，粉碎并過80目篩，得到高活性固體殼聚糖酶粗酶產(chǎn)品。實(shí)施例3液體發(fā)酵液體發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基組成及培養(yǎng)條件的確定采用單因子試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，通過改變溫度、初始pH值、接種量、裝料量和培養(yǎng)時(shí)間，確定了液體種子最佳培養(yǎng)條件和固體發(fā)酵最佳產(chǎn)酶條件；采用單因子試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，通過改變培養(yǎng)的碳氮源和無機(jī)鹽組成確定該菌株液體種子最佳培養(yǎng)基組成和固體發(fā)酵的最佳產(chǎn)酶培養(yǎng)基組成。通過上述試驗(yàn)方法確定的種子液培養(yǎng)基組成及發(fā)酵條件位
菌種活化將4°C條件下保存在營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上的CGMCC No. 6129試管斜面菌種移至室溫條件下(20-25 °C )活化4-8h ；液體種子制備在無菌操作臺(tái)上，用IOmL滅菌后的蒸餾水將經(jīng)過活化的CGMCCNo. 6129試管斜面菌種制成菌體懸浮液，沖洗入裝有滅菌液體培養(yǎng)基的三角瓶中，I只試管菌種接種I個(gè)三角瓶，培養(yǎng)溫度33 35°C，搖床轉(zhuǎn)速150r/min，培養(yǎng)時(shí)間為12 18h，得到種子液；其中培養(yǎng)基組成按重量份計(jì)為1 3份牛肉膏，O. 5 I份酵母粉，I 2份葡萄糖，O. 5-1份硫酸銨，3 5份豆柏，2 3份玉米粉，85-92份軟化水；。將上述獲得的種子液，也就是液體菌株，按照下列的參數(shù)進(jìn)行液體三級(jí)發(fā)酵，發(fā)酵過程中進(jìn)行二級(jí)、三級(jí)液體發(fā)酵時(shí)，逐級(jí)放大，放大比例為1:10 ;其他均采用現(xiàn)有技術(shù)進(jìn)行發(fā)酵；
發(fā)酵培養(yǎng)基組成按重量份計(jì)為1 2份葡萄糖，O. 5 I份酵母粉，3 5份豆柏，2 3份玉米粉，O. 5-1份硫酸銨，O. 1-0. 5份硫酸鎂，O. 1-0. 5份磷酸二氫鉀；85_90份的軟化水，pH值自然。發(fā)酵條件接種量為5% (v/w)，培養(yǎng)溫度為33°C 35°C，發(fā)酵時(shí)間40h 50h。所得的發(fā)酵液即含有殼聚糖粗酶，酶活一般在250_500U/ml。實(shí)施例4殼聚糖酶的提取分離與純化(I)緩沖液浸提將固體酶干粉，加入裝有pH值為4. O 4. 5的硫酸銨緩沖液的容器中，料液比為1:10-20 (w/v)，(以干物質(zhì)計(jì))40 50°C水浴保溫，開動(dòng)攪拌器，15-90r/min攪拌3h ；(2)過濾、離心除雜用布氏漏斗對(duì)上述緩沖液-酶混合液進(jìn)行過濾，除去大部分固體顆粒，所得濾液經(jīng)高速離心進(jìn)一步除去大分子固體雜質(zhì)和部分菌體，離心轉(zhuǎn)速為6000r/min,時(shí)間為 IOmin0(3)微濾除菌體用孔徑為O. 2μπι的中空纖維濾膜，于室溫下對(duì)步驟(2)所得離心上清液進(jìn)行微濾，微濾操作壓力控制在O. 12Mpa以下。經(jīng)過此步處理可以進(jìn)一步除去菌體和大分子顆粒物質(zhì)。(4)超濾濃縮將步驟(3)所得微濾液進(jìn)行超濾濃縮，濃縮介質(zhì)為中空纖維，截留分子量為6000Da以下，超濾操作壓控制在O. 12Mpa以下，收集超濾內(nèi)液，濃縮比例為10 25倍(濃縮前體積濃縮后體積)。(5)醇沉將95%的乙醇緩慢加入超濾內(nèi)液，并不斷攪拌，乙醇與濃縮液的體積比為I :2.5 3.5，隨著乙醇的不斷加入，溶液開始出現(xiàn)乳白色混濁并進(jìn)一步絮凝沉淀，醇沉后4000r/min離心5min,收集沉淀。(6)沉淀于50°C條件下真空干燥或冷凍干燥即為最終產(chǎn)物殼聚糖酶制劑產(chǎn)品，經(jīng)檢測(cè)，其酶活達(dá)到27650U/g。此提純工藝經(jīng)三次重復(fù)，各步驟的酶活收率結(jié)果見表I。經(jīng)各步驟對(duì)殼聚糖酶精制后，酶活總收率平均為36. 1%。表I殼聚糖酶提取純化各步驟的酶活收率
權(quán)利要求
1.一種高活性殼聚糖酶，其特征在于是由保藏號(hào)為CGMCC No. 6129的菌株發(fā)酵獲得的。
2.一種高活性殼聚糖酶的制備方法，其特征在于包括如下步驟 (O菌種發(fā)酵產(chǎn)酶菌種活化后，經(jīng)液體發(fā)酵擴(kuò)繁種子液，再利用發(fā)酵方法生產(chǎn)得到殼聚糖酶粗酶液； 其中所述的發(fā)酵方法為液體發(fā)酵或固體發(fā)酵； 所述的粗酶液為液體發(fā)酵的發(fā)酵液，或固體發(fā)酵后的鮮料或干燥粉碎后的干料，用緩沖液抽提出的酶液； (2)殼聚糖酶純化步驟(I)獲得的粗酶液，經(jīng)離心除雜、微濾除菌、超濾膜超濾濃縮得酶濃縮液，將所得到的濃縮液用乙醇醇沉，收集沉淀，得濕固酶； (3)干燥對(duì)濕固酶進(jìn)行低溫真空干燥，即得高活性殼聚糖精酶； 其中所采用的菌種為蠟狀芽胞菌株，Bacillus cereus,其保藏號(hào)為CGMCC No. 6129 ； 所述步驟(I)中的緩沖液為乙酸-乙酸鈉緩沖液或磷酸鹽緩沖液或酸性硫酸銨緩沖液。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述制備方法，其特征在于所述步驟(2)中的醇沉過程所使用的醇的溫度為室溫。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述制備方法，其特征在于所述步驟(2)中的醇沉過程所使用的醇為95wt%的乙醇。
5.如權(quán)利要求I所述的殼聚糖酶，其特征在于其酶活達(dá)到25000U/g，酶活收率35%以上。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，提供了一種高活性殼聚糖酶的分離純化工藝，所涉及的微生物菌株為一株蠟狀芽孢桿菌Bacillus cereus JBSH-003,保藏號(hào)為CGMCC No.6129。本發(fā)明以該菌株為出發(fā)菌株，經(jīng)液體或固體發(fā)酵制備殼聚糖酶粗酶，在一定條件下分離、純化制備高純度、高活力的食品級(jí)殼聚糖酶。該酶可應(yīng)用于水解殼聚糖制備醫(yī)藥級(jí)、食品級(jí)殼寡糖。純化的殼聚糖酶制劑酶活達(dá)25000U/g以上。該制備工藝簡(jiǎn)單、條件易控制，酶活收率高，適合工業(yè)化生產(chǎn)。
文檔編號(hào)C12N9/42GK102816751SQ20121030087
公開日2012年12月12日 申請(qǐng)日期2012年8月22日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月22日
發(fā)明者徐澤平, 馬韻升, 史慶苓, 張心青, 王秀芝, 虞鳳慧, 高洪奎 申請(qǐng)人:黃河三角洲京博化工研究院有限公司, 山東京博控股股份有限公司