專利名稱：控制大白菜生長(zhǎng)的BrTCP24基因及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種控制大白菜生長(zhǎng)的BrTCP24基因及其應(yīng)用，特別是ー種負(fù)調(diào)控大白菜生長(zhǎng)的BrTCP24基因及其應(yīng)用，屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
大白菜(Brassica rapa L. ssp. pekinensis)起源于中國(guó)，是我國(guó)乃至世界性的重要蔬菜作物之一。葉球是大白菜食用的最主要器官，其大小是目前開展大白菜育種工作所要考慮的ー個(gè)重要經(jīng)濟(jì)性狀。多年的生產(chǎn)實(shí)踐表明，大白菜葉球的大小受嚴(yán)格的遺傳控制，受相關(guān)基因表達(dá)調(diào)控的影響。開展大白菜葉球大小相關(guān)基因的研究對(duì)于遺傳上控制葉球的大小，提高作物產(chǎn)量和品質(zhì)有重要的理論意義和實(shí)用價(jià)值。不同物種間，植物器官的大小有著顯著的差異，但在物種內(nèi)個(gè)體之間器官的大小相對(duì)一致，說(shuō)明植物器官的大小受到嚴(yán)格的遺傳控制。已有的研究表明，在植物體中存在多個(gè)控制器官大小的基因，例如 ANT、AtGRFl-AtGRF5、ARGOS、BrARGOS、AtGIFl、STNl、AtMRBl、ANGUSTIFOLIA、AtEXPIO、ARL、R0T3、R0N2/LUG以及BPE基因等。它們可通過(guò)協(xié)調(diào)細(xì)胞分裂和生長(zhǎng)來(lái)決定器官大小。例如，過(guò)量表達(dá)AtGRFl和AtGRF2的擬南芥產(chǎn)生較大的葉片和子葉。相反，argrfl-atgrf2-atgrf3三突變體產(chǎn)生較小的葉片和子葉,這些表型變化是由于細(xì)胞體積的增加或減小所致，這表明AtGRF蛋白調(diào)節(jié)葉片和子葉組織細(xì)胞的延伸。由于在葉寬軸方向上的細(xì)胞數(shù)目減少，GIFl功能缺失突變體產(chǎn)生了較窄的葉片和花瓣，說(shuō)明GIFl基因控制葉片和花瓣的生長(zhǎng)和形狀。 擬南芥AINTEGUMENTA (ANT)基因功能缺失突變體減小了葉、花的大小和數(shù)目，而ANT基因的異位表達(dá)增大了營(yíng)養(yǎng)器官(如葉和莖)和花器官。ANT基因主要通過(guò)影響總細(xì)胞數(shù)目和細(xì)胞分裂程度來(lái)改變成熟器官的大小。該基因并不控制細(xì)胞生長(zhǎng)速率和細(xì)胞周期，而是在器官形成過(guò)程中調(diào)節(jié)器官生長(zhǎng)和細(xì)胞分裂。這些結(jié)果表明ANT基因很可能維持與生長(zhǎng)相協(xié)調(diào)的持續(xù)的細(xì)胞分裂。ANT基因功能缺失致使細(xì)胞有絲分裂減少，細(xì)胞生長(zhǎng)提前終止，從而使器官減小。相反，ANT基因過(guò)量表達(dá)的植株能使自身細(xì)胞比正常細(xì)胞生長(zhǎng)和分裂時(shí)間更長(zhǎng)，因而使器官増大。ANT基因的功能并不僅限于擬南芥，35S: =ANT的表達(dá)也使轉(zhuǎn)基因煙草植株増大。ANT基因編碼ー個(gè)具有AP2-domain的轉(zhuǎn)錄因子，它的同源基因已經(jīng)從其它植物中分離出來(lái)。油菜BANT基因在擬南芥中異位表達(dá)也使擬南芥器官増大，這進(jìn)一歩支持了不同植物中ANT基因在控制器官大小方面具有保守的功能。ARGOS基因在ANT基因的上游起作用并影響器官細(xì)胞的分裂能力。表達(dá)正義或反義ARGOS基因的植株器官分別增大或減小，這是因?yàn)榧?xì)胞數(shù)目和器官生長(zhǎng)持續(xù)時(shí)間的變化而改變了器官大小。擬南芥ARG0S-LIKE基因過(guò)量表達(dá)可使植株器官増大，増大的原因不是細(xì)胞數(shù)目的増加，而是細(xì)胞體積的増大，這說(shuō)明同源基因在控制器官大小方面承擔(dān)的功能有所不同。TCP家族轉(zhuǎn)錄因子是植物所特有的。TCP domain基因是ー類關(guān)鍵的發(fā)育調(diào)控基因，在不同物種中的不同成員分別參與了不同的形態(tài)發(fā)育過(guò)程。在TCP基因家族中，第一個(gè)被分離和鑒定的成員是金魚草的Cycloidea (Cyc)基因，Cyc和另外ー個(gè)TCP基因家族成員Dichotoma (Dich)共同控制了金魚草花的不對(duì)稱性發(fā)育。當(dāng)Cyc和Dich雙突變時(shí)，金魚草的花由兩側(cè)對(duì)稱花轉(zhuǎn)變成了福射對(duì)稱花(peloric flower)。在玉米中，TCP基因家族的成員Teosinte Branched I (Tbl)控制了玉米的分蘗,Tbl基因的突變導(dǎo)致正常野生型玉米的頂端優(yōu)勢(shì)喪失，側(cè)芽的生長(zhǎng)發(fā)育不受抑制，能夠發(fā)育成為側(cè)枝，其表型與玉米的祖先墨西哥類黍(teosinte)極其相似，另外，水稻中的Cyc/Tbl同源基因PCF I和PCF 2也已經(jīng)被克隆，基因序列比較表明，TbU Cyc, PCFl和PCF2的序列中均含有ー個(gè)非常保守的結(jié)構(gòu)域，這個(gè)結(jié)構(gòu)域可以形成不典型螺旋-環(huán)-螺旋(basic-Helix-Loop-Helix)的結(jié)構(gòu),而且是由60個(gè)左右的氨基酸殘基組成。取Tbl、Cyc和PCF的第一個(gè)字母，將這段保守的序列稱為TCPdomain,凡是有這個(gè)保守結(jié)構(gòu)域的基因都被稱為TCP domain基因。根據(jù)TCP domain的序列特點(diǎn)，可將TCP基因家族分為2個(gè)亞類一類是以PCF為代表，另ー類則是以Cyc和Tbl為代表。它們之間在生物學(xué)功能上表現(xiàn)出一定的差異。例如屬于第一類的TCP20基因可正調(diào)控細(xì)胞的生長(zhǎng)，而屬于第二類的CIN、TCP2以及TCP4等基因則具有相反的功能，負(fù)調(diào)控細(xì)胞的生長(zhǎng)。
因此，如果能夠找到控制大白菜細(xì)胞生長(zhǎng)，并進(jìn)而控制器官大小的基因并加以利用，將對(duì)大白菜品質(zhì)的改良起到非常關(guān)鍵的作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種控制大白菜生長(zhǎng)的BrTCP24基因及其應(yīng)用。一種控制大白菜生長(zhǎng)的BrTCP24基因，其核苷酸序列如SEQ ID No. I所示。上述BrTCP24基因全長(zhǎng)1221bp，編碼406個(gè)氨基酸，在進(jìn)化上，與BrTCP24基因具有較近親緣關(guān)系的為擬南芥AtTCP4基因；二者的核苷酸序列一致性僅為77. 15%，氨基酸序列一致性僅為77. 57%，種間差異較大。ー種由上述BrTCP24基因編碼的多肽，其氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示。一種插入上述SEQ ID No. I所示核苷酸序列的重組載體。上述BrTCP24基因、重組載體在經(jīng)濟(jì)作物生產(chǎn)改良中的應(yīng)用。有益效果本發(fā)明從大白菜中克隆了 BrTCP24基因，并驗(yàn)證了該基因具有負(fù)調(diào)控植物細(xì)胞生長(zhǎng)的功能，經(jīng)試驗(yàn)，通過(guò)過(guò)量表達(dá)該基因，可以獲得比野生型植株體型小的轉(zhuǎn)基因植株。本發(fā)明的基因可為培育農(nóng)作物新品種提供理論依據(jù)和基因來(lái)源。


圖I為蛭石上生長(zhǎng)30天的野生型和轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的對(duì)比照片A為野生型植株，B為BrTCP24過(guò)量表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植株。圖2為1/2MS培養(yǎng)基上生長(zhǎng)20天的野生型和轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的對(duì)比照片A為野生型植株，B為BrTCP24過(guò)量表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植株。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合實(shí)施例及說(shuō)明書附圖對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)ー步說(shuō)明，但本發(fā)明所保護(hù)范圍不限于此。實(shí)施例大白菜mRNA的提取以大白菜品種福山包頭10天苗齡幼苗的地上部分為材料，置于液氮預(yù)冷的研缽中，加入液氮快速磨成粉末，將IOOmg粉末裝入I. 5ml離心管中,加入Iml Trizol (購(gòu)自Invitrogen公司)顛倒混勻，室溫靜置10分鐘。在4°C, 12000rpm離心10分鐘,取上清液移至新的I. 5ml離心管中。加入200 Ul氯仿，用手劇烈搖晃15秒鐘，室溫靜置2_3分鐘。4°C，12000rpm離心10分鐘。取無(wú)色上層水相至一新的離心管中，加入600 iil-20°C冰箱預(yù)冷異丙醇，顛倒混勻，室溫靜置10分鐘。4°C，12000rpm離心10分鐘，除上清液。加入Iml75% (v/v)こ醇，渦旋震蕩。4°C，7500rpm離心3分鐘。室溫干燥3-5分鐘，加入30 yl的無(wú)RNase的水溶解沉淀，然后置于55°C水浴中溶解10分鐘，迅速冰浴5分鐘后瞬時(shí)離心，制 得 mRNA。BrTCP24基因的獲得利用RT-PCR方法擴(kuò)增BrTCP24基因的編碼序列。具體操作方法如下將制得的mRNA反轉(zhuǎn)錄成第一鏈cDNA，所用反轉(zhuǎn)錄酶為Takara公司生產(chǎn)的M-MLVreverse transcriptase,反應(yīng)體系為 20 U I。依次加入 I U I oligo dT>2 u g RNA 和無(wú)RNase水至13. 5 yl，在70°C水浴中變性5分鐘，迅速冰浴5分鐘，瞬時(shí)離心，然后依次加入
Iu I IOmMdNTP, 4 u I 5 X RT 緩沖液，0. 5 y I RNase inhibitor 和 I y I 反轉(zhuǎn)錄酶?；旌暇鶆?，42°C反應(yīng)60分鐘，70°C水浴10分鐘使酶失活，制得第一鏈cDNA。以第一鏈cDNA為模板擴(kuò)增目的基因，所用引物為BrTCP24-F:5’-GTTCTAGAATGGCAGACGAAGCTCACAACTTTC-3’ (SEQ ID NO. 3)BrTCP24-R:5’-GGACTAGTTTAACGATGGCGAGAAATGGAGGAA-3’ (SEQ ID NO. 4)PCR 反應(yīng)體系為 25 u 1，依次加入 10XPCR 緩沖液 2. 5u l,2u I 2. 5mM dNTP, 2 u I第一鏈 cDNA，正向引物 0.5 ill (10mM)，反向引物 0. 5iil (10mM),5U/u I Taq DNA 聚合酶
0.25 u I,最后加水至25 u I0PCR反應(yīng)條件預(yù)變性94°C 3分鐘；變性94°C 30秒，退火58°C 30秒，延伸72°C 2分鐘，30個(gè)循環(huán)；最后延伸10分鐘，4°C保存。將上述PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，加入pUC18 DNA vector中pUC18 DNAvector由Takara公司產(chǎn)售，經(jīng)連接反應(yīng)，然后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 a感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)，取陽(yáng)性菌株，制得連接好的載體；上述連接體系10 iil，各組分為 IiU pUC18 DNA vector，2 PCR 產(chǎn)物，IylT4DNA連接酶，Iiil 10X反應(yīng)緩沖液，加水補(bǔ)至IOiU ;上述連接條件為16°C水浴中反應(yīng)12-16小時(shí)。將連接好的載體進(jìn)行測(cè)序，確認(rèn)正確無(wú)誤，經(jīng)檢測(cè)，BrTCP24基因的核苷酸序列如SEQID NO. I所示，全長(zhǎng)1221bp，預(yù)測(cè)編碼406個(gè)氨基酸。在進(jìn)化上，BrTCP24基因與擬南芥AtTCP4基因具有較近的親緣關(guān)系；二者的核苷酸序列一致性為77. 15%，氨基酸序列一致性為 77. 57%。轉(zhuǎn)基因植株的獲得
將上述連接好的載體用Takara公司生產(chǎn)的XbaI和Spel內(nèi)切酶酶切，操作如下反應(yīng)體系50 iil，包括7. 5 ill 10 X T緩沖液，20 ill連接好的載體，2 ill BamHI內(nèi)切酶，2iil Sail內(nèi)切酶和18. 5iil水；反應(yīng)條件為在37°C水浴4個(gè)小時(shí)；將酶切后的BrTCP24基因經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，用杭州博日科技有限公司產(chǎn)售的Biospin Gel Extraction Kit回收基因片段,操作如下用干凈、鋒利的手術(shù)刀,將含有BrTCP24基因的瓊脂糖凝膠切下，并放入I. 5ml離心管中。按1:3的比例加入Extractionbuffero于50°C恒溫水浴中直到凝膠融化。將混合液全部轉(zhuǎn)入Spin column內(nèi)，于6000rpm離心I分鐘，棄去接液管內(nèi)液體。向Spin column中加入500 u I Extraction buffer,于12000rpm離心I分鐘,棄去接液管內(nèi)液體。向Spin column中加入750 u I Wash Buffer,于12000rpm離心I分鐘，棄去接液管內(nèi)液體。再次于12000rpm離心I分鐘,然后將Spincolumn轉(zhuǎn)移至無(wú)菌的I. 5ml離心管內(nèi)。向Spin column中加入50 u I Elution Buffer,并于室溫放置I分鐘。12000rpm離心I分鐘，收集含有BrTCP24基因的溶液。上述詳細(xì)操作可參見Biospin Gel Extraction Kit的產(chǎn)品使用說(shuō)明書。將上述含有BrTCP24基因的溶液中的BrTCP24基因連接入植物表達(dá)載體 PCAMBIA2300-35S-0CS (購(gòu)自 Biovector 公司)中，操作如下反應(yīng)體系10 U 1，包括 I ii I pCAMBIA2300-35S-0CS, 5 U I 含有 BrTCP24 基因的溶液，liU10XT4連接酶緩沖液和Iiil T4連接酶，加水至IOiU ;反應(yīng)條件為在16°C下連接12-16小時(shí)；經(jīng)上述反應(yīng)，制得質(zhì)粒DNA，然后將質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 a感受態(tài)細(xì)胞，提取質(zhì)粒進(jìn)行鑒定，制得構(gòu)建好的質(zhì)粒DNA。將構(gòu)建好的質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌LBA4404 (購(gòu)自Biovector公司)中，操作如下取IOOiil農(nóng)桿菌LBA4404細(xì)胞溶液經(jīng)電擊制備農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞，加入3 y I構(gòu)建好的質(zhì)粒DNA，冰浴5分鐘，液氮冷凍I分鐘，37°C水浴5分鐘，然后加入Iml LB培養(yǎng)基(I-LB培養(yǎng)基含5g酵母提取物，IOg胰蛋白胨，IOg氯化鈉)，28 0C，200rpm振蕩3小吋。IOOOOrpm離心I分鐘，棄上清，加入100 u I LB培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，涂布于含有50mg/L卡那霉素、50mg/L利福平的LB平板培養(yǎng)基上(I-LB平板培養(yǎng)基含5g酵母提取物，IOg胰蛋白胨，IOg氯化鈉，15g瓊脂)，28°C培養(yǎng)2-3天，選取經(jīng)轉(zhuǎn)化后的農(nóng)桿菌LBA4404 ；通過(guò)浸花法將上述經(jīng)轉(zhuǎn)化后的農(nóng)桿菌LBA4404轉(zhuǎn)化擬南芥(Columbia ecotype),操作如下將經(jīng)轉(zhuǎn)化后的農(nóng)桿菌LBA4404接種于5ml LB培養(yǎng)基中，28°C，200rpm振蕩過(guò)夜，按2wt%的接種量接種于200ml新鮮LB培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)至OD6tltl為I. 0,4500rpm離心5分鐘收集菌體，重懸于侵染液中，將擬南芥的花序浸入侵染液中30秒,把花盆側(cè)放于托盤中，蒙上地膜避光24小時(shí)，第二天取下地膜，將花盆直立；上述侵染液含有5wt%鹿糖,0. 03wt%Tween (吐溫)-20。制備1/2MS篩選平板(1/2MS培養(yǎng)基加50mg/L卡那霉素，100mg/L羧芐青霉素)，T1代種子用70% (v/v)こ醇消毒5分鐘，2wt%次氯酸鈉消毒10分鐘后播種于1/2MS篩選平板，每板播種IOOy g的擬南芥種子。4°C春化3天后放于培養(yǎng)箱(22°C，16小時(shí)光照/8小時(shí)黑暗)中。6天后選出綠色的生長(zhǎng)正常的陽(yáng)性植株，移入蛭石中培養(yǎng)，單株收獲T2代種子。繁殖后獲得T3代，鑒定T3代，獲得純合的轉(zhuǎn)基因株系10株。
BrTCP24基因功能的鑒定純合的轉(zhuǎn)基因株系和野生型擬南芥種子在4°C冰箱中春化3天，消毒后將種子播于1/2MS培養(yǎng)基平板。一部分于22°C，16小時(shí)光照/8小時(shí)黑暗培養(yǎng)箱中6天，檢測(cè)下胚軸的長(zhǎng)度(結(jié)果如表I所不)。一部分置于培養(yǎng)間(22°C, 16小時(shí)光照/8小時(shí)黑暗)中培養(yǎng),生長(zhǎng)20天時(shí)檢測(cè)植株的重量并觀察表型(結(jié)果如表I和圖2所示)。待1/2MS培養(yǎng)基平板上生長(zhǎng)的幼苗的子葉完全張開后，將轉(zhuǎn)基因株系和野生型幼苗轉(zhuǎn)入蛭石中，然后置于培養(yǎng)間(22°C，16小時(shí)光照/8小時(shí)黑暗)中培養(yǎng)，培養(yǎng)30天后觀察純合的轉(zhuǎn)基因株系和野生型植株的表型(結(jié)果如圖I所示)。通過(guò)觀察發(fā)現(xiàn)純合的轉(zhuǎn)基因株系比野生型植株顯著減小，說(shuō)明BrTCP24基因的過(guò)量表達(dá)抑制了植物的生長(zhǎng)，從而使得植物器官減小。表I
權(quán)利要求
1.一種控制大白菜生長(zhǎng)的BrTCP24基因，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID No. I所/Jn o
2.一種由權(quán)利要求I所述BrTCP24基因編碼的多肽，氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示。
3.ー種插入權(quán)利要求I所述BrTCP24基因的重組載體。
4.權(quán)利要求I所述BrTCP24基因、權(quán)利要求3所述重組載體在經(jīng)濟(jì)作物生產(chǎn)改良中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種控制大白菜生長(zhǎng)的BrTCP24基因及其應(yīng)用，所述BrTCP24基因，具有如SEQ ID No.1所示核苷酸序列，全長(zhǎng)1221bp，該基因能應(yīng)用于經(jīng)濟(jì)作物的生產(chǎn)改良。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該基因?yàn)橹参锷L(zhǎng)的控制基因，具有負(fù)調(diào)控植物生長(zhǎng)的功能，通過(guò)過(guò)量表達(dá)該基因，可以獲得比野生植株體型小的轉(zhuǎn)基因植株。本發(fā)明的基因可為培育農(nóng)作物新品種提供理論依據(jù)和基因來(lái)源。
文檔編號(hào)C12N15/29GK102776206SQ20121030099
公開日2012年11月14日 申請(qǐng)日期2012年8月22日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月22日
發(fā)明者劉立鋒, 張一卉, 李利斌, 李化銀, 王鳳德, 王立華, 王翠花, 高建偉 申請(qǐng)人:山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所