專利名稱：一種百合ans基因及其克隆方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及ー種基因及其克隆方法，尤其是百合ANS基因及其克隆方法。
背景技術(shù)：
花色是花卉最重要的性狀之一，它主要由類黃酮、類胡蘿卜素、生物堿三大類色素決定。類黃酮是大多數(shù)花色形成的決定性色素群，它存在于花瓣表皮細(xì)胞液中，其中花青素屬紅色系，其他均屬黃色系；類胡蘿卜素主要呈現(xiàn)黃色、橙色或紅色，它廣泛存在于植物的花、葉、果皮和根等部位；生物堿則參與花瓣黃色、橙色及紅色的形成。這三大類色素的合成都有眾多的結(jié)構(gòu)基因及調(diào)控基因參與，包含了多個(gè)代謝步驟，作用機(jī)理較復(fù)雜。傳統(tǒng)的花色育種費(fèi)時(shí)費(fèi)力，而且有很大的局限，研究花色基因，對(duì)于通過(guò)分子育種手段來(lái)人工修飾改變花卉顔色具有非常重要的意義，如可通過(guò)直接導(dǎo)入外源結(jié)構(gòu)基因或調(diào)節(jié)基因、利用反義技術(shù)和共抑制原理等等方法來(lái)達(dá)到改變花色的目的。另外，由于花色直觀可見(jiàn)，因此它也是研究基因表達(dá)調(diào)控和基因互作的熱點(diǎn)和基礎(chǔ)方向。目前對(duì)屬于類黃酮的花青素的合成代謝和參與其中的基因研究得較為深入，而對(duì)類胡蘿卜素等其它色素的研究相對(duì)較少。花青素最常見(jiàn)的是矢車菊色素(cyanidin)、飛燕草色素(delphinidin)和天竺葵色素(pelargonidin),它們主要積累在花瓣表皮細(xì)胞的液泡中，控制花的紅色、紫羅蘭色及藍(lán)色等顏色變化，其含量的增高或降低，都可能改變花的顔色。影響花青素代謝的基因有兩類ー類是不同植物共同具有的結(jié)構(gòu)基因，它們對(duì)應(yīng)的酶有查爾酮合成酶(chalconesynthase, CHS)、查爾酮異構(gòu)酶(chalcone isomerase, CHI)、黃燒酮 3_ 輕化酶(flavanone 3-hydroxylase, F3H)、ニ輕基黃酮醇還原酶(dihydrofIavonol4-reductase, DFR)、花色素苷合成酶(anthocyanidin synthase, ANS)以及類黃酮 3_0_ 糖基轉(zhuǎn)移酶(flavonoid3-0_glucosyltransferase, UFGT)等等,它們直接編碼花色素代謝生物合成酶；另ー類是調(diào)節(jié)基因，目前分為myc轉(zhuǎn)錄因子和myb轉(zhuǎn)錄因子兩大類，它們負(fù)責(zé)控制結(jié)構(gòu)基因表達(dá)強(qiáng)度和程式。ANS位于花青素合成通路末端，主要作用是催化無(wú)色花色素轉(zhuǎn)化成有色花色素前體物質(zhì)丙ニ酰輔酶A和香豆酰輔酶A被CHS和CHI催化形成無(wú)色的黃烷酮，黃烷酮在F3H的作用下形成無(wú)色的ニ羥基黃酮醇，ニ羥基黃酮醇再被DFR催化還原形成不穩(wěn)定的無(wú)色花色素，然后在ANS和UFGT協(xié)同作用下合成各類花色素苷。ANS基因首先是通過(guò)轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽技術(shù)從玉米突變體中分離得到的，研究表明ANS和F3 ' H 一祥,屬于2-酮戍ニ酸雙加氧酶家族,類黃酮合成途徑中的黃酮醇合成酶(flavonol synthase, FLS)也屬于此家族,它和ANS具有保守的同源關(guān)系。Rosati等從美國(guó)金鐘連翅(ForsythiaX intermedia cv. “Spring Glory”)中克隆得到了 ANS 基因和其啟動(dòng)子，并證明在美國(guó)金鐘連翹的花瓣中無(wú)花色素苷是由于缺少ANS基因的表達(dá)所導(dǎo)致的。目前，已經(jīng)從眾多花丼中克隆得到了 ANS基因，如郁金香(Tulipa gesneriana)、文心蘭(Oncidium Gower)、大 _菊(Dahlia pinnata ハ瓜葉菊(Senecio cruentus)、茍藥(Paeonialactiflora)等等，但迄今為止，還未見(jiàn)從百合中克隆到該基因的報(bào)道。
百合(lilium spp.)是百合科百合屬(Lilium)的所有種的總稱,它是世界著名的觀賞花卉之一，有“球根花卉之王”的美譽(yù)。英國(guó)皇家園藝學(xué)會(huì)(RHS)和北美百合學(xué)會(huì)(NALS)按照百合栽培品種和其原始親緣種與雜種的遺傳衍生關(guān)系分為9大類，其中的三類亞洲百合雜種(Asiatic hybrids)、磨香百合雜種(Longiflorum hybrids)和東方百合雜種(Oriental hybrids)目前在我國(guó)栽培較多。這其中，東方百合系列以其莖桿挺拔、花朵碩大、色彩豐富、芳香宜人的特點(diǎn)備受消費(fèi)者歡迎，成為市面上主要的百合切花種類。目前對(duì)東方百合的研究主要集中在栽培技術(shù)、組織培養(yǎng)、采后生理等方面，基因克隆方面的研究較少。本實(shí)驗(yàn)采用同源克隆的方法，設(shè)計(jì)兼并引物和特異性引物，通過(guò)RACE法從東方百合‘Justina’的花蕾中分離得到了 ANS基因的全長(zhǎng)序列。這將為進(jìn)ー步探索百合不同花色的形成原因和分子機(jī)制，采用分子育種手段進(jìn)行百合花色育種奠定基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的

以充分顯色的東方百合‘Justina’花蕾為實(shí)驗(yàn)材料，液氮速凍后置于_80°C超低溫冰箱保存?zhèn)溆茫捎肞lant RNAzol試劑提取總RNA提取，合成cDNA第一鏈，通過(guò)引物ANS-Fl TGGGGRGTSATGCAYATTGTGAACC
ANS-Rl TCCTTCGGCGGHTCGCRRAACACWGC對(duì)百合ANS基因保守片段的擴(kuò)增，應(yīng)用3' RACE引物對(duì)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)物進(jìn)行3/ RACE克隆，據(jù)測(cè)序所得的ANS基因保守區(qū)序列設(shè)計(jì)3' RAC外引物和內(nèi)引物3' GSP ACTATCCCAAATGTCCGCAACC3' NGSP GCTCTACTATGGTGGCAAATGGGTC應(yīng)用5' RACE引物對(duì)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)物進(jìn)行5' RACE克隆，據(jù)測(cè)序所得的ANS基因保守區(qū)序列設(shè)計(jì)5' RAC外引物和內(nèi)引物5’ GSP GCCAATGTGGACGAGAAGCGAA5’ NGSP CAGGTTGCGGACATTTGGGATAGTAGTT用Seqman軟件將所得到的保守序列、3’端序列和5’端序列進(jìn)行拼接，得到A基因的cDNA全長(zhǎng)序列，共1356個(gè)堿基。找到起始密碼子和終止密碼子的位置，后分別在起始密碼子和終止密碼子處設(shè)計(jì)引物進(jìn)行全長(zhǎng)驗(yàn)證。引物序列如下A-forward CCATTCTACTCCCATCAACCA-reverse TATTTCGTAATCCCCCTCTAPCR擴(kuò)增反應(yīng)后進(jìn)行切膠回收、連接轉(zhuǎn)化、藍(lán)白斑篩選、菌落PCR。


下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施例作進(jìn)ー步詳細(xì)的說(shuō)明。圖I百合總RNA瓊脂糖電泳結(jié)果2百合ANS基因保守區(qū)擴(kuò)增3百合ANS基因3’ RACE片段擴(kuò)增4百合ANS基因5’ RACE片段擴(kuò)增5百合ANS基因cDNA全長(zhǎng)片段擴(kuò)增圖
具體實(shí)施例方式以下將結(jié)合附圖，對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)的描述；應(yīng)當(dāng)理解，優(yōu)選實(shí)施例僅為了說(shuō)明本發(fā)明，而不是為了限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。以充分顯色的東方百合‘Justina’花蕾為實(shí)驗(yàn)材料，液氮速凍后置于_80°C超低溫冰箱保存?zhèn)溆?。I 總 RNA 提取采用Plant RNAzol試劑,具體方法如下I)將花瓣放入研缽中，加入液氮后快速研磨。研磨充分后，按IOOmg組織/mLRNAzol比例加入RNAzol后立即轉(zhuǎn)入離心管。2)室溫放置lOmin，使花瓣充分裂解。 3)4°C、12000rpm離心5min,吸取上清液到新離心管中。4)按200 L氯仿/mL上清液加入氯仿，上下顛倒混勻，室溫放置15min，在此過(guò)程中不斷溫和上下翻轉(zhuǎn)離心管，以確保液體混勻。5) 4°C、12000rpm 離心 15min。6)吸取上層水相，至新離心管中。7)加入吸入上清量的0. 8倍體積的異丙醇，上下顛倒混勻，室溫放置30min。8) 4°C 12000rpm離心IOmin,棄上清(勿將管底R(shí)NA吸掉)。9)加入500 u L70%こ醇，溫和吸打，懸浮沉淀。10)4°C 12000rpm離心5min，盡量棄上清。若仍有殘留上清，可再次離心數(shù)秒，棄上清。11)室溫下開(kāi)蓋放置5-10min，使こ醇揮發(fā)，注意不要過(guò)于干燥，否則下一歩RNA將很難溶解。12)用40 ii L DEPC水溶解RNA，可反復(fù)吸打以促進(jìn)RNA溶解。13)稍離心，吸取上清液至新離心管中，即提取到的RNA樣品。13)RNA質(zhì)量的檢測(cè)取5yl RNA樣品在1%瓊脂糖凝膠、120V電壓下，電泳20min，在凝膠成像系統(tǒng)下拍照檢測(cè)RNA。2. cDNA第一鏈的合成采用寶生物工程(大連)有限公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行第一鏈cDNA的合成，反應(yīng)體系為在PCR管中配制下列模板RNA/引物混合液，全量為6 ill。I)Total RNA4u LOligo (dT) 15Primer (50 u M) IuLRNase free dH20IuL2) 70°C保溫IOmin后迅速在冰上放置5min。3)離心數(shù)秒鐘。4)在上述Microtube管中配制下列反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液。上述模板RNA/引物變性溶液6 |a L
5 X M-MLV Buffer2 jxL
RNase Inhibitor (40U/|oL)0.25jj,L
IOmM dNTP Mixture0.5(iL
RTase M-Mulv (RNase h-) (200U/jj,L)0.4(aL
RNase free water0.85 (j,L5)42°C溫育 60min，70°C溫育 15min 后冰上冷卻。3.百合ANS基因保守片段的擴(kuò)增(I)引物設(shè)計(jì)ANS-Fl TGGGGRGTSATGCAYATTGTGAACCANS-Rl TCCTTCGGCGGHTCGCRRAACACWGC(2)在冰上配制下列PCR反應(yīng)液
第一鏈 cDNA1.5 JLiL
2XTaq Green Mix12.5|iL
ANS-Fl(IOjaM)0.5 jj L
ANS-Rl (IOjaM)0.5 p L
Nuclease-Free WaterIO^iL將上述PCR反應(yīng)液短暫離心混勻后，放入PCR儀中進(jìn)行以下反應(yīng)94°C預(yù)變性5min，94°C變性 40sec，57. 1°C退火 30sec，72°C延伸 40sec，35cycles，72で延伸 lOmin, 4°C
Iorever04. ANS 基因3' RACE 克隆據(jù)測(cè)序所得的ANS基因保守區(qū)序列設(shè)計(jì)3' RAC外引物和內(nèi)引物3' GSP ACTATCCCAAATGTCCGCAACC3' NGSP :GCTCTACTATGGTGGCAAATGGGTC3' RACE 反轉(zhuǎn)錄 反應(yīng)體系Total RNA4.5 fiL
y RACE Adaptor (5 M)I ju L
5 xM-MLV Buffer2 )iL
RNase Inhibitor ( 40 U/ ji L )0.25 L
dNTP Mixture ( 10 mM each)I Reverse Transcriptase M-MLY ( RNase h-) ( 200 U/ ju L ) 0.25 |a I
RNase free WaterI (j,L
Total Volume10 (_iL反應(yīng)條件 42°C，60min，70°C，15min3' RACE Outer PCR 反應(yīng)反應(yīng)體系
上述反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液4 L
IxcDNA Dilution Buffer II6 jj,L
3’ GSP ( 10 jiM)2 juL
y RACE Outer Primer ( 10 卩 M)2 卩 L
IOx LA PCR Buffer II ( Mg2+ Free )4 ji L
MgC12 ( 25 mM )3 ju L
TaKaRa LA Taq ( 5 U/ ju L )0.25 n L
dH2028.75 JiL
Total Volume50 ^iL反應(yīng)條件94°C預(yù)變性 5min，94°C變性 40sec，54°C退火 3Osec, 72°C 延伸 6Osec,
20cycles, 72°C延伸 lOmin, 4°C forever 3' RACE Inner PCR 反應(yīng)反應(yīng)體系1stPCR 產(chǎn)物I juL
dNTP Mixture ( 2.5 mM )8 |a L
IOx LA PCR Buffer II (Mg2+ Free )5 ju L
MgC12 (25mM)5 juLTaKaRa LA Taq ( 5 U/ |a L ) 0.5 ja L3’ NGSP ( 10 juM) 2 uL3’ RACE Inner Primer ( 10 ju M) 2 ju LdH20 26.5 (iL
Total Volume50 jiL反應(yīng)條件94で預(yù)變性5min，94°C 變性 40sec，57. 1°C 退火 30s ec，72°C 延伸6Osec，
30cycles, 72°C延伸 lOmirufC forever 5. ANS 基因 5' RACE 克隆據(jù)測(cè)序所得的ANS基因保守區(qū)序列設(shè)計(jì)5' RAC外引物和內(nèi)引物5’ GSP GCCAATGTGGACGAGAAGCGAA5’ NGSP CAGGTTGCGGACATTTGGGATAGTAGTT去磷酸化處理①按下列組份配制去磷酸反應(yīng)液。
Total RNA ( I |ag/)aL)17 jaL
RNase Inhibitor ( 40 U/ |a L )I M L
10X Alkaline Phosphatase Buffer ( MgC12 Free ) 5 iu L Alkaline Phosphatase ( Calf intestine ) ( 16 U/ ja L ) 0.6 jli L RNase Free dH2026.4|liL②5Oで反應(yīng)Ih ;③向上述反應(yīng)液中加入20 ii L 的 3M CH3C00Na(pH5. 2)，130ii L 的 RNase Free
dH20后，充分混勻；④加入200 U L的苯酚/氯仿/異戊醇(25 : 24 : I)，充分混勻后13，OOOrpm室
溫離心5min，將上層水相轉(zhuǎn)移至新的PCR管中；⑤加入200 U L的氯仿,充分混勻后13，OOOrpm室溫離心5min,將上層水相轉(zhuǎn)移至
新的PCR管中；
⑥加入2 ii L的NA Carrier后均勻混合；⑦加入200 u L的異丙醇，充分混勻后,冰上冷卻IOmin ；⑧13，000rpm4°C離心 20min,棄上清；⑨加入500 u L 的 75%冷こ醇(RNase Free dH20 配制)漂洗，13，000rpm4°C 離心5min,棄上清后干燥；⑩加入7 U L 的 RNase Free dH20 溶解沉淀，得到 CIAP-treated RNA?！叭ッ弊印狈磻?yīng)①按下列組份配制“去帽子”反應(yīng)液。
CIAP-treated RNA7 |iL
RNase Inhibitor ( 40 U/ ju L )IpL
IOxTAP Reaction BufferIjjL
Tobacco Acid Pyrophosphatase ( 0.5 U/ ju L ) I pL②37°C反應(yīng) lh，得到的反應(yīng)液即 CIAP/TAP-treated RNA。5' RACE Adaptor 的連接①配制下列溶液CIAP/TAP-treated RNA5 U L5' RACE Adaptor (15 U M) IuLRNase Free dH204 U L65°C保溫5min后,冰上放置2min,然后加入下列試劑。
② RNase Inhibitor ( 40 U/ |a L )I ju L
5 X RNA Ligation Buffer8 jiL
40% PEG#600020 \\L
T4 RNA Ligase ( 40 U/ jli L )I 卩 L③16°C反應(yīng) lh。④向上述反應(yīng)液中加入20 ii L 的 3M Ch3C00Na(ph5. 2), 140 u L 的 RNase FreedH20后，充分混勻。⑤加入200 ii L的苯酚/氯仿/異戊醇(25 24 I)，充分混勻后13，OOOrpm室溫離心5min，將上層水相轉(zhuǎn)移至新的PCR管中。⑥加入200 ii L的氯仿，充分混勻后13，OOOrpm室溫離心5min，將上層水相轉(zhuǎn)移至新的PCR管中。⑦加入2 ii L的NA Carrier后均勻混合。⑧加入200 u L的異丙醇，充分混勻后，冰上冷卻IOmin。
⑨13，000rpm4°C離心 20min,棄上清。加入 500 u L 的 75%冷こ醇(RNase FreedH20配制)漂洗，13, 000rpm4°C離心5min,棄上清后干燥。⑩加入6 u L 的 RNase Free dH20 溶解沉淀，得到 Ligated RNA。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)配制下列反應(yīng)液
Ligated RNA6 (j,L
Random 9 mers ( 50 p M)0.5 ju L
5 xM-MLV Buffer2 (iL
dNTP (IOmMeach)I ju L
RNase Inhibitor ( 40 U/ M L )0.25 jaLReverse Transcriptase M-MLV(RNase h~) (200U/U L) 0.25 U L反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件30°C 10min,42°C lh，70°C 15min反應(yīng)結(jié)束后可以進(jìn)行下ー步實(shí)驗(yàn)，或?qū)⒎磻?yīng)液保存于_20°C。5' RACE Outer PCR 反應(yīng)配制下列反應(yīng)液
反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液5 ju L
IxcDNA Dilution Buffer II5 jxL
IOxLAPCRBuffer II ( Mg2+ Free )4 |uL
MgC12 (25mM)3 juL
TaKaRa LA Taq ( 5 U/ L )0.25 ju L
5'RACE reverse I (10 j_iM)2 ju L
5'RACE Outer Primer ( 10 ju M)2 ju L
dH2028.75 |iL
Total50 (J.LPCR反應(yīng)條件94°C預(yù)變性 5min，94°C變性 40sec，59. 9°C退火 30sec，72°C延伸 70sec，20cycles,72°C延伸 lOmin,4°C forever 5' RACE Inner PCR 反應(yīng)
Inner PCR 反應(yīng)液
Outer PCR 反應(yīng)液I ju L
IOx LAPCR Buffer II ( Mg2 + Free )5 ji L
MgC12 ( 25 mM)5 |uL
dNTP Mixture ( 2.5 mM)8 n L
TaKaRa LA Taq ( 5 U/ ju L )0.5 jli L 5'RACE reverse2 ( 10 nM)2 \iL
5'RACE Inner Primer ( 10 ロ M)2 n L
dH2026.5 ^iL
Total50 [iLPCR反應(yīng)條件94°C預(yù)變性 5min，94°C變性 40sec，60. 9°C退火 30sec，72°C延伸 70sec，30cycles,72°C延伸 lOmin,4°C forever 6. ANS基因cDNA全長(zhǎng)克隆用Seqman軟件將所得到的保守序列、3’端序列和5’端序列進(jìn)行拼接，得到A基因的 cDNA 全長(zhǎng)序列，共 1356 個(gè)喊基。在 http //www. ncbi. nlm. nih. gov/gorf/gorf. html在線進(jìn)行ORF查找，找到起始密碼子和終止密碼子的位置，后分別在起始密碼子和終止密碼子處設(shè)計(jì)引物進(jìn)行全長(zhǎng)驗(yàn)證。引物序列如下A-forward CCATTCTACTCCCATCAACCA-reverse TATTTCGTAATCCCCCTCTAPCR擴(kuò)增反應(yīng)在冰上配制下列PCR反應(yīng)液
第一鏈 cDNA1.5 IiL
2XTaq Green Mix12.5joL
A-forward ( 10 |aM)0.5 jaL
A-reverse ( 10 juM)0.5 ju L
Nuclease-Free WaterI OjiL將上述PCR反應(yīng)液短暫離心混勻后，放入PCR儀中進(jìn)行以下反應(yīng)94°C預(yù)變性5min, 94 V 變性 40sec，48. 8 °C 退火 30sec, 72 V 延伸 80sec, 35cycles, 72 V 延伸 IOmin,4°C forever。7.切膠回收(I)柱平衡步驟向吸附柱中(吸附柱放入收集管中)加入500 UL平衡液BL，室溫下12000rpm離心lmin，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中；(2)將單ー的目的DNA條帶從瓊脂糖凝膠中快速切下放入干凈的離心管中，稱取
質(zhì)量;(3)向膠塊中加入3倍體積溶膠液PN，50°C水浴放置lOmin，其間不斷溫和的上下翻轉(zhuǎn)離心管，以確保膠塊充分溶解；膠塊完全溶解后將膠溶液降至室溫。(4)將上一部所得溶液加入步驟一得到的吸附柱中(吸附柱放入收集管中)，室溫 放置2min，12000rpm離心lmin，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中；(5)向吸附柱中加入700iiL漂洗液PW，12000rpm離心lmin，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中，將吸附柱重新放回收集管中；(6)向吸附柱中加入500iiL漂洗液PW，12000rpm離心lmin，倒掉收集管中的廢液；(7)將吸附柱放回收集管中，12000rpm離心2min，盡量除去漂洗液，將吸附柱置于室溫放置5-10min,徹底的晾干；(8)將吸附柱放入一個(gè)干凈的離心管仲，向吸附膜中間位置懸空滴加30 y L洗脫緩沖液EB，室溫放置2min，12000rpm離心2min收集DNA溶液。(9)重復(fù)步驟8。8.連接轉(zhuǎn)化(I)在PCR管中配制下列DNA溶液PMD19-T vector IuLInter DNA4 U L(2)加入L的Solution I,槍頭輕揉攪勻；(3)16で反應(yīng)301^11;(4)全量加入至IOOii L Top 10感受態(tài)細(xì)胞中，槍頭輕揉攪勻，冰中放置30min ；(5)42°C熱激60sec后，再在冰中放置2min (該過(guò)程不要搖動(dòng)離心管)；(6)加入890 ii LLB培養(yǎng)基，37°C震蕩培養(yǎng)2h ；(7)按每 20ml 培養(yǎng)基加入 40 u L X-Gal (20mg/ml)和 16 u LIPTG (50mg/ml)的標(biāo)準(zhǔn)，將X-Gal和IPTG加入到含Amp的固體培養(yǎng)基上，用涂布棒均勻涂開(kāi)直至液體被吸收，37 °C下恒溫培養(yǎng)30min。(8)吸取200 ii L第6步得到的已轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞到第7步得到的LB固體培養(yǎng)基上，用涂布棒將細(xì)胞均勻涂開(kāi)，將平板置于室溫直至液體被吸收，倒置平板，37°C培養(yǎng)12-16h。9.連接轉(zhuǎn)化藍(lán)白斑篩選I)轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞在含有氨節(jié)青霉素的LB平板上培養(yǎng)ー晚后,會(huì)長(zhǎng)出許多抗性菌落(轉(zhuǎn)化子)，其中有白色菌落(重組子)和藍(lán)色菌落(非重組子)；2)挑取白色單菌落接入IOmL含Amp的LB液體培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)過(guò)夜；
10.連接轉(zhuǎn)化藍(lán)白斑篩選菌落PCR取300iiL菌液12000rpm離心5min，棄上清后用30iiL ddH20重懸菌體，100°C水浴5min使菌裂解，12000rpm離心5min,以上清為模板進(jìn)行菌落PCR反應(yīng),體系如下
權(quán)利要求
1.ー種百合ANS基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO :I所示。
2.ー種百合ANS基因編碼的蛋白質(zhì)，其氨基酸序列如SEQ IDNO :2所示。
3.ー種百合ANS基因克隆方法，其特征在于按下列步驟進(jìn)行 (1)提取以及純化百合花瓣RNA，合成cDNA第一鏈； (2)應(yīng)用ー對(duì)引物通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)對(duì)百合cDNA第一鏈進(jìn)行擴(kuò)增，所述引物為 ANS-FI TGGGGRGTSATGCAYATTGTGAACCANS-Rl TCCTTCGGCGGHTCGCRRAACACWGC (3)應(yīng)用3'RACE引物對(duì)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)物進(jìn)行3' RACE克隆，據(jù)測(cè)序所得的ANS基因保守區(qū)序列設(shè)計(jì)3' RAC外引物和內(nèi)引物3' GSP ACTATCCCAAATGTCCGCAACC3' NGSP GCTCTACTATGGTGGCAAATGGGTC (4)應(yīng)用5'RACE引物對(duì)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)物進(jìn)行5' RACE克隆，據(jù)測(cè)序所得的ANS基因保守區(qū)序列設(shè)計(jì)5' RAC外引物和內(nèi)引物5’ GSP GCCAATGTGGACGAGAAGCGAA5’ NGSP CAGGTTGCGGACATTTGGGATAGTAGTT (5)ANS基因cDNA全長(zhǎng)克隆，用Seqman軟件將所得到的保守序列、3’端序列和5’端序列進(jìn)行拼接，得到A基因的cDNA全長(zhǎng)序列，共1356個(gè)堿基，設(shè)計(jì)引物進(jìn)行全長(zhǎng)驗(yàn)證，引物序列如下A-forward CCATTCTACTCCCATCAACCA-reverse :TATTTCGTAATCCCCCTCTA。
4.如權(quán)利要求3所述的百合ANS基因克隆方法，其特征在于 對(duì)百合cDNA第一鏈進(jìn)行擴(kuò)增的PCR反應(yīng)條件94 V預(yù)變性5min，94で變性40sec，·57. 1°C退火 30sec, 72°C延伸 40sec, 35cycles, 72°C延伸 lOmirufC forever3’ RACE克隆的outter PCR反應(yīng)條件94°C預(yù)變性5min，94°C變性40sec，54°C退火3086。，72で延伸 60sec, 20cycles, 72°C延伸 IOmirufC forever3’ RACE克隆的inner PCR反應(yīng)條件94°C預(yù)變性5min，94°C變性40sec，57. 1°C退火3086。，72で延伸 60sec, 30cycles, 72°C延伸 IOmirufC forever5’ RACE克隆的outter PCR反應(yīng)條件94°C預(yù)變性5min，94°C變性40sec，59. 9°C退火3086。，72で延伸 70sec, 20cycles, 72°C延伸 IOmirufC forever5’ RACE克隆的inner PCR反應(yīng)條件94°C預(yù)變性5min，94°C變性40sec，60. 9°C退火3086。，72で延伸 70sec, 30cycles, 72°C延伸 IOmirufC forever全長(zhǎng)克隆的PCR反應(yīng)條件94°C預(yù)變性5min，94°C變性40sec，48. 8°C退火30sec，72°C延伸 80sec, 35cycles, 72°C延伸 IOmin, 4°C fofever。
全文摘要
一種百合ANS基因克隆方法，提取以及純化百合花瓣RNA，合成cDNA第一鏈，應(yīng)用一對(duì)引物通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)對(duì)百合cDNA第一鏈進(jìn)行擴(kuò)增，應(yīng)用3′RACE引物對(duì)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)物進(jìn)行3′RACE克隆，應(yīng)用5′RACE引物對(duì)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)物進(jìn)行5′RACE克隆，用Seqman軟件將所得到的保守序列、3’端序列和5’端序列進(jìn)行拼接，得到A基因的cDNA全長(zhǎng)序列，共1356個(gè)堿基，PCR擴(kuò)增反應(yīng)后進(jìn)行切膠回收、連接轉(zhuǎn)化、藍(lán)白斑篩選、菌落PCR。
文檔編號(hào)C12N15/10GK102864159SQ20121030123
公開(kāi)日2013年1月9日 申請(qǐng)日期2012年8月23日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月23日
發(fā)明者張克中, 崔金騰, 王瑜, 張睿鸝 申請(qǐng)人:北京農(nóng)學(xué)院