專利名稱：一種快速定量檢測基因c型鴨甲型肝炎病毒的熒光pcr試劑盒的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及家禽傳染病診斷，具體涉及基因C型鴨甲型肝炎病毒熒光定量RT-PCR方法技術領域。
背景技術：
近年來，由基因C型鴨甲型肝炎病毒(DHAV-C)引起的鴨病毒性肝炎廣泛流行于韓國和中國，該病毒主要侵害3周齡內雛鴨，發(fā)病急，病死率高，嚴重影響?zhàn)B鴨業(yè)的發(fā)展。DHAV-C引起的鴨病毒性肝炎與基因A型鴨甲型肝炎病毒(DHAV-A)引起的鴨肝炎在流行病學、臨床癥狀和病理變化等非常相似，只有借助實驗室診斷才能鑒別，病毒分離鑒定是傳染病病原學診斷的經(jīng)典方法，但該方法至少需要I 2周才能確診，費時費力，不能滿臨床實踐中對傳染病及早診斷、迅速采取有效措施進行防治的的需求。RT-PCR作為一種常規(guī)的分 子生物學技術以其快速、靈敏、特異、操作簡單等優(yōu)點廣泛用于人類和多種動物病毒病的診斷。以上內容可參閱[I]Pritchard L I，Morrissy C，Van Phuc K, et al. Development of apolymerase chain reaction to detect Vietnamese isolates of duck virusenteritis. [J]. Vet Microbiol，1999，68(1—2149-156.[2]KeramasG,Bang D D,Lund M，et al. Use of culture,PCR analysis,and DNAmicroarrays for detection of Campylobacter jejuni and Campylobacter colifromchicken feces. [J]. J Clin Microbiol，2004，42(9) :3985-3991.[3] Lund M, Nordentoft S, Pedersen K，et al. Detection of Campylobacterspp. in chicken fecal samples by real-time PCR. [J]. J Clin Microbiol，2004，42(11)5125-5132.[4]Identification of duck plague virus by polymerase chain reaction.[J]. 1999,43(1) :106-115.)目前已有RT-PCR用于DHAV-C鴨肝炎的診斷韓國學者Kim等(Kim MC，KwonYK, Joh SJ, et al. Differential diagnosis between type-specific duck hepatitisvirus type I (DHV-I) and recent Korean DHV-l-like isolates using a multiplexpolymerase chain reaction. [J]. Avian Pathology，2008，37 (2) :171-177.)分別針對DHAV-A基因組的DRL-62基因和DHAV-C基因組的AP-04203基因設計了兩對引物(API :5’ -GTTCCAAATGATGATTATTATG-3’ ；AP2 :5’ -GGATCTGATTAGTACCAGATAAG-3’ ；CP1 CCCAY(C或 T)GTCTAAGTCTTAATGGAT-3’ ；CP2 :5’ -CTAAAGGTGTCTGTATCCAAGC-3’)，建立了鑒別診斷DHAV-A和DHAV-C的雙重RT-PCR方法，具體操作步驟如下釆集疑似鴨肝炎病毒感染鴨的肝臟，用Triol試劑提取總肝臟總RNA，用反轉錄試劑將肝臟總RNA反轉錄成cDNA作為模板，分別擴增DHAV-ADRL-62基因的897 1125位點229bp的特異片段和DHAV-CAP-04203基因的204 514位點311bp的特異片段，該方法對DHAV-C的最低檢出量為IOOpg/反應。研究結果表明，該雙重RT-PCR方法可用于DHAV-A和DHAV-C感染臨床樣本的鑒別診斷。宋永峰等(Levine PPJ Ahitherto-undescribed virus disease of ducks in NorthAmerica [J]. Cornell Vet, 1950 (40) :71-76.)根據(jù) GenBank 中已發(fā)表的 DHAV-C 全基因序列(DQ256134、DQ25613)，在非同源區(qū)域設計一對引物 Pl :5’ -CTGAGAAGCGGGATATTAGT-3’ ；P2 :5’ -AATCAACCTAGACGGGGAAT-3’)，從其臨床分離鑒定的DHAV-C樣本中提取總RNA，以反轉錄得到的cDNA為模板，PCR擴增DHAV-C638bp的基因片段。該學者建立的RT-PCR方法能特異地檢出DHAV-C，此方法對DHAV-C的最低檢出量為21pg/反應。何冉婭等(Haider SA,Calnek Bff. In vitro isolation,propagation,and characterization of duck hepatitisvirus typeIII. [J]· Avian Dis，1979，23 (3) :715-729.)根據(jù) GenBank 中已發(fā)表的 DHAV-C全基因組序列(DQ256134、DQ25613)，應用Primer Prim ier5. O設計一對特異性引物(Pl 5’ -TGTGCCTGAGAAGCGGGATA-3’;P2 :5’ -CCGAAAGTGGAGATTAGGTG-3’)，從廣東省采集到的鴨病毒性肝炎病毒感染鴨的肝臟病料中采用Trizol試劑進行總RNA的提取，并將提取到的RNA反轉錄成cDNA，以cDNA為模板擴增DHAV-C 705bp的基因片段。該學者建立的RT-PCR方法能特異地檢出DHAV-C，并且此方法對DHAV-C的最低檢出量為2X103pg/反應。另夕卜，本發(fā)明申請的發(fā)明人(黃秋雪，湯承，聶培婷等.鴨甲型肝炎病毒基因A型和C型雙重RT-PCR檢測方法的建立[J],中國預防獸醫(yī)學報，2012，34(2) =120-123.)根據(jù)GenBank中公布的DHAV-A和DHAV-C全基因組序列，應用Primer Premier5. O軟件，針對DHAV-A的3C、3D 和 DHAV-C 的 2C 區(qū)域分別設計了 2 對引物(DHAV-AP1 :5’ -GCAATGGCACTATGGGAGC-3’，DHAV-AP2 :5’ -GAGGAGGCTGAAACA-3’ ；DHAV-CPI :5’ -TCCAACAGGGTCAAAGC-3’，DHAV-CP2 5’ -AACTACTACAAGTCTGCCACG-3’)，擴增 DHAV-A (259bp)和 DHAV-C (194bp)的特異性片段，從四川省采集到的鴨病毒性肝炎病毒感染鴨的肝臟病料中提取總RNA，并以反轉錄得到的cDNA為模板，建立檢測DHAV-A和DHAV-C的雙重RT-PCR方法。該方法可用于臨床樣本的檢測，最低檢測限達到3.4X10_3pg/反應。RT-PCR用于病毒病的診斷雖然具有靈敏度高、快速、特異的特點，但是存在無法對檢測樣品進行準確定量、檢測通量不高，且存在電泳等PCR后處理過程，易造成污染而出現(xiàn)假陽性等缺陷，限制了該方法的應用。熒光定量PCR(Real-Time RT-PCR, RRT-PCR)方法通過在反應體系中引入熒光信號，實現(xiàn)了熒光信號和PCR雙放大，不僅大大提高了檢測的靈敏度，而且不需要電泳等PCR后處理過程，在反應管中一次操作即可完成對數(shù)十至數(shù)百個樣本的定性和定量，易于標準化，有效克服了 PCR方法的不足。在傳染病診斷中廣泛應用(Mackay I M, Arden KE, Nitsche A. Real-time PCR in virology. [J]. NucleicAcids Res, 2002,30 (6) :1292-1305 和 Heid C A, Stevens J, Livak K J, et al. Realtimequantitative PCR. [J]. Genome Res, 1996,6 (10) :986-994.)目前國內外尚未見檢測DHAV-C的熒光定量PCR方法報道。也未見可使檢測方便快速實現(xiàn)的相應試劑盒面世和文獻報道。

發(fā)明內容
鑒于現(xiàn)有的技術的缺點，本發(fā)明的目的是提供一種快速定量檢測基因C型鴨甲型肝炎病毒的熒光PCR試劑盒，并使之具有使用方便，靈敏度高的優(yōu)點。
本發(fā)明的目的是通過如下的手段實現(xiàn)的一種快速定量檢測基因C型鴨甲型肝炎病毒的熒光PCR試劑盒，對基因C型鴨甲型肝炎病毒進行定性和定量檢測快速地檢測，包括a) RNA裂解液，b) RNA酶抑制劑，c)逆轉錄酶，d)逆轉錄反應液，e)熒光定量反應液，f)熒光染料，g)標準陽性模板 ；所述逆轉錄反應液含有5XPrimeScript Buffer,引物Random 6 mers和無菌雙蒸水；熒光定量反應液含有弓I物和無菌雙蒸水，引物為正向引物和反向引物，分別為5’-TCCAACAGGGTCAAAGC-3’ (SEQ ID Nol)和 5’-AACTACTACAAGTCTGCCACG-3’ (SEQ ID No2)所示的核苷酸序列；所述標準陽性模板是含有基因C型鴨甲型肝炎病毒5’端194個核苷酸片段插入PMD19-T載體構成的，且該載體可在大腸桿菌DH5 α中增殖；所述熒光染料采用SYBR PremixExTaq II，含有 TaKaRa Ex Taq HS, dNTP Mixture, Mg2+, SYBR GreenI。本發(fā)明檢測基因C型鴨甲型肝炎病毒的熒光PCR試劑盒中，采用了 SYBR Green染料。SYBR Green是熒光定量PCR最常用的DNA結合染料，可以與DNA雙鏈結合并發(fā)出熒光。在游離狀態(tài)下，SYBR Green發(fā)出微弱的熒光，一旦與PCR產(chǎn)物結合后，其熒光增強到游離狀態(tài)的1000倍。所以，一個反應發(fā)出的全部熒光信號與擴增的PCR產(chǎn)物量成正比，可以根據(jù)熒光信號檢測出PCR產(chǎn)物的量。對基因C型鴨甲型肝炎病毒的定量可通過與標準品的循環(huán)閾值(Ct，Threshold Cycle)相比較得出。Ct值是PCR過程中，熒光信號的積累超過基底熒光量的循環(huán)數(shù)，Ct值與起始模板數(shù)呈一定比例關系，Ct值越小，起始模板數(shù)越多，相反，Ct值越大，起始模板數(shù)越少。利用陽性梯度標準模板的Ct值制成標準曲線，再根據(jù)待測樣品的Ct值可準確測出該樣品的起始拷貝數(shù)。在本發(fā)明的一個優(yōu)選方案中，標準陽性模板是含有基因C型鴨甲型肝炎病毒5’端194個核苷酸片段插入pMD19-T載體，且該載體可在大腸桿菌DH5a中增殖。儲存濃度為
I.68 X 101°拷貝/ μ 1，使用前系列稀釋。實驗所用的標準品為含有目的擴增片段的質粒，該質粒轉化大腸桿菌DH5 a增殖后用堿裂解法提取，經(jīng)DNA純化試劑盒純化，用分光光度計測A260定量并稀釋至1.68父101°拷貝/^1，-201保存。本發(fā)明提供檢測基因C型鴨甲型肝炎病毒的熒光PCR試劑盒針對基因C型鴨甲型肝炎病毒檢測中的特殊性，對不同的靶序列進行反應體系，如引物濃度、退火溫度等的優(yōu)化，并將熒光定量RT-PCR技術和定量檢測系統(tǒng)相結合，將其用于基因C型鴨甲型肝炎病毒的定性和定量檢測。通過優(yōu)化方案，反復實驗，以及與傳統(tǒng)的基因C型鴨甲型肝炎病毒鑒定的方法進行比較，建立了檢測基因C型鴨甲型肝炎病毒的定性和定量方法，并研制出基因C型鴨甲型肝炎病毒定性和定量檢測的試劑盒，該試劑盒的靈敏度達到3. 36X IO3拷貝/反應，完全可以滿足基因C型鴨甲型肝炎病毒的快速特異性檢測。在發(fā)明的另外一個方面，還提供了使用本發(fā)明的試劑盒對基因C型鴨甲型肝炎病毒進行檢測的方法，該方法包括以下步驟I)用c)標準陽性模板制備陽性標準品，并用紫外分光光度計定量；2) RNA裂解液從待測樣本中提取RNA，然后加入逆轉錄酶、RNA酶抑制劑和逆轉錄反應液逆轉錄成cDNA ；3)分別取2)步中的cDNA和同樣量系列稀釋的I)步中的陽性標準品加入到含熒光定量反應液和SYBR Premix Ex TaqTM II的PCR反應體系中用熒光定量PCR儀進行檢測；3)通過比較待測樣品和陽性標準品的循環(huán)閾值而對待測樣品的起始拷貝數(shù)進行定量。本發(fā)明與現(xiàn)有技術相比具有以下優(yōu)點和效果I、定量準確；2、檢測速度快，僅2小時，加上核酸的提取和cDNA的制備，共僅需4小時左右；3、步驟簡單；4、可同時進行高通量的樣品檢測。
具體實施例方式下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應當理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明要求保護的范圍。實施例I基因C型鴨甲型肝炎病毒的熒光PCR試劑盒組成A)試劑組成RNA裂解液、RNA酶抑制劑、逆轉錄酶、5 XPrimeScript Buffer,引物Random6mers和SYBR Premix Ex TaqTM II購自大連寶生物公司；B) SYBR Premix Ex TaqTM II 含有TaKaRa Ex Taq HS, dNTP Mixture，Mg2+，SYBR Green I ；C)逆轉錄反應液5XPrimeScript fj Buffer 2 μ L, Random 6 mers 2uL，無菌雙蒸水3. 5 μ L ;D)熒光定量反應液正向引物和反向引物各OjyL(IOymoVL)，無菌雙蒸水
7.2μ L ；Ε)自備試劑氯仿、異丙醇、DEPC處理的無菌雙蒸水、用DEPC處理的無菌雙蒸水配制的75%乙醇。實施例2對臨床樣本的檢測Α).將陽性標準品進行10倍系列稀釋，分別取熒光定量反應液各8yL，SYBR Premix Ex TaqTM II各I μ L，陽性標準模板各2 μ L，每個陽性標準模板做三個平行對照，分別加入不同的PCR反應管，在熒光定量PCR儀上平行做PCR檢測。反應條件為95°C預變性3min ;95°C變性15s ;60°C退火31s，共進行30個循環(huán)。以陽性標準品稀釋度的對數(shù)為橫坐標，Ct值為縱坐標，建立標準曲線。從標準曲線可見，在I. 68 X IO4 I. 68 X IO9拷貝/ μ L內有良好的線性關系，其相關系數(shù)為O. 998，標準方程為Y = -3. 348Χ+26. 310，擴增效率為97. 9%0B).取待檢樣品各IOOmg左右，分別加RNA裂解液Iml混勻，室溫靜置5min，加
O.3ml氯仿,混勻后室溫靜置5min,于4°C 12000r/min離心15min,上清液轉移到另一個離心管，加O. 5ml異丙醇，室溫靜置IOmin,于4°C 12000r/min離心IOmin,輕輕倒出上清,加Iml 75%乙醇于4°C 12000r/min離心5min,棄上清,RNA沉淀在室溫下自然晾干,加入DEPC處理過的無菌雙蒸水20 μ L溶解RNA。C).取B)步所提取的RNA各2yL，加入逆轉錄酶各0.5yL，逆轉錄反應液各7· 5μ L。37°C 15min ；85°C 5s，將 RNA 逆轉錄成 cDNA。
D).分別取熒光定量反應液各8 μ L，SYBR Premix Ex TaqTM II各10 μ L和C)步所得cDNA各2μ L，分別加入不同的PCR反應管，在熒光定量PCR儀上平行做PCR檢測。反應條件為95°C預變性3min ;95°C變性15s ;60°C退火31s，共進行30個循環(huán)。C). PCR反應結束后，將獲得的Ct值代入標準方程中的Y，求得X，待測樣品中基因C型鴨甲型病毒的拷貝數(shù)則為10x，如I 5號臨床樣本檢測的Ct值分別是3. 43、4. 07、9. 00,4. 37,9. 97，代入標準方程Y = -3. 348X+26. 310，求得X的值，再算出IOx,即可得出對DHAV-C的定量結果依次為6. 8 X IO6拷貝/反應、4. 4X IO6拷貝/反應、I. 5 X IO5拷貝/反應、3. 6 X IO6拷貝/反應和7. 6 X IO4拷貝/反應?！?br> 權利要求
1.一種快速定量檢測基因C型鴨甲型肝炎病毒的熒光PCR試劑盒，對基因C型鴨甲型肝炎病毒進行定性和定量檢測快速地檢測，包括 a) RNA裂解液，b) RNA酶抑制劑，c)逆轉錄酶，d)逆轉錄反應液，e)熒光定量反應液，f)熒光染料，g)標準陽性模板； 所述逆轉錄反應液含有5XPrimeScript Buffer,引物Random 6 mers和無菌雙蒸水；熒光定量反應液含有引物和無菌雙蒸水，引物為正向引物和反向引物，分別為5’ -TCCAACAGGGTCAAAGC-3’ 和 5’ -AACTACTACAAGTCTGCCACG-3’ 所示的核苷酸序列；所述標準陽性模板是含有基因C型鴨甲型肝炎病毒5’端194個核苷酸片段插入PMD19-T載體構成的，且該載體可在大腸桿菌DH5a中增殖；所述熒光染料采用SYBR Premix Ex Taq II，含有 TaKaRa Ex Taq HS, dNTP Mixture, Mg2+, SYBR Green I。
2.根據(jù)權利要求I所述之快速定量檢測基因C型鴨甲型肝炎病毒的熒光PCR試劑盒，其特征在于，所述逆轉錄反應液含有5XPrimeScript Buffer,引物Random 6 mers和無菌雙蒸水。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種快速定量檢測基因C型鴨甲型肝炎病毒的熒光PCR試劑盒，對基因C型鴨甲型肝炎病毒進行定性和定量檢測快速地檢測，包括a)RNA裂解液，b)RNA酶抑制劑，c)逆轉錄酶，d)逆轉錄反應液，e)熒光定量反應液，f)SYBRPremix Ex TaqTM II，g)標準陽性模板，d)逆轉錄反應液；e)熒光定量反應液含有引物和無菌雙蒸水；f)SYBRPremix Ex TaqTM II含有TaKaRa Ex Taq HS，dNTP Mixture，Mg2+，SYBRGreen I。本發(fā)明敏度達到3.36×103拷貝/反應，完全可以滿足基因C型鴨甲型肝炎病毒的快速特異性檢測。
文檔編號C12R1/93GK102827950SQ201210302439
公開日2012年12月19日 申請日期2012年8月23日 優(yōu)先權日2012年8月23日
發(fā)明者湯承, 岳華, 黃秋雪 申請人:西南民族大學