一種AraC突變體蛋白及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種AraC突變體蛋白及其應(yīng)用，具體涉及AraC突變體蛋白在高通量篩選合成四氫嘧啶的菌株中的應(yīng)用。本發(fā)明提供的AraC突變體蛋白為序列表的序列3所示的蛋白質(zhì)。編碼所述蛋白質(zhì)的基因也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。本方法提供的AraC突變體蛋白能夠特異性結(jié)合四氫嘧啶并受其誘導(dǎo)開啟PBAD啟動(dòng)子表達(dá)下游報(bào)告基因，建立報(bào)告基因表達(dá)強(qiáng)度和四氫嘧啶濃度之間的對(duì)應(yīng)關(guān)系，從而可以通過熒光強(qiáng)度或者顏色反應(yīng)來篩選高產(chǎn)四氫嘧啶的菌株。本方法為四氫嘧啶高產(chǎn)菌株的篩選提供一種快速高效的高通量篩選方法，將促進(jìn)四氫嘧啶工業(yè)化應(yīng)用的發(fā)展。
【專利說明】一種AraC突變體蛋白及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種AraC突變體蛋白及其應(yīng)用，具體涉及AraC突變體蛋白在高通量篩選合成四氫嘧啶的菌株中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]四氫嘧啶，中文全稱為1，4，5，6-四氫-2-甲基_4_嘧啶羧酸，英文全稱為1，4，5，
6-tetrahydro-2-methyl-4-pyrimidinecarbo xylic acid; ectoine。結(jié)構(gòu)式見式(I)。
[0003]
【權(quán)利要求】
1.序列表的序列3所不的蛋白質(zhì)。
2.編碼權(quán)利要求1所述蛋白的基因。
3.如權(quán)利要求2所述的基因，其特征在于:所述基因是如下I)至3)中任一所述的DNA分子: 1)序列表的序列4所不的DNA分子； 2)在嚴(yán)格條件下與I)限定的DNA序列雜交且編碼所述蛋白質(zhì)的DNA分子； 3)與I)限定的DNA序列具有90%以上同源性且編碼所述蛋白質(zhì)的DNA分子。
4.含有權(quán)利要求2或3所述基因的重組表達(dá)載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌。
5.如權(quán)利要求4所述的重組表達(dá)載體，其特征在于:所述重組表達(dá)載體為將權(quán)利要求2或3所述基因插入pMAL-p2x載體的多克隆位點(diǎn)得到的重組質(zhì)粒。
6.—種試劑盒,包括質(zhì)粒甲和質(zhì)粒乙； 所述質(zhì)粒甲為在表達(dá)載體的多克隆位點(diǎn)插入序列表的序列4自5’末端第4至879位核苷酸所示DNA分子得到的重組質(zhì)粒； 所述質(zhì)粒乙為在表達(dá)載體的多克隆位點(diǎn)插入特異DNA片段得到的重組質(zhì)粒；所述特異DNA片段包括序列表的序列5中自5’末端第329至402位核苷酸所示的Pbad啟動(dòng)子和熒光蛋白的編碼基因。
7.如權(quán)利要求6 所述的試劑盒，其特征在于:所述試劑盒還包括宿主菌；所示宿主菌為敲除大腸桿菌基因組中的araC基因得到的工程菌。
8.如權(quán)利要求7所述的試劑盒，其特征在于:所述宿主菌為JW0063-1菌株。
9.權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)、權(quán)利要求2或3所述基因、權(quán)利要求4或5所述重組表達(dá)載體、或權(quán)利要求6、7或8所述試劑盒，的應(yīng)用，為如下(a)或(b)或(c): (a)鑒定四氫嘧啶； (b)檢測四氫嘧啶的含量； (c)篩選生產(chǎn)四氫嘧啶的菌株。
10.一種篩選受四氫嘧啶特異誘導(dǎo)的AraC突變體蛋白的方法，包括如下步驟: (1)將AraC突變體文庫和輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化宿主菌，得到重組菌； (2)陰性篩選 將步驟(1)得到的重組菌進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)，分選熒光最低的細(xì)胞； (3)陽性篩選 將步驟(2)得到的細(xì)胞進(jìn)行四氫嘧啶誘導(dǎo)，用分選熒光最強(qiáng)的細(xì)胞； 反復(fù)進(jìn)行所述陰性篩選和所述陽性篩選，直至挑選得到的單克隆在有四氫嘧啶存在的情況下熒光蛋白熒光值比無四氫嘧啶存在時(shí)熒光蛋白熒光值高，且差值為2000以上，所述單克隆即為含有所述突變體蛋白的細(xì)胞； 所述AraC突變體文庫為將序列表的序列2所示野生型araC基因進(jìn)行突變并將突變得到的DNA分子插入表達(dá)載體得到的DNA文庫； 所述輔助質(zhì)粒為在表達(dá)載體的多克隆位點(diǎn)插入特異DNA片段得到的重組質(zhì)粒；所述特異DNA片段包括序列表的序列5中自5’末端第329至402位核苷酸所示的Pbad啟動(dòng)子和熒光蛋白的編碼基因； 所述宿主菌為敲除大腸桿菌基因組中的所述野生型araC基因得到的工程菌。
【文檔編號(hào)】C12R1/19GK103626852SQ201210302998
【公開日】2014年3月12日 申請(qǐng)日期:2012年8月23日 優(yōu)先權(quán)日:2012年8月23日
【發(fā)明者】蔣培霞, 唐雙焱 申請(qǐng)人:中國科學(xué)院微生物研究所