具有趨化活性的分泌蛋白及其編碼序列和醫(yī)藥用途
【專利摘要】本發(fā)明提供了具有白細(xì)胞趨化功能的SEQ?ID?NO:1所示氨基酸序列的FAM3D分泌蛋白，編碼該蛋白的多核苷酸，及含有多核苷酸的基因工程載體。還涉及藥物組合物，含有所述蛋白或多核苷酸、基因工程載體和/或宿主細(xì)胞，及藥物可接受的鹽、載體或賦形劑。還涉及體外檢測(cè)所述蛋白或多核苷酸表達(dá)水平變化的方法。所述蛋白或多核苷酸可用于預(yù)防和/或治療腫瘤轉(zhuǎn)移、腫瘤發(fā)生、炎癥反應(yīng)、肥胖和胰島素抵抗、動(dòng)脈硬化、血管損傷、病毒感染、過敏疾病、移植排斥、腦部疾病、自身免疫病、免疫調(diào)節(jié)、干細(xì)胞增殖分化、骨質(zhì)疏松癥及用于商品化試劑研究上述病狀。還涉及以所述蛋白或多核苷酸作為靶開發(fā)化合物、抗體、多肽藥物和商品化試劑。
【專利說明】具有趨化活性的分泌蛋白及其編碼序列和醫(yī)藥用途
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，特別地，本發(fā)明涉及具有多種功能的蛋白及編碼其的多核苷酸、包含多核苷酸的基因工程載體、以及相應(yīng)的藥物組合物，本發(fā)明還涉及所述蛋白和多核苷酸及其藥物組合物的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]趨化因子是一類具有趨化特性的細(xì)胞因子蛋白樣物質(zhì)，在機(jī)體內(nèi)通過激活趨化因子受體發(fā)揮對(duì)多種細(xì)胞的趨化作用，在炎癥反應(yīng)中起核心作用。他們不僅參與對(duì)白細(xì)胞招募，還可以通過上調(diào)整合素的表達(dá)，從而活化白細(xì)胞。另外，趨化因子還具有其他多效性功能，在腫瘤生長(zhǎng)的調(diào)節(jié)，免疫、循環(huán)、及神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育方面起到了重要的作用。在機(jī)體的腫瘤轉(zhuǎn)移、腫瘤發(fā)生、炎癥反應(yīng)、肥胖和胰島素抵抗、動(dòng)脈硬化、血管鈣化、心肌缺血-再灌注損傷、高血壓、心衰、病毒感染、過敏疾病、移植排斥、腦部疾病、自身免疫病、免疫調(diào)節(jié)、干細(xì)胞增殖分化、骨質(zhì)疏松癥等疾病過程中也發(fā)揮重要作用。
[0003]現(xiàn)階段世界范圍內(nèi)腫瘤的發(fā)病率和死亡率都有增加的趨勢(shì)。絕大多數(shù)腫瘤患者無法根治，復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移稱為腫瘤患者生存時(shí)間和生活質(zhì)量提高的瓶頸。而趨化因子在腫瘤發(fā)生發(fā)展的過程中所起的雙面性作用也越來越受到人們的重視，通過與其受體發(fā)生作用趨化因子在特定的為環(huán)境中可以通過影響免疫細(xì)胞從而增強(qiáng)免疫應(yīng)答，對(duì)腫瘤血管生成、腫瘤細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移能力方面有抑制作用。但同時(shí)也可直接影響腫瘤細(xì)胞本身的生長(zhǎng)、侵襲、和轉(zhuǎn)移過程。特別是最近對(duì)CXCR4的研究表明，許多人類腫瘤表達(dá)其受體。而CXCR4本身在乳腺癌、胃癌、前列腺癌、結(jié)直腸癌、及肺癌中表達(dá)有所增強(qiáng)。其可通過介導(dǎo)信號(hào)活化、聚合肌動(dòng)蛋白、誘導(dǎo)偽足形成等反應(yīng)促進(jìn)癌細(xì)胞的趨化和侵襲，從而與腫瘤的定向轉(zhuǎn)移有著密切聯(lián)系。另外，隨著趨化因子在腫瘤免疫逃逸中的作用日漸受到重視，越來越多的研究證明趨化因子可以募集免疫細(xì)胞進(jìn)入腫瘤組織調(diào)控機(jī)體免疫功能并調(diào)節(jié)腫瘤血管生成。這些都表明不僅對(duì)于腫瘤細(xì)胞本身，`趨化因子在腫瘤微環(huán)境的形成于發(fā)展中也有著不可替代的作用。如 CCL2、CCL5 可趨化 TAM ;CXCL9、CXCLlO 對(duì) T 細(xì)胞趨化，而 CCL19、CCL20、CCL21 可趨化DC。趨化因子已經(jīng)成為國(guó)內(nèi)外研究腫瘤炎癥微環(huán)境的熱點(diǎn)之一。
[0004]人類基因組框架圖完成10周年，目前的任務(wù)是闡明數(shù)以萬計(jì)的基因及其產(chǎn)物的功能，深入認(rèn)識(shí)疾病發(fā)生發(fā)展的相關(guān)基因和分子機(jī)理，發(fā)現(xiàn)疾病易感基因、抗病基因、藥物敏感基因，發(fā)現(xiàn)新的藥物作用靶點(diǎn)和新的生物技術(shù)藥物。這些工作將花費(fèi)遠(yuǎn)比基因序列分析更多的時(shí)間、更大的投入和更繁重的工作量，也更加具有挑戰(zhàn)性。
[0005]近年來，免疫療法發(fā)生了變化，從基礎(chǔ)向臨床的轉(zhuǎn)化到藥物開發(fā)成為更為重要的途徑。通過描述免疫系統(tǒng)相關(guān)趨化因子及其配體如何組織在生理和病理活動(dòng)中發(fā)揮作用，暗示趨化因子有強(qiáng)大的臨床應(yīng)用前景，可以用作免疫療法的治療靶或輔助治療劑或主要療法。
[0006]本發(fā)明人利用人類功能基因組學(xué)數(shù)據(jù)庫，生物信息學(xué)分析，分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)及免疫學(xué)技術(shù)，從人類基因數(shù)據(jù)庫中發(fā)掘具有重要生理、病理意義的新基因，為闡明疾病的發(fā)病機(jī)制、發(fā)現(xiàn)疾病標(biāo)志物、基因組藥物靶標(biāo)(開發(fā)化合物、抗體、多肽藥物)或基因工程藥物提供基礎(chǔ)。[0007]基因表達(dá)及其編碼產(chǎn)物蛋白質(zhì)表達(dá)的檢測(cè)方法包括反轉(zhuǎn)錄一聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、蛋白質(zhì)印跡、ELISA、FACS、免疫熒光、免疫組化、免疫細(xì)胞化學(xué)等檢測(cè)方法。可以應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)研究以及臨床生理和病理疾病(腫瘤轉(zhuǎn)移、腫瘤發(fā)生、炎癥反應(yīng)、肥胖和胰島素抵抗、動(dòng)脈硬化、血管鈣化、心肌缺血-再灌注損傷、高血壓、心衰、病毒感染、過敏疾病、移植排斥、腦部疾病、自身免疫病、免疫調(diào)節(jié)、干細(xì)胞增殖分化、骨質(zhì)疏松癥)中細(xì)胞和組織的基因表達(dá)及其編碼產(chǎn)物蛋白質(zhì)表達(dá)的檢測(cè)。[0008]具有重要生理、病理意義的基因及其編碼產(chǎn)物蛋白質(zhì)，可以作為藥物靶標(biāo)，開發(fā)靶向這一分子本身及其相互作用分子的化合物、抗體、多肽藥物或基因工程藥物和商品化試劑，應(yīng)用于發(fā)病機(jī)制研究，疾病標(biāo)志物的研究和臨床檢測(cè)，及研究和臨床的藥物的治療。

【發(fā)明內(nèi)容】
[0009]本發(fā)明通過篩選發(fā)現(xiàn)了新的具有趨化活性的細(xì)胞因子FAM3D。[0010]因此，本發(fā)明提供了一種具有趨化活性的蛋白，編碼所述蛋白的多核苷酸，含有所述多核苷酸的基因工程載體，含有所述蛋白、多核苷酸和/或載體的藥物組合物；另外，本發(fā)明還提供了所述蛋白或多核苷酸在制備預(yù)防和/或治療疾病的藥物中的應(yīng)用，檢測(cè)在待測(cè)樣品中所述蛋白或多核苷酸表達(dá)水平的方法，所述蛋白或多核苷酸在制備用于研究疾病的商品化試劑中的應(yīng)用，以及所述蛋白或多核苷酸或本發(fā)明蛋白的相互作用分子作為靶開發(fā)化合物、抗體、多肽藥物和商品化試劑的應(yīng)用。[0011]首先，本發(fā)明提供了一種具有趨化活性的蛋白，該蛋白包含:[0012](1)如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的蛋白I ;或[0013](2)具有與(1)所述蛋白有至少80%同源性的氨基酸序列的蛋白，[0014]該蛋白的功能與(1)所述蛋白的功能相同或相似或不同。[0015]其中，如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的蛋白，為FAM3D蛋白的186個(gè)氨基酸序列(編碼FAM3D蛋白的核酸序列在Gen-bank?的注冊(cè)登記號(hào)為匪138805.2)。在本發(fā)明中稱為FAM3D分泌蛋白。[0016]本發(fā)明蛋白還包括具有與SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列至少80%，優(yōu)選至少85%，更為優(yōu)選至少90%，更進(jìn)一步優(yōu)選至少95%，特別優(yōu)選至少98%，更為特別優(yōu)選至少99%同源性(序列匹配)的序列。這些序列可以與本發(fā)明的SEQ ID NO:1所示的序列具有相同、相似或不同的生物學(xué)功能，優(yōu)選具有相同或相似的功能。[0017]優(yōu)選地，本發(fā)明的蛋白包含:[0018](1)具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的蛋白；或[0019](2)具有與(1)所述蛋白至少90%同源性的氨基酸序列的蛋白，其功能與(I)所述蛋白的功能相同或相似或不同。[0020]另一方面，本發(fā)明還提供了一種編碼本發(fā)明的蛋白的多核苷酸，該多核苷酸包含:[0021](1)編碼SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的多核苷酸；或[0022](2)具有與⑴所述多核苷酸至少80%同源性的多核苷酸，其編碼的蛋白與⑴所述多核苷酸編碼的蛋白具有相同或相似或不同的生物學(xué)功能。
[0023]如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列為FAM3D分泌蛋白186個(gè)氨基酸序列。本發(fā)明的多核苷酸序列可以只編碼FAM3D分泌蛋白，也可以在上述蛋白的編碼序列的基礎(chǔ)上，增加非編碼序列，例如內(nèi)含子、編碼序列5’或3’端的非編碼序列等。本發(fā)明的多核苷酸序列最好是以分離形式提供的。本發(fā)明的多核苷酸是“分離”形式的，其不僅已經(jīng)與在細(xì)胞中伴隨其的蛋白質(zhì)分開，而且已從天然狀態(tài)下位于其兩側(cè)的序列中分離出來。
[0024]本發(fā)明的多核苷酸還包括具有與編碼FAM3D分泌蛋白或其片段的多核苷酸至少70%、優(yōu)選至少80%、更為優(yōu)選至少85%，更進(jìn)一步優(yōu)選至少90%、特別優(yōu)選至少95%，更為特別優(yōu)選至少98%同源性的多核苷酸。優(yōu)選地，本發(fā)明的多核苷酸為與編碼SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的多核苷酸序列或其片段具有至少80%同源性的多核苷酸，該多核苷酸編碼的蛋白與SEQ ID NO:1所示的蛋白具有相同或相似或不同的生物學(xué)功能。
[0025]另一方面，本發(fā)明還提供了一種基因工程載體，該基因工程載體含有編碼本發(fā)明的分泌蛋白的多核苷酸。所述基因工程載體可以是普通載體、表達(dá)載體等。
[0026]另一方面，本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，該藥物組合物含有本發(fā)明的蛋白、多核苷酸、載體和/或一種或多種藥物可接受的鹽或藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。
[0027]另一方面，本發(fā)明還提供了所述FAM3D分泌蛋白或編碼所述蛋白的多核苷酸在制備預(yù)防和/或治療疾病的藥物中的應(yīng)用，其中所述疾病包括腫瘤轉(zhuǎn)移、腫瘤發(fā)生、炎癥反應(yīng)、肥胖和胰島素抵抗、動(dòng)脈硬化、血管鈣化、心肌缺血-再灌注損傷、高血壓、心衰、病毒感染、過敏疾病、移植排斥、腦部疾病、自身免疫病、免疫調(diào)節(jié)、干細(xì)胞增殖分化、骨質(zhì)疏松癥。
[0028]本發(fā)明通過實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明的FAM3D分泌蛋白具有與趨化因子相當(dāng)?shù)内吇钚裕溆謥碓从谌祟惐旧?，所以FAM3D分泌蛋白在多種疾病的預(yù)防和/或治療方面具有廣闊的應(yīng)用前景。
[0029]另一方面，本發(fā)明還提供了一種體外檢測(cè)來自待測(cè)者的樣品中本發(fā)明所述的蛋白或多核苷酸的表達(dá)水平的方法。該方法為反轉(zhuǎn)錄一聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、蛋白質(zhì)印跡或ELISA、FACS、免疫熒光、免疫組化、免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)方法。
[0030]另一方面，本發(fā)明還提供了所述FAM3D分泌蛋白或編碼所述蛋白的多核苷酸在制備用于研究疾病的商品化試劑中的應(yīng)用。其中，所述疾病包括腫瘤轉(zhuǎn)移、腫瘤發(fā)生、炎癥反應(yīng)、肥胖和胰島素抵抗、動(dòng)脈硬化、血管鈣化、心肌缺血-再灌注損傷、高血壓、心衰、病毒感染、過敏疾病、移植排斥、腦部疾病、自身免疫病、免疫調(diào)節(jié)、干細(xì)胞增殖分化、骨質(zhì)疏松癥。
[0031]另一方面，本發(fā)明還提供了以本發(fā)明的蛋白或多核苷酸或本發(fā)明蛋白的相互作用分子作為靶開發(fā)化合物、抗體、多肽藥物和商品化試劑的應(yīng)用。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0032]圖1顯示利用Western Blot檢查目的蛋白FAM3D的表達(dá)，箭頭所指為表達(dá)的FAM3D蛋白，其大小約為34kD左右。A，F(xiàn)AM3D轉(zhuǎn)染細(xì)胞裂解液；B，F(xiàn)AM3D轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)上清。
[0033]圖2顯示應(yīng)用293T表達(dá)系統(tǒng)收獲上清利用PBMC趨化篩選平臺(tái)所得結(jié)果，紅色箭頭所指則為FAM3D表達(dá)上清對(duì)外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)具有明顯的趨化活性。
[0034]圖3A顯示FAM3D真核表達(dá)上清經(jīng)親和層析純化后利用SDS-PAGE分離并電轉(zhuǎn)到PVDF膜上用于N端測(cè)序，箭頭所指為FAM3D特異條帶；B顯示上?；倒綟AM3D分泌蛋白的N端測(cè)序結(jié)果的原始峰圖；C顯示上?；倒綟AM3D分泌蛋白的N端測(cè)序的正式報(bào)告。
[0035]圖4A和4B顯示FAM3D基因在16種腫瘤細(xì)胞系中的表達(dá)情況；4C顯示FAM3D在16種腫瘤細(xì)胞系表達(dá)譜所對(duì)應(yīng)的GAPDH內(nèi)參。
[0036]圖5顯示應(yīng)用正常人類組織文庫定量PCR所得FAM3D基因表達(dá)譜。
[0037]圖6顯示FAM3D在TNF α及IL-1 β刺激下在MGC803細(xì)胞系中不同時(shí)間點(diǎn)表達(dá)情況。
[0038]圖7顯示FAM3D在MGC803細(xì)胞系中表達(dá)可被NF κ B抑制劑pDTC所抑制。
[0039]圖8顯示運(yùn)用親和層析對(duì)FAM3D在293Τ真核表達(dá)系統(tǒng)上清進(jìn)行純化，純化所得FAM3D重組蛋白的SDS-PAGE電泳結(jié)果。
[0040]圖9顯示以CXCL12為陽性對(duì)照，利用趨化實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證FAM3D真核表達(dá)重組蛋白對(duì)外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)的趨化作用。
[0041]圖10顯示以CXCL12為陽性對(duì)照，驗(yàn)證FAM3D真核表達(dá)重組蛋白對(duì)未經(jīng)PHA刺激的外周血淋巴細(xì)胞(PBL)的趨化作用。
[0042]圖11顯示以CXCL12為陽性對(duì)照，驗(yàn)證FAM3D真核表達(dá)重組蛋白對(duì)ΡΗΑ20 μ g/ml刺激過夜的外周血淋巴細(xì)胞(PBL)的趨化作用。
[0043]圖12顯示以CXCL8為陽性對(duì)照，驗(yàn)證FAM3D真核表達(dá)重組蛋白對(duì)外周血多形核細(xì)胞(PMN)的趨化作用。
【具體實(shí)施方式】
[0044]以下針對(duì)前述的發(fā)明主題就一些實(shí)施方式并結(jié)合附圖進(jìn)行較為詳細(xì)的說明和描述。然而應(yīng)該理解，這些說明和描述以及后面所列的具體實(shí)施例不是用來限制本發(fā)明權(quán)利要求的范圍。
[0045]本發(fā)明構(gòu)建了FAM3D (family with sequence similarity3, member D)真核表達(dá)質(zhì)粒pCDNA3.1-FAM3D (NM138805.2) -MYC-HIS6以及293T真核表達(dá)系統(tǒng)，經(jīng)表達(dá)、純化，獲得分泌表達(dá)的FAM3D重組蛋白。分泌表達(dá)的該蛋白上清對(duì)人外周血單核細(xì)胞細(xì)胞具有趨化作用。進(jìn)一步通過親和層析純化分離上清中FAM3D蛋白，經(jīng)過SDS-PAGE并將其電轉(zhuǎn)至PVDF膜上獲取特異條帶，進(jìn)行N端測(cè)序后確定信號(hào)肽切割位點(diǎn)。利用293T真核表達(dá)系統(tǒng)獲取上清經(jīng)過純化得到重組FAM3D蛋白，重組FAM3D蛋白對(duì)外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)、外周血淋巴細(xì)胞(PBL)和外周血多形核細(xì)胞(PMN)具有趨化作用。
[0046]在本發(fā)明所提供的蛋白中，SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的蛋白，為FAM3D蛋白的C末端186個(gè)氨基酸序列(FAM3D蛋白的核酸序列在Gen-bank?的注冊(cè)登記號(hào)為匪138805.2);在本發(fā)明中稱為FAM3D分泌蛋白。本發(fā)明蛋白還包括與SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的同源性(序列匹配)超過80 %，優(yōu)選超過85 %，更為優(yōu)選超過90 %，更進(jìn)一步優(yōu)選超過95 %，特別優(yōu)選超過98 %，更為特別優(yōu)選超過99 %的序列。這些序列可以與本發(fā)明的SEQ ID N0:1所示的序列具有相同、相似或不同的生物學(xué)功能，優(yōu)選具有相同或相似的功倉泛。
[0047]本發(fā)明FAM3D分泌蛋白或其片段可以是天然的、合成的、半合成的、或者重組產(chǎn)生。本發(fā)明 FAM3D 分泌蛋白可按照 Steward 和 Young (Steward, J.Μ.和 Young, J.D., SolidPhase Peptide Synthesis,2nd Ed., Pierce Chemical Company, Rockford, 111., (1984))描述的方法用Applied Biosystem合成儀或Pioneer?肽合成儀按固相化學(xué)技術(shù)合成。一般，這些方法包括向成長(zhǎng)的肽鏈上依次添加一個(gè)或多個(gè)氨基酸或適當(dāng)保護(hù)的氨基酸。通常，第一個(gè)氨基酸的氨基或羧基用適當(dāng)?shù)谋Ｗo(hù)基保護(hù)，然后將保護(hù)的氨基酸連在惰性固相載體上，隨后在適于形成酰胺鍵的條件下加入相應(yīng)氨基或羧基被適當(dāng)保護(hù)的序列中的下一個(gè)氨基酸。然后從新加入的氨基酸殘基上除去保護(hù)基，再加入必要時(shí)適當(dāng)保護(hù)的下一個(gè)氨基酸，如此重復(fù)操作。當(dāng)所有氨基酸以正確的順序連接后，相繼或同時(shí)除去任何剩余的保護(hù)基和固相支持物，得到最終的蛋白。通過簡(jiǎn)單修改此標(biāo)準(zhǔn)程序，可能一次向成長(zhǎng)鏈添加一個(gè)以上的氨基酸。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，使用自動(dòng)合成儀制備本發(fā)明的蛋白。其中使用α氨基被酸或堿敏感性基團(tuán)保護(hù)的氨基酸。這種保護(hù)基應(yīng)該在肽鍵形成條件下穩(wěn)定，又容易除去而不破壞成長(zhǎng)的肽鏈、不會(huì)引起其中的任何手性中心外消旋。適當(dāng)?shù)谋Ｗo(hù)基有9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)、叔丁氧羰基(Boc)、節(jié)氧羰基(Cbz)、2-氰基叔丁氧羰基等。9-荷基甲氧基羰基(Fmoc)是合成本發(fā)明肽特別優(yōu)選的。也可按常規(guī)的生物工程方法由宿主細(xì)胞中的重組DNA序列編碼產(chǎn)生本發(fā)明的蛋白(具體參見實(shí)施例1 一 4)。在實(shí)施例1 一 4中， 申請(qǐng)人:將FAM3D編碼序列插入表達(dá)系統(tǒng)，經(jīng)表達(dá)、純化，獲得分泌表達(dá)的FAM3D重組蛋白，進(jìn)一步通過SDS-PAGE分離獲得FAM3D蛋白條帶，進(jìn)行N端測(cè)序，得到本發(fā)明的蛋白。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知，可以直接使用編碼本發(fā)明的蛋白的多核苷酸序列產(chǎn)生本發(fā)明的FAM3D分泌蛋白，例如將編碼本發(fā)明的蛋白的多核苷酸序列(如SEQ ID NO:1所述的序列或其片段)直接插入表達(dá)系統(tǒng)，經(jīng)表達(dá)、純化，獲得本發(fā)明的蛋白。或者可使用衍生于本發(fā)明的DNA構(gòu)建體的mRNA，在無細(xì)胞翻譯系統(tǒng)中產(chǎn)生所需的蛋白。
[0048]本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知，本發(fā)明所述的蛋白或其片段可以同其它的蛋白或其片段形成融合蛋白。其它蛋白或其片段一般是已知的，有些可以以載體形式購買得到，或者可以按常規(guī)方法合成或從已知生物體中克隆得到。
[0049]如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列為FAM3D分泌蛋白186個(gè)氨基酸序列。本發(fā)明的多核苷酸序列可以只編碼FAM3D分泌蛋白，也可以在上述蛋白的編碼序列的基礎(chǔ)上，增加非編碼序列，例如內(nèi)含子、編碼序列5’或3’端的非編碼序列等。本發(fā)明的多核苷酸序列最好是以分離形式提供的。本發(fā)明的多核苷酸是“分離”形式的，其不僅已經(jīng)與在細(xì)胞中伴隨其的蛋白質(zhì)分開，而且已從天然狀態(tài)下位于其兩側(cè)的序列中分離出來。
[0050]本發(fā)明還包括與編碼FAM3D分泌蛋白或其片段的多核苷酸至少70%、優(yōu)選至少80%、更為優(yōu)選至少85%，更進(jìn)一步優(yōu)選至少90%、特別優(yōu)選至少95%，更為特別優(yōu)選至少98%同源性的多核苷酸序列。特別涉及在嚴(yán)格條件下與FAM3D分泌蛋白的多核苷酸雜交的多核苷酸，所說的“嚴(yán)格條件”意指發(fā)生雜交的前提是序列間至少具備95%的同源性。這樣的序列可以是天然存在或人工產(chǎn)生的，可以包括FAM3D分泌蛋白的多核苷酸序列的等位基因變異體、也可以包括FAM3D分泌蛋白多核苷酸序列中堿基的缺失、插入及置換。這樣的序列編碼的蛋白可以在功能上與本發(fā)明的FAM3D分泌蛋白相同、相似、或不同，但最好是編碼與FAM3D分泌蛋白的生物學(xué)活性基本相同的蛋白。因此，優(yōu)選與編碼SEQ ID N0:1所示氨基酸序列的多核苷酸序列或其片段具有至少80%同源性的多核苷酸，該多核苷酸編碼的蛋白與SEQ ID NO:1所示的蛋白具有相同或相似或不同的生物學(xué)功能。
[0051]本發(fā)明的多核苷酸序列可以是DNA或RNA，其中DNA包括cDNA、基因組DNA以及合成的DNA，DNA可以是雙鏈或是單鏈形式，單鏈DNA可以是編碼鏈或是非編碼鏈(反義鏈)。本發(fā)明所述的反義鏈可以為如SEQID NO:1所示的序列的互補(bǔ)序列。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知，反義鏈或者其一部分(反義寡核苷酸)可用于抑制細(xì)胞內(nèi)本發(fā)明FAM3D分泌蛋白的表達(dá)。本發(fā)明的FAM3D分泌蛋白的核苷酸序列可以來自任何物種，特別是哺乳動(dòng)物，包括牛、羊、豬、鼠、馬，優(yōu)選人類。
[0052]如SEQ ID NO:1所示的多核苷酸序列為一種編碼本發(fā)明蛋白的多核苷酸，其來自人類。所以，優(yōu)選本發(fā)明的多核苷酸包含如SEQ ID NO:1所示的多核苷酸或其互補(bǔ)序列。
[0053]本發(fā)明所涉及的基因工程載體含有編碼本發(fā)明的分泌蛋白的多核苷酸。所述基因工程載體可以是普通載體、表達(dá)載體等。其中普通載體主要用于各種基因組文庫和cDNA文庫的建立，它們通常含有兩個(gè)或兩個(gè)以上的標(biāo)記基因，其中一個(gè)基因用于選擇轉(zhuǎn)化體(transformant),另一基因則是用于檢查載體中是否有外源DNA插入。表達(dá)載體主要用于研究基因的表達(dá)或是用于大量生產(chǎn)一些有用的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物或蛋白質(zhì)，有的也可用于cDNA文庫的建立。這類載體除具有普通型載體的特征外，還應(yīng)含有適當(dāng)?shù)膯?dòng)子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、終止子等。為了便于表達(dá)產(chǎn)物在細(xì)胞中定位，在蛋白編碼序列上游可加入適當(dāng)?shù)那皩?dǎo)序列。
[0054]合適載體和啟動(dòng)子的選擇為本領(lǐng)域普通技術(shù)人員周知。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員周知用于構(gòu)建含有本發(fā)明的多核苷酸以及合適的轉(zhuǎn)錄及翻譯調(diào)控元件之載體的方法。具體地說，適用于原核細(xì)胞的市售表達(dá)載體一般均帶有可選擇標(biāo)志和細(xì)胞復(fù)制原點(diǎn)，帶有l(wèi)acl、T7、APL和trp等細(xì)菌啟動(dòng)子，以及已知克隆載體pBR322(ATCC 37017)的其他遺傳元件。這樣的市售載體包括pGEM (Promega)和pKK223_3 (Pharmacia)?？筛鶕?jù)所選用的適當(dāng)啟動(dòng)子和待表達(dá)的結(jié)構(gòu)基因序列來選擇衍生于PBR322的適當(dāng)載體。GST原核表達(dá)系統(tǒng)也可用于本發(fā)明。適用于真核細(xì)胞的載體帶有真核細(xì)胞啟動(dòng)子如CMV、SV40等，這樣的載體包括pMT-hIL-3(馬大龍 ，狄春輝，龐健等(1991)高技術(shù)通訊11:26-29)、pQE_9 (Qiagen)、pDIO、pNH18A (Stratagene)、pKK233_3、pDR540、pRIT5 (Pharmacia),以及 pcDNA3、pC1、pffLNE0>pSG(Stratagene)、pSVL(Pharmacia)。在本發(fā)明的實(shí)施例1中FAM3D編碼序列插入pCDNA3.l-myc-his6 (Invitrogen 公司)表達(dá)載體，構(gòu)建 pCDNA3.l-FAM3D-myc_his6 表達(dá)質(zhì)粒。
[0055]本發(fā)明所提供的藥物組合物，可以包含本發(fā)明的蛋白、編碼本發(fā)明蛋白的多核苷酸、含有所述多核苷酸的基因工程載體和/或宿主細(xì)胞，另外，除了上述活性成分之外，還可以包含一種或多種藥物可接受的鹽或藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。這些藥物可接受的鹽或藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑的選用取決于，例如藥物的施用途徑。
[0056]本發(fā)明通過實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明的FAM3D分泌蛋白能夠用于制備預(yù)防和/或治療瘤轉(zhuǎn)移、腫瘤發(fā)生、炎癥反應(yīng)、肥胖和胰島素抵抗、動(dòng)脈硬化、血管鈣化、心肌缺血-再灌注損傷、高血壓、心衰、病毒感染、過敏疾病、移植排斥、腦部疾病、自身免疫病、免疫調(diào)節(jié)、干細(xì)胞增殖分化、骨質(zhì)疏松癥等疾病的藥物。
[0057]早期研究發(fā)現(xiàn)，趨化因子和趨化因子受體在介導(dǎo)急慢性驗(yàn)證過程中起重要作用。近期研究表明趨化因子和趨化因子受體在生長(zhǎng)發(fā)育；穩(wěn)態(tài)的維持；骨質(zhì)疏松癥、肥胖和胰島素抵抗、動(dòng)脈粥樣硬化、血管鈣化、心肌缺血-再灌注損傷、高血壓、心衰等心血管疾?。徊《靖腥?；免疫應(yīng)答；骨髓主細(xì)胞的遷移以及自身免疫病等病理生理過程中發(fā)生重要的作用。晚近的研究也表明，趨化因子和趨化因子受體在腫瘤發(fā)生、發(fā)展以及轉(zhuǎn)移的過程中扮演重要的角色。
[0058]瘤轉(zhuǎn)移、腫瘤發(fā)生、炎癥反應(yīng)、肥胖和胰島素抵抗、動(dòng)脈硬化、血管鈣化、心肌缺血-再灌注損傷、高血壓、心衰、病毒感染、過敏疾病、移植排斥、腦部疾病、自身免疫病、免疫調(diào)節(jié)、干細(xì)胞增殖分化、骨質(zhì)疏松癥等疾病與趨化因子及其受體密切相關(guān)，激動(dòng)劑的脫敏作用，中和抗體等是針對(duì)藥物靶標(biāo)的主要治療手段。本發(fā)明通過實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明的FAM3D分泌蛋白具有與趨化因子相當(dāng)?shù)内吇钚?，而其又來源于人類本身，所以FAM3D分泌蛋白在多種疾病的預(yù)防和/或治療方面具有廣闊的應(yīng)用前景。
[0059]本發(fā)明還提供本發(fā)明的FAM3D分泌蛋白在制備商品化試劑研究瘤轉(zhuǎn)移、腫瘤發(fā)生、炎癥反應(yīng)、肥胖和胰島素抵抗、動(dòng)脈硬化、血管鈣化、心肌缺血-再灌注損傷、高血壓、心衰、病毒感染、過敏疾病、移植排斥、腦部疾病、自身免疫病、免疫調(diào)節(jié)、干細(xì)胞增殖分化、骨質(zhì)疏松癥等疾病的應(yīng)用。
[0060]本發(fā)明還提供一種體外檢測(cè)來自待測(cè)者的樣品中本發(fā)明所述的蛋白或多核苷酸的表達(dá)水平的方法，該方法 為反轉(zhuǎn)錄一聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)或蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)方法。
[0061]可以采用本領(lǐng)域已知的任何方法檢測(cè)本發(fā)明所述的蛋白或多核苷酸的表達(dá)水平。優(yōu)選利用反轉(zhuǎn)錄一聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)檢測(cè)所述多核苷酸在核酸水平的表達(dá)水平；或利用特異性單克隆或多克隆抗體檢測(cè)所述多核苷酸在蛋白質(zhì)水平的表達(dá)水平，例如或蛋白質(zhì)印跡(Western blotting)檢測(cè)方法。所述待測(cè)樣品可以從來自受試者的細(xì)胞獲得,如來自血液、尿、唾液、胃液、頭發(fā)，活組織檢查和尸體解剖材料的細(xì)胞。PT - PCR主要分以下步驟:提取總RNA，加入一個(gè)與mRNA3’端互補(bǔ)的引物，在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下合成cDNA ;第二步是以cDNA為模板，再加入與cDNA互補(bǔ)的另一引物(兩引物位于不同的外顯子上，以避免基因組DNA污染)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。蛋白質(zhì)印跡主要分三階段:第一階段為抗原等蛋白樣品進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳；第二階段為電轉(zhuǎn)移:將在凝膠中已分離的條帶轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上；第三階段為顯色檢測(cè):硝酸纖維素膜(相當(dāng)于包被了抗原的固相載體)，依次與特異性抗體和酶標(biāo)第二抗體作用后，加入能形成顯色物的酶反應(yīng)底物，使條帶染色。標(biāo)記二抗的酶包括辣根過氧化物酶(horseradish Peroxidase, HRP)和堿性磷酸酶(alkalinephosphatease, AP)。也可以使用葡萄糖氧化酶，β _D_半乳糖苷酶和脲酶等。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，采用辣根過氧化物酶作為標(biāo)記二抗的酶。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知，針對(duì)不同的酶，可使用不同的底物，HRP作用的底物包括，但不限于臨苯二胺(0PD)、四甲基聯(lián)苯胺(TMB)和ABTS等。堿性磷酸酶的底物一般采用對(duì)硝基苯磷酸酯(p-NPP)，AP也有發(fā)熒光底物(磷酸4-甲基傘酮)。常用的酶標(biāo)第二抗體已有市售。
[0062]本發(fā)明還提供本發(fā)明的FAM3D分泌蛋白在或多核苷酸或FAM3D的相互作用分子作為靶開發(fā)化合物、抗體、多肽藥物和商品化試劑的應(yīng)用。
[0063]實(shí)施例
[0064]實(shí)施例1、構(gòu)建pcDNA3.l-FAM3D-myc_his6融合蛋白表達(dá)質(zhì)粒
[0065]構(gòu)建pcDNA3.l-FAM3D-myc_his6 質(zhì)粒，用于表達(dá) FAM3D-myc_his6 融合蛋白。
[0066]—、方法:
[0067]將FAM3D 編碼序列(SEQ ID NO:2 插入 pcDNA3.l-myc_his6 (Invitrogen 公司)表達(dá)載體，構(gòu)建pcDNA3.l-FAM3D-myc-his6表達(dá)質(zhì)粒。測(cè)序驗(yàn)證質(zhì)粒的正確性后，進(jìn)行質(zhì)粒擴(kuò)增，用Axygen質(zhì)粒大提試劑盒提取質(zhì)粒,用于細(xì)胞轉(zhuǎn)染。
[0068]二、結(jié)果:
[0069]經(jīng)DNA測(cè)序編碼區(qū)序列正確。
[0070]實(shí)施例2、質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞獲得FAM3D表達(dá)上清
[0071]一、方法:
[0072]HEK293T細(xì)胞調(diào)成6 X IO5細(xì)胞/2ml濃度在6孔板中37°C 5%C02培養(yǎng)24小時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，pCDNA3.l-FAM3D-myc-his6 DNA 2 μ g，vigofect (威格拉斯生物技術(shù)有限公司)2 μ 1，混合液慢慢滴入準(zhǔn)備好的細(xì)胞中，同時(shí)設(shè)pcDNA3.l-myc-his6空載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞對(duì)照，6小時(shí)后換無血清培養(yǎng)基HEKG，37°C培養(yǎng)48小時(shí)，收獲轉(zhuǎn)染后的上清。
[0073]利用Western Blotting檢查目的蛋白的表達(dá):
[0074]經(jīng)12.5%SDS-PAGE電泳，用IXCaps電轉(zhuǎn)液將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，加入Ant1-c-myc抗體(MBL公司)作用后，再加入IRDyeTM 800標(biāo)記的抗鼠IgG (LICORBioscience),采用 Odyssey Imaging System 檢測(cè)系統(tǒng)直接檢測(cè)。
[0075]二、結(jié)果:
[0076]利用Western Blot檢查目的蛋白的表達(dá):
[0077]結(jié)果請(qǐng)參見圖1所示。加入Ant1-c-myc抗體作用后，再加入IRDyeTM800標(biāo)記的抗鼠IgG 二抗反應(yīng),經(jīng)Odysse`y Imaging System掃描,在圖A (細(xì)胞裂解液)及圖B (上清)34kD箭頭所指處有一條清晰條帶。
[0078]實(shí)施例3、人外周血單個(gè)核細(xì)胞的分離:
[0079]一、方法:
[0080]濃縮白細(xì)胞由北京市血液中心提供，采用淋巴細(xì)胞分離液(上海華精生物高科技有限公司)獲得人外周血單個(gè)核細(xì)胞。用含10%熱滅活的胎牛血清、100U/ml青霉素、100 μ g/ml 鏈霉素的 RPMI 1640 (Life Technologies, Inc.)培養(yǎng)。
[0081]二、結(jié)果:
[0082]獲得人外周血單個(gè)核細(xì)胞，進(jìn)行體外培養(yǎng)備用。
[0083]實(shí)施例4、FAM3D轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)上清的趨化功能
[0084]一、方法:
[0085]FAM3D轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)上清的趨化功能檢測(cè):趨化實(shí)驗(yàn)在48孔的趨化小室(Neutroprobe ; Cab in John, MD, U.S.A.)里進(jìn)行。用作趨化檢測(cè)的加到小室的下孔里(28 μ I/孔)，然后用!fepes RPMI 1640稀釋后同樣的培養(yǎng)基重懸為I X IO6個(gè)細(xì)胞/ml，加到小室的上孔中(55 μ I/孔)，上下孔用無聚乙烯吡咯烷酮的聚碳酸酯濾膜相隔，使用濾膜孔徑為3 μ m。將小室放入培養(yǎng)箱37°C，5%C02，孵育3h。趨化結(jié)束時(shí)吸取小室下孔的細(xì)胞使用 luciferase-containing reagent Cell-Titer Glo (Promega)測(cè)量其化學(xué)發(fā)光值反應(yīng)細(xì)胞計(jì)數(shù)值。轉(zhuǎn)染pcDNA3.1空載體轉(zhuǎn)染上清作為陰性對(duì)照。
[0086]趨化指數(shù)Cl為遷移細(xì)胞數(shù)除以對(duì)照組細(xì)胞數(shù)。所有實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。CI>2有顯著性意義。
[0087]二、結(jié)果:
[0088]如圖2所示，F(xiàn)AM3D轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)上清(圖中箭頭所指198號(hào))對(duì)PBMC具有趨化作用。[0089]實(shí)施例5、FAM3D-myc-his6蛋白質(zhì)的純化與N端測(cè)序
[0090]一、方法:
[0091]將HEK293T細(xì)胞消化離心后調(diào)成1.5X IO7細(xì)胞密度接種在直徑為150mm平皿中，同時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。pcDNA3.l-FAM3D-myc-his6 DNA12.5μ g, PEI (威格拉斯生物技術(shù)有限公司)50μ g,混合液慢慢滴入準(zhǔn)備好的細(xì)胞中，同時(shí)設(shè)pcDNA3.l-myc_his6空載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞對(duì)照，16小時(shí)后換無血清培養(yǎng)基HEKG，370C 5%C02培養(yǎng)48小時(shí)，收獲轉(zhuǎn)染后的上清。2000rpm/min, 10 分鐘，0.22 μ m 濾膜過濾。取 Ni Sepharose 6 Fast Flow (GE healthcare)柱料，20倍體積水平衡，5mM咪唑500mM NaCl平衡液平衡，上清過柱后先用雜蛋白洗液洗柱，再用含IM咪唑的蛋白洗液洗脫。經(jīng)過純化，洗脫后樣品經(jīng)12.5%SDS-PAGE電泳轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用考馬斯亮蘭染色，甲醇/冰乙酸脫色后裁下與Western blot檢測(cè)陽性位置相同的帶進(jìn)行蛋白質(zhì)的N端測(cè)序(委托上?；瞪锛夹g(shù)有限公司測(cè)序)。
[0092]二、結(jié)果:
[0093]如圖3A所示，純化后的蛋白質(zhì)樣品經(jīng)12.5%SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)移至PVDF膜(黑色箭頭所示)。FAM3D-myc-his在34kd處有一條清晰條帶；送至上?；瞪锛夹g(shù)有限公司進(jìn)行N端測(cè)序。圖3B為報(bào)告，顯不蛋白質(zhì)的N端測(cè)序結(jié)果均為W-L-A-A-S-P-T-K-E-1。
[0094]實(shí)施例6、FAM3D在腫瘤細(xì)胞系的表達(dá)譜
[0095]一、方法:
[0096]利用TRIZOL (SIGMA公司)試劑完成在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的16種細(xì)胞中RNA提取，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Invitrogen)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄并以 FAM3D 上游 Fl (5 ’ GCCCTCATCTTTGCCATAGTCA3 ’(SEQ ID NO:3))，下游 Rl (5’ AGAGTTTCCTGCTTTCATCGTTC3’ (SEQ ID NO:4))為引物，擴(kuò)增40輪PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%的瓊脂糖膠電泳后EB染色通過UV拍攝。
[0097]二、結(jié)果:`
[0098]如圖4A所示:第I泳道為分子量標(biāo)準(zhǔn)；第2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14泳道分別是人腫瘤細(xì)胞系分別是AGS、KYSE410、KYSE510、SGC7901、L02、MCG803、BGC823、HEPG2、U20S、HT29、LNcap, DU145、JURKAT。如圖 4B 所示:第一泳道為分子量標(biāo)準(zhǔn)；第2、3、4泳道分別是人腫瘤細(xì)胞系RAJ1、K562、THPl以上16種人類腫瘤細(xì)胞系是以 FAM3D(Fl, Rl)(圖 4A) ;G3PDH 的 Fl (5，ACCACAGTCCATGCCATCAC3’ (SEQ ID NO:5)), R2(5，TCCACCACCCTGTTGCTGTA3’ (SEQ ID NO:6))(圖 4B)為引物進(jìn)行的 RT-PCR0 結(jié)果顯示:FAM3D在多種腫瘤細(xì)胞系中表達(dá)量較高，如MCG803、BGC823、SGC7901、HEPG2等，與后續(xù)試驗(yàn)中人類正常對(duì)應(yīng)組織的表達(dá)量相比較可看出，F(xiàn)AM3D是一個(gè)腫瘤高表達(dá)基因，可能參與了腫瘤的發(fā)生發(fā)展。
[0099]實(shí)施例7、FAM3D在正常組織表達(dá)譜
[0100]一、方法:
[0101]人類各組織cDNA文庫購自Clontech公司。利用ABI PCR擴(kuò)增儀進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)。所有的cDNA模板均稀釋100倍，在20 μ I的實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增體系中，加入8 μ I稀釋的cDNA模板及相應(yīng)的引物，cDNA首先在95°C變性10分鐘，然后按照95°C 15秒，600C I分鐘的條件進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增β -actin作為系統(tǒng)內(nèi)參。探針法擴(kuò)增條件為50°C 2分鐘，95°C變性10分鐘，然后按照95°C 15秒，60°C I分鐘，40輪，擴(kuò)增GAPDH作為系統(tǒng)內(nèi)參。實(shí)時(shí)定量 PCR 反應(yīng)中所用引物序列為 FAM3D F: 5 ’ GTAAAAGCCCCTTTGAGCAGT3 ’ (SEQ ID NO:7)R:5’GGCCATCCCTCGTATTTGT3’ (SEQ ID NO:8)。
[0102]二、結(jié)果:
[0103]如圖5所示在正常組織中可見除扁桃體高表達(dá)、肺部、胰腺、淋巴結(jié)較高表達(dá)外，其余組織均低表達(dá)。
[0104]實(shí)施例8、在MGC803細(xì)胞上TNF a /IL-1刺激FAM3D表達(dá)上調(diào)
[0105]一、方法:[0106]將TNFa /IL-1以10ng/ml的濃度在無菌條件下加入處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的野生型MCG803細(xì)胞中，并與處理后的3、6、9、12小時(shí)分別利用TRIZOL(SIGMA公司)試劑完成細(xì)胞中RNA提取,利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Invitrogen)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄并進(jìn)行PCR。
[0107]二、結(jié)果:
[0108]如圖5所不:第I泳道為分子量標(biāo)準(zhǔn)；第2、3、4、5泳道是分別以TNF a 10ng/ml分別刺激12h、9h、6h、3h的逆轉(zhuǎn)錄cDNA為模板，第6道為未處理細(xì)胞逆轉(zhuǎn)錄cDNA為模板，第7、8、9、10是分別以IL-1 10ng/ml分別刺激3h、6h、9h、12h的逆轉(zhuǎn)錄cDNA為模板并以FAM3D Fl(5’GCCCTCATCTTTGCCATAGTCA3’ (SEQ ID NO:3)),Rl (5’ AGAGTTTCCTGCTTTCATCGTTC3，(SEQ ID NO:4)) ;G3PDH 的 Fl (5，ACCACAGTCCATGCCATCAC3’ (SEQ ID NO:5)) , R2(5，TCCACCACCCTGTTGCTGTA3’ (SEQ ID NO:6))為引物進(jìn)行的 RT-PCR，其中 PCR 輪數(shù)為 35輪。RT-PCR結(jié)果顯示:FAM3D在未刺激中細(xì)胞中沒有檢測(cè)到明顯表達(dá)，而FAM3D在TNFa/IL-1刺激后表達(dá)增加，其中在刺激6小時(shí)表達(dá)達(dá)到高峰。
[0109]實(shí)施例9、MGC803細(xì)胞FAM3D表達(dá)受NF κ B調(diào)控
[0110]—、方法:
[0111]將NF-κ B 抑制劑 F1DTC(Pyrrc)Iidine dithiocarbamate, Sigma)以 10 μ M 或50 μ M的濃度于MGC803對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)加入并設(shè)置未處理的對(duì)照組，24小時(shí)后收獲細(xì)胞利用TRIZOL(SIGMA公司)試劑完成細(xì)胞中RNA提取，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Invitrogen)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄并進(jìn)行PCR。
[0112]二、結(jié)果:
[0113]如圖7顯示與未處理組相比，PDTC導(dǎo)致的NFk B抑制可顯著下調(diào)FAM3D的表達(dá)，與實(shí)施例9相印證提示FAM3D或?yàn)門NF- α或IL-1 β激活的NF κ B通路調(diào)控其表達(dá)。
[0114]實(shí)施例10、FAM3D-myc_his6真核蛋白質(zhì)的純化
[0115]一、方法:
[0116]將HEK293T細(xì)胞消化離心后調(diào)成1.5X IO7細(xì)胞密度接種在直徑為150mm平皿中，同時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。pcDNA3.l-FAM3D-myc-his6 DNA12.5μ g, PEI (威格拉斯生物技術(shù)有限公司)50μ g,混合液慢慢滴入準(zhǔn)備好的細(xì)胞中，同時(shí)設(shè)pcDNA3.l-myc_his6空載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞對(duì)照，16小時(shí)后換無血清培養(yǎng)基HEKG，37°C 5%C02培養(yǎng)96小時(shí)，收獲轉(zhuǎn)染后的上清。2000rpm/min, 10 分鐘，0.22 μ m 濾膜過濾。取 Ni Sepharose 6 Fast Flow (GE healthcare)柱料，20倍體積水平衡，5mM咪唑500mM NaCl平衡液平衡，上清過柱后先用雜蛋白洗液洗柱，再分別用含10mM、20mM、50mM等梯度咪唑分別用5_10個(gè)柱體積的洗液洗雜蛋白。最后用500mM咪唑洗脫目的蛋白。
[0117]二、結(jié)果:
[0118]如圖8所示，純化后的蛋白質(zhì)樣品經(jīng)12.5%SDS-PAGE電泳，直接考馬斯亮藍(lán)染色。圖中用箭頭指示的FAM3D-his6為目的蛋白條帶。
[0119]實(shí)施例11、純化真核蛋白FAM3D對(duì)PBMC的趨化作用
[0120]一、方法:
[0121]FAM3D真核蛋白的趨化功能檢測(cè):趨化實(shí)驗(yàn)在48孔的趨化小室(Neutroprobe ；Cabin John, MD，U.S.A.)里進(jìn)行。用作趨化檢測(cè)的上清加到小室的下孔里(28 μ I/孔)，然后用!fepes RPMI 1640稀釋后同樣的培養(yǎng)基重懸為I X IO6個(gè)細(xì)胞/ml，加到小室的上孔中(55 μ I/孔)，上下孔用無聚乙烯吡咯烷酮的聚碳酸酯濾膜相隔，PBMC使用濾膜孔徑為3 μ m。將小室放入培養(yǎng)箱37°C，5%C02，孵育4h及5h。趨化結(jié)束時(shí)吸取小室下孔的細(xì)胞使用 luciferase-containing reagent Cell-Titer Glo (Promega)測(cè)量其化學(xué)發(fā)光值反應(yīng)細(xì)胞計(jì)數(shù)值。以下孔加1640為陰性對(duì)照，CXCL12為陽性對(duì)照。PBMC由利用淋巴細(xì)胞分離液(上海華精生物高科技有限公司)獲得。 [0122]二、結(jié)果:
[0123]如圖9所示，F(xiàn)AM3D真核蛋白對(duì)PBMC具有趨化作用。其在200ng/ml的作用濃度下作用最為明顯。
[0124]實(shí)施例12、純化真核蛋白FAM3D對(duì)PBL的趨化作用
[0125]一、方法:
[0126]按實(shí)施例11所述方法進(jìn)行趨化實(shí)驗(yàn)，收取4.5h及5h這兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)，并以CXCL12為陽性對(duì)照。PBL由利用淋巴細(xì)胞分離液(上海華精生物高科技有限公司)獲得人外周血單個(gè)核細(xì)胞采用貼壁法分離而得，分為兩組，其中一組加PHA20ug/ml處理過夜作為PBL細(xì)胞激活組，未處理組作為對(duì)照。第二天按上述方法進(jìn)行趨化實(shí)驗(yàn)觀察PBL對(duì)FAM3D引起的趨化運(yùn)動(dòng)能力的不同。
[0127]趨化指數(shù)Cl為遷移細(xì)胞數(shù)除以對(duì)照組細(xì)胞數(shù)。CI>2有顯著性意義。
[0128]二、結(jié)果:
[0129]如圖10、11所示，F(xiàn)AM3D真核蛋白對(duì)PBL具有趨化作用。其在2000ng/ml的作用濃度下作用最為明顯，與CXCL12活性濃度相似。其中PHA未處理PBL組(圖10)PHA處理PBL組(圖11)趨化指數(shù)與CXCL12相似。
[0130]實(shí)施例13、純化真核蛋白FAM3D對(duì)PMN的趨化作用
[0131]—、方法:
[0132]按實(shí)施例11所述方法進(jìn)行趨化實(shí)驗(yàn)，趨化時(shí)間為30min，以CXCL8為陽性對(duì)照。PMN由利用淋巴細(xì)胞分離液(上海華精生物高科技有限公司)及SIGMA公司的HIST0PAQUE-1119按說明書所示聯(lián)合應(yīng)用獲得。
[0133]二、結(jié)果:
[0134]如圖12所示，F(xiàn)AM3D真核蛋白對(duì)PMN具有趨化作用。其在200ng/ml的作用濃度下作用最為明顯，與IL-8活性濃度相似。提示FAM3D可能在募集中性粒細(xì)胞至炎癥部位的過程中發(fā)揮相應(yīng)功能。
[0135]本文通過一些具體的實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了說明，而且為了描述的目的還針對(duì)許多細(xì)節(jié)進(jìn)行了描述。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，本發(fā)明可以包括一些其它的【具體實(shí)施方式】，也可以在不偏離本發(fā)明主旨的情況下針對(duì)所披露的
【發(fā)明內(nèi)容】
進(jìn)行適當(dāng)?shù)恼{(diào)整和變化。
【權(quán)利要求】
1.一種具有趨化活性的蛋白，其包含: (1)如SEQID NO:1所示的氨基酸序列的蛋白；或 (2)具有與(I)所述蛋白有至少80%同源性的氨基酸序列的蛋白，其與(I)所述蛋白具有相同或相似或不同的生物學(xué)功能。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛋白，其包含: (1)具有SEQID NO:1所不的氣基酸序列的蛋白；或 (2)具有與(I)所述蛋白有至少90%同源性的氨基酸序列的蛋白，其與(I)所述蛋白具有相同或相似或不同的生物學(xué)功能。
3.一種多核苷酸，其包含: (1)編碼SEQID NO:1所示氨基酸序列的多核苷酸；或 (2)具有與(I)所述多核苷酸有至少80%同源性的多核苷酸，其編碼的蛋白與(I)所述多核苷酸編碼的蛋白具有相同或相似或不同的生物學(xué)功能。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的多核苷酸，其包含具有SEQID NO:1所示的多核苷酸序列或其互補(bǔ)序列。
5.一種基因工程載體，其含有根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的多核苷酸。
6.一種藥物組合物，其含有權(quán)利要求1或2所述的蛋白、編碼所述蛋白的多核苷酸、含有所述多核苷酸的載體，和/或一種或多種藥物可接受的鹽或藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。
7.一種使用如權(quán)利要求1或2所述的蛋白或編碼所述蛋白的多核苷酸在制備用于預(yù)防和/或治療疾病的藥物中的應(yīng)用，所述疾病包括腫瘤轉(zhuǎn)移、腫瘤發(fā)生、炎癥反應(yīng)、肥胖和胰島素抵抗、動(dòng)脈硬化、血管鈣化、心肌缺血-再灌注損傷、高血壓、心衰、病毒感染、過敏疾病、移植排斥、腦部疾病、自身免疫病、免疫調(diào)節(jié)、干細(xì)胞增殖分化、骨質(zhì)疏松癥。
8.—種體外檢測(cè)來自待測(cè)者的樣品中權(quán)利要求1或2所述的蛋白或編碼所述蛋白的多核苷酸表達(dá)水平的方法。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，所述方法為反轉(zhuǎn)錄一聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)或蛋白質(zhì)印跡、ELISA、FACS、免疫熒光、免疫組化、免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)方法。
10.一種根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的蛋白或編碼所述蛋白的多核苷酸在制備用于研究疾病的商品化試劑中的應(yīng)用，其中所述疾病包括腫瘤轉(zhuǎn)移、腫瘤發(fā)生、炎癥反應(yīng)、肥胖和胰島素抵抗、動(dòng)脈硬化、血管鈣化、心肌缺血-再灌注損傷、高血壓、心衰、病毒感染、過敏疾病、移植排斥、腦部疾病、自身免疫病、免疫調(diào)節(jié)、干細(xì)胞增殖分化、骨質(zhì)疏松癥。
11.一種根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的蛋白及其相互作用分子，或/和編碼所述蛋白多核苷酸作為靶開發(fā)化合物、抗體、多肽藥物和商品化試劑的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103626865SQ201210303204
【公開日】2014年3月12日 申請(qǐng)日期:2012年8月23日 優(yōu)先權(quán)日:2012年8月23日
【發(fā)明者】王應(yīng), 馬大龍, 徐恩泉, 張焱, 裴曉磊, 張穎妹, 莫曉寧, 郭嫦媛, 孫倩穎, 綦輝, 張揚(yáng), 馬靖, 陳迪新, 彭新建, 王平章, 郭帥, 石太平 申請(qǐng)人:北京大學(xué)