痛風(fēng)易感基因無創(chuàng)檢測(cè)試劑盒（apoe等基因）的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種基于APOE等基因的痛風(fēng)易感性無創(chuàng)檢測(cè)試劑盒。該試劑盒包括檢測(cè)MTHFR基因上C677T（rs1801133）、SLC22A12基因上的C258T（rs3825016）、APOE基因上ε2ε3ε4（rs429358）的3個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)基因型的特異性引物與DNA測(cè)序引物、PCR反應(yīng)組件、PCR產(chǎn)物純化組件、DNA測(cè)序反應(yīng)組件等。本試劑盒通過檢測(cè)與痛風(fēng)發(fā)生密切相關(guān)的3個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的基因型來評(píng)估受檢者痛風(fēng)患病的風(fēng)險(xiǎn)級(jí)別，并最終根據(jù)每一位受檢者的基因檢測(cè)結(jié)果從基因?qū)用嬷笇?dǎo)受檢者有針對(duì)性的預(yù)防痛風(fēng)的發(fā)生，降低痛風(fēng)的發(fā)病幾率。
【專利說明】痛風(fēng)易感基因無創(chuàng)檢測(cè)試劑盒(APOE等基因)
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本項(xiàng)目屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及醫(yī)學(xué)和生物技術(shù)，具體涉及一種痛風(fēng)易感基因檢測(cè)試劑盒，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果從基因?qū)用嬖u(píng)估痛風(fēng)發(fā)病的風(fēng)險(xiǎn)級(jí)別，并作為預(yù)防和治療痛風(fēng)的方向指導(dǎo)。
【背景技術(shù)】
[0002]痛風(fēng)是由于嘌呤代謝紊亂及尿酸排泄障礙所導(dǎo)致的疾病。作為其主要臨床特征之一的高尿酸血癥是痛風(fēng)發(fā)病的直接原因。當(dāng)血液中尿酸濃度過高時(shí)，尿酸就會(huì)以鈉鹽的形式沉積在關(guān)節(jié)、軟組織和腎臟中，從而使身體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生響應(yīng)并引發(fā)造成痛苦的組織異物炎性反應(yīng)。由于半數(shù)以上的痛風(fēng)病患者都有家族史，說明遺傳因素在痛風(fēng)的發(fā)病過程中起著重要作用。已經(jīng)有研究表明亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)、SLC22A12基因和載脂蛋白E (ApoE)等基因的多態(tài)性均與高尿酸血癥的易感性有顯著關(guān)聯(lián)，在預(yù)防和治療痛風(fēng)中具有一定的預(yù)測(cè)價(jià)值。
[0003]MTHFR基因是同型半胱氨酸(Hcy)代謝途徑中的關(guān)鍵酶。MTHFR基因的第677位C — T突變(C677T)會(huì)使其編碼的氨基酸從丙氨酸變?yōu)槔i氨酸，從而影響酶的活性及熱穩(wěn)定性并使血漿中同型半胱氨酸濃度升高。研究發(fā)現(xiàn)在我國云南昆明地區(qū)、山東青島地區(qū)及新疆地區(qū)的高尿酸血癥患者中MTHFR基因第677位T等位基因頻率及TT基因型頻率均顯著高于健康人群。另外，在山東沿海地區(qū)的高尿酸血癥患者及痛風(fēng)病患者中也發(fā)現(xiàn)了相同的結(jié)論，表明MTHFR基因是高尿酸血癥和痛風(fēng)病的遺傳易感基因。
[0004]SLC22A12編 碼的尿酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白URATl在調(diào)節(jié)腎小管對(duì)尿酸鹽的重吸收以及維持血清中尿酸的動(dòng)態(tài)平衡中發(fā)揮著重要的作用。最初在德國原發(fā)性高尿酸血癥患者中發(fā)現(xiàn)SLC22A12基因外顯子I的C258T位點(diǎn)多態(tài)性與高尿酸血癥呈現(xiàn)顯著相關(guān)性。隨后在我國山東沿海地區(qū)亦發(fā)現(xiàn)SLC22A12基因C258T多態(tài)性位點(diǎn)的CC+CT基因型頻率顯著增加而TT基因型頻率則明顯降低，是高尿酸血癥的候選基因之一，可積極用于指導(dǎo)痛風(fēng)病的預(yù)防工作。
[0005]ApoE是由299個(gè)氨基酸構(gòu)成的含磷脂糖蛋白，是血漿脂蛋白的重要組成部分并直接參與膽固醇代謝。ApoE主要有ε 2、ε 3和ε 4三種等位基因，分別編碼Ε2、Ε3和Ε4三種不同的異構(gòu)體。在一項(xiàng)針對(duì)巴西城市人口的研究中發(fā)現(xiàn)ε4等位基因在高尿酸血癥患者中顯著升高。而在我國新疆地區(qū)漢族人口中也有研究表明與正常人群相比，高尿酸血癥患者的ApoE基因型有顯著差異，ε 2等位基因頻率呈現(xiàn)下降趨勢(shì)而ε 4等位基因頻率則有升高趨勢(shì)。另外，在山東濟(jì)南地區(qū)的高尿酸血癥患者中也發(fā)現(xiàn)了 ε4等位基因頻率有升高的趨勢(shì)。因此ε 4等位基因被認(rèn)為是高尿酸血癥發(fā)病的危險(xiǎn)因素，在痛風(fēng)病的預(yù)防過程中具有重要參考價(jià)值。
[0006]綜上所述，鑒于MTHFR基因、SLC22A12基因和ApoE基因在高尿酸血癥和痛風(fēng)疾病中體現(xiàn)出來的疾病顯著相關(guān)性，可以通過檢測(cè)這些痛風(fēng)發(fā)生相關(guān)基因位點(diǎn)的基因型來及時(shí)篩查出易患痛風(fēng)的高危人群，從而有針對(duì)性地預(yù)防和治療痛風(fēng)，這對(duì)于降低痛風(fēng)的發(fā)病率有非常重要的意義。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]基于檢測(cè)MTHFR 基因上 C677T (rsl801133)、SLC22A12 基因上的 C258T(rs3825016)、AP0E基因上ε 2 ε 3 ε 4 (rs429358)的3個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)基因型可作為評(píng)估痛風(fēng)發(fā)病的危險(xiǎn)因子的基礎(chǔ)上，本發(fā)明提供一種檢測(cè)痛風(fēng)遺傳易感性的試劑盒。
[0008]該試劑盒包括:
檢測(cè) MTHFR 基因上 C677T (rsl801133)、SLC22A12 基因上的 C258T (rs3825016)、AP0E基因上ε 2 ε 3 ε 4 (rs429358)的3個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)基因型的特異性引物對(duì)及DNA測(cè)序引物。
[0009]PCR反應(yīng)組件(包括Taq酶、dNTP混合液、反應(yīng)緩沖液、ddH20等)。
[0010]PCR產(chǎn)物純化組件(包括SAP酶、ExoI酶、ddH20等)。
[0011]DNA測(cè)序反應(yīng)組件(包括BigDye mix, EDTA溶液、100%乙醇溶液、70%乙醇溶液、HIDI 溶液、ddH20 等)。
[0012]本發(fā)明試劑盒的組分和含量包括:
PCR 反應(yīng)體系:10 XPCR 反應(yīng)緩沖液 2.5ul ；25mM dNTP 混合液 0.2ul ；5U/ul Taq DNA聚合酶0.125ul ;20uM特異性引物對(duì)(每條引物各0.25ul) ；ddH20 19.175ul。
[0013]PCR 產(chǎn)物純化體系:lU/ul SAP 酶 0.75ul ；10U/ul ExoI 酶 0.375ul ；ddH20
3.875ul。
[0014]測(cè)序反應(yīng)體系:25%BigDyemix lul ；3.2uM DNA 測(cè)序引物 lul ; 125mM EDTA 溶液lul ；100% 乙醇溶液 15ul ；70`% 乙醇溶液 30ul ；HIDI 溶液 8ul ；ddH20 2ul。
[0015]本試劑盒供一人份檢測(cè)應(yīng)用，試劑盒的保存溫度為_20°C。
【具體實(shí)施方式】
[0016]下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)按重量計(jì)算。
[0017]除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明中。文中所述的較佳實(shí)施方法與材料僅作示范之用。
[0018]實(shí)施例1.檢測(cè)試劑盒的使用。
[0019]1、抽提DNA模板
刮取受檢者口腔黏膜上皮細(xì)胞，用酚氯仿法抽提基因組DNA。
[0020]2、PCR擴(kuò)增反應(yīng)
使用檢測(cè)試劑盒中的PCR反應(yīng)組件，其中，含有下列引物對(duì):
(1)MTHFR(C677T)正向引物:5’AGGGAGGCTTCAACTACGC 3’
MTHFR (C677T)反向引物:5’GCGGTTGAGGGTGTAGAAGT3’
(2)SLC22A12 (C258T)正向引物:5’ACGATTGTGGAGGTGAAGATG3’
SLC22A12 (C258T)反向引物:5’ CATGTGGCTGTGTACCCAG3’
(3)APOE ( ε 2 ε 3 ε 4)正向引物:5’ AAATCGGAACTGGAGGAACAA3’APOE ( ε 2 ε 3 ε 4)反向引物:5’ TGCCCATCTCCTCCATCC3’。
[0021 ] PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為:10 X PCR反應(yīng)緩沖液2.5ml ；25mM的dNTP混合液
0.2ml、5U/ul Taq酶0.125ml、DNA模板Iml (12_15ng左右)、20uM正向引物反向引物各
0.25ml、ddH20 19.175ml。
[0022]反應(yīng)條件為:94°C 4分鐘變性和酶激活，94°C 30秒變性，55°C 30秒退火，72°C I分鐘延長，循環(huán)28次，最后72°C延長5分鐘以上。
[0023]3、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純化
使用檢測(cè)試劑盒中的PCR產(chǎn)物純化組件，反應(yīng)體系為總體積25ul，包含PCR產(chǎn)物20ul，lU/ul SAP 酶 0.75ul，10U/ul ExoI 酶 0.375ul，去離子水 3.875ul。
[0024]在AB I2720型PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)條件為37°C、15min，72°C、20min。
[0025]4、DNA測(cè)序反應(yīng)
使用檢測(cè)試劑盒中的測(cè)序反應(yīng)組件，其中，含有下列DNA測(cè)序引物:
(1)MTHFR(C677T)測(cè)序引物:5’AGGGAGGCTTCAACTACGC 3’
(2)SLC22A12 (C258T)測(cè)序引物:5’ACGATTGTGGAGGTGAAGATG3’
(3)APOE ( ε 2 ε 3 ε 4)測(cè)序引物:5’ AAATCGGAACTGGAGGAACAA3’。
[0026]反應(yīng)的體系為總體積5ul，包含PCR純化產(chǎn)物lul，25%Bigdye mixlul, 3.2uM DNA測(cè)序引物lul，去離子水2ul。
[0027]在ABI2720型PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)條件為98 °C 2min,進(jìn)行25個(gè)循環(huán)的960C 30s,55°C 30s, 60°C 4min。
[0028]反應(yīng)結(jié)束后加入125mM EDTA溶液Iul和100%乙醇溶液15ul，于室溫下沉淀15min ;在4°C , 3600rpm/min的轉(zhuǎn)速離心30min,輕輕倒去上清液；加入70%乙醇溶液30ul,3600rpm/min離心15min,輕輕倒去上清液；室溫放置20min后加入HIDI溶液8ul,放入測(cè)
序儀中。
[0029]5、基因型分析
熟悉DNA測(cè)序技術(shù)的本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠通過辨識(shí)DNA測(cè)序圖譜確定所檢測(cè)的SNP位點(diǎn)的基因型。
[0030]實(shí)施例2.對(duì)人們進(jìn)行預(yù)防痛風(fēng)發(fā)病的基因無創(chuàng)檢測(cè)的服務(wù)。
[0031]1.采樣及抽提DNA
由醫(yī)院檢驗(yàn)科醫(yī)師指導(dǎo)受檢者使用口腔采樣拭進(jìn)行口腔上皮細(xì)胞取樣，采用酚氯仿法進(jìn)行口腔上皮細(xì)胞的DNA抽提。
[0032]2.基因型檢測(cè)
使用本發(fā)明提供的試劑盒，對(duì)受檢者基因組DNA的MTHFR基因上C677T (rsl801133)、SLC22A12 基因上的 C258T (rs3825016)、APOE 基因上 ε 2 ε 3 ε 4 (rs429358)的 3 個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)分別進(jìn)行DNA測(cè)序，確定這3個(gè)SNPs位點(diǎn)的基因型。
[0033]3.痛風(fēng)發(fā)病高危人群風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估
通過對(duì)受檢者SNPs基因型的分析，出具痛風(fēng)易感基因風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估分析報(bào)告單。報(bào)告中詳細(xì)說明了受檢者 MTHFR 基因上 C677T(rsl801133)、SLC22A12 基因上的 C258T(rs3825016)、APOE基因上ε 2 ε 3 ε 4 (rs429358)的3個(gè)基因上SNP位點(diǎn)基因檢測(cè)信息以及遺傳風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估結(jié)果。除此之外，根據(jù)受檢者的風(fēng)險(xiǎn)級(jí)別，并由醫(yī)師向受檢者詳細(xì)說明和解讀痛風(fēng)易感基因無創(chuàng)檢測(cè)報(bào) 告單。
【權(quán)利要求】
1.一種基于APOE等基因的痛風(fēng)易感性無創(chuàng)檢測(cè)試劑盒，其特征在于:檢測(cè)MTHFR基因上 C677T (rsl801133)、SLC22A12 基因上的 C258T (rs3825016)、APOE 基因上 ε2ε3ε4(rs429358)的3個(gè)單核苷酸多態(tài)性的特異性引物與DNA測(cè)序引物、Taq酶、dNTP混合液、反應(yīng)緩沖液、SAP酶、ExoI酶、BigDye mix、EDTA溶液、70%乙醇溶液、100%乙醇溶液、HIDI溶液、ddH20 等。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于:所述的特異性引物對(duì)是指針對(duì)MTHFR基因上 C677T(rsl801133)、SLC22A12 基因上的 C258T(rs3825016)、AP0E 基因上 ε 2 ε 3 ε 4(rs429358)的3個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)，能特異性擴(kuò)增出包含這2個(gè)SNPs位點(diǎn)的DNA片段的引物對(duì)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于:所述的DNA測(cè)序引物是針對(duì)MTHFR基因上 C677T (rsl801133)、SLC22A12 基因上的 C258T (rs3825016)、AP0E 基因上 ε 2 ε 3 ε 4(rs429358)的3個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)而設(shè)計(jì)，能通過DNA測(cè)序技術(shù)特異性檢測(cè)出上述2個(gè)SNPs位點(diǎn)基因型的DNA測(cè)序引物。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所示的試劑盒，其特征在于，所含的2對(duì)特異性引物序列如下: (1)MTHFR (C677T)正向引物:5’ AGGGAGGCTTCAACTACGC 3’ MTHFR (C677T)反向引物:5’GCGGTTGAGGGTGTAGAAGT3’ (2)SLC22A12 (C258T)正向引物:5’ACGATTGTGGAGGTGAAGATG3’
SLC22A12 (C258T)反向引物:5’ CATGTGGCTGTGTACCCAG3’ (3)APOE ( ε2ε3ε4)正向弓丨物:5’AAATCGGAACTGGAGGAACAA3’
APOE ( ε 2 ε 3 ε 4)反向引物:5’ TGCCCATCTCCTCCATCC3’。`
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所含的2條DNA測(cè)序引物序列如下: (1)MTHFR(C677T)測(cè)序引物:5’AGGGAGGCTTCAACTACGC 3’ (2)SLC22A12 (C258T)測(cè)序引物:5’ACGATTGTGGAGGTGAAGATG3’
(3)APOE ( ε 2 ε 3 ε 4)測(cè)序引物:5’ AAATCGGAACTGGAGGAACAA3’。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于試劑盒的組分和含量包括: (1)?0?反應(yīng)體系:10父？0?反應(yīng)緩沖液2.5111，251111dNTP 混合液 0.2ul，5U / ul TaqDNA聚合酶0.125ul，20uM特異性引物對(duì)，每條引物各0.25ul，ddH20 19.175ul ； (2)PCR 產(chǎn)物純化體系:1 U / ul SAP 酶 0.75ul，10 U / ul ExoI 酶 0.375ul，ddH203.875ul ； (3)測(cè)序反應(yīng)體系:25%BigDye mixlul，3.2uM DNA測(cè)序引物 lul，125mM EDTA溶液 lul，100% 乙醇溶液 15ul, 70% 乙醇溶液 30ul, HIDI 溶液 8ul, ddH20 2ul。
7.本試劑盒供一人份檢測(cè)應(yīng)用，試劑盒的保存溫度為_20°C。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103627783SQ201210304534
【公開日】2014年3月12日 申請(qǐng)日期:2012年8月24日 優(yōu)先權(quán)日:2012年8月24日
【發(fā)明者】石慧林 申請(qǐng)人:解碼（上海）生物醫(yī)藥科技有限公司