專利名稱：一株海洋真菌小紅酵母及其在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一株新的具有抗腫瘤活性的海洋真菌-小紅酵母(Rhodotorula
minuta ) 100101A,及其在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
從陸地微生物中尋找新的抗腫瘤藥物的成功率已大大降低，而海洋微生物作為新的藥物來源正越來越受到世界關(guān)注。海洋環(huán)境苛刻，具有低溫、低照、高鹽、高壓和寡營養(yǎng)等特點(diǎn)，海洋微生物由于棲息于這樣的極限環(huán)境下，產(chǎn)生了與陸地生物完全不同的代謝系統(tǒng)和機(jī)體防御系統(tǒng)，所以能產(chǎn)生許多結(jié)構(gòu)新穎、活性特異的次級代謝產(chǎn)物，并且許多特異的化學(xué)結(jié)構(gòu)類型是在陸地微生物中難以發(fā)現(xiàn)的。同時(shí)據(jù)研究，海洋微生物產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物具有抗腫瘤、抗氧化、抗菌等生物活性也是陸生微生物所無法比擬的。
海洋微生物作為抗腫瘤活性物質(zhì)的新來源，受到了全世界海洋研究工作者的關(guān)注。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的即是為了在海洋微生物中尋找具有抗腫瘤活性的物質(zhì)，提供一株抗
腫瘤活性海洋真菌-小紅酵母(Rhodotorula minuta )100101A及其應(yīng)用，為研究開發(fā)新
型抗腫瘤藥物提供先導(dǎo)化合物。本發(fā)明采用的技術(shù)方案是一株具有抗腫瘤活性的海洋真菌-小紅酵母(Rhodotorula minuta) 100101A,
保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址中國，武漢，武漢大學(xué)，郵編430072，保藏編號CCTCC No M 2012289，保藏日期2012 年 7 月 18 日。該菌株的菌落特征如下涂布或劃線接種于平板培養(yǎng)基上生長迅速，28°C培養(yǎng)48 h后長出圓形、濕潤、淡紅色、易挑起，直徑約為O. 5-0. 8cm的菌落；所述小紅酵母Rhodotorula minuta 100101A細(xì)胞特征如下橢圓形，單球菌，大小為
2.3-5. O μ mX 4. 0—10. O μ m。本發(fā)明小紅酵母100101A是從浙江省東海海域采集的海水中篩選分離得到。菌株的篩選純化方法為將采集的海水運(yùn)用稀釋涂布法涂于土豆平板培養(yǎng)基上，多次平板劃線至出現(xiàn)單菌落，再挑取單菌落至新鮮土豆斜面培養(yǎng)基上，28°C培養(yǎng)48h，以菌株形態(tài)特征區(qū)別進(jìn)行挑選，即得該菌株，并對該菌株進(jìn)行菌種鑒定。將所述的小紅酵母Rhodotorula minuta 100101A的18sRNA部分核苷酸序列與美國國立生物信息中心(National Center for Biotechnology Information USA, NCBI)的基因庫中的微生物18sRNA序列比對，將其命名為海洋小紅酵母Rhodotorula minuta100101A。所述小紅酵母Rhodotorula minuta 100101A的18sRNA的部分核苷酸序如下
CTTCCGTAAGGGTAACCTGCGGAAGGATCATTAATGAATTTTAGGACGTTCTTTTTAGAAGTCCGACCATTTCATTTTCTTACACTGTGCACACACTTCTTTTTACACACACTTTTAACACATTAGTATAAGAATGTAATAGTCTCTTAATTGAGCATAAACAAAAATAAAACTTTCAGCAACGGATCTCTTGGCTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAATTGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACC TTGCACTCTTTGGTATTCCGAAGAGTATGTCTGTTTGAGTATCATGAAACTCTCAACCCCCCTATTTTGTAATGAAATGGGCGTGGGCTTGGATTATGGTTGTCTGTCGGCGTAATTGCCGGCTCAACTGAAATACACGAGCAACCCTATTGAAATAGACGGTTTGACTTGGCGTAATAATTATTTCGCTAAGGACGTCTTCTTCAAATATAAGAGGTGCTTCTAATGCGCTTTATAGCACTTTAAGCTTTAGATCTCAAATCAGT CAGGACTACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAGGCGGAGGAAGA。本發(fā)明還涉及所述的小紅酵母100101A在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。所述抗腫瘤藥物為治療神經(jīng)癌或肝癌的藥物。具體的，所述應(yīng)用為所述小紅酵母100101A提取物在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。優(yōu)選的，所述提取物為正丁醇提取物，由如下方法獲得小紅酵母100101A接種至液體發(fā)酵培養(yǎng)基，于25 35°C、15(T250r/min振蕩條件下培養(yǎng)14 30天，得到發(fā)酵液，發(fā)酵液經(jīng)細(xì)胞破碎，離心取濾液用正丁醇萃取，萃取液濃縮得浸膏，浸膏以甲醇水體積比為2 8^10 0為流動相，進(jìn)行HP-20大孔樹脂層析過柱，梯度洗脫，收集甲醇體積濃度80%以上的洗脫液，旋蒸濃縮揮干，即得所述正丁醇提取物；所述液體培養(yǎng)基組成為葡萄糖15 25g/L，蛋白胨5 15g/L，酵母浸出粉8 15 g/L，磷酸鐵O. 05、. 15 g/L，溶劑為人工海水，pH 6 7。所述人工海水每IOOml 組成為=NaCl 2. 448g, Na2SO4O. 3917g, KC10. 0664g,KBr O. 0096g, SrCl2O. 0024g, MgCl · 6H20 0. 4981g, CaCl2 · H2OO. 1102g, NaHCO3O. 0192g,H3BO3O. 0026g, NaF 0.0004g，蒸餾水 100ml。具體的，所述正丁醇提取物可按如下方法獲得(I)將保藏的小紅酵母Rhodotorula minuta 100101A菌株接種于斜面培養(yǎng)基,于25-35°C培養(yǎng)24-48 h，得到活化后的菌種；所述的斜面培養(yǎng)基組成為葡萄糖15 25g/L，蛋白胨5 15g/L，酵母浸出粉8 15 8/1，磷酸鐵0.05、.15 g/L，瓊脂15 25 g/L，溶劑為人工海水，pH 6 7 ；(2)將步驟(I)活化培養(yǎng)后的海洋真菌小紅酵母Rhodotorula minuta 100101A菌體接種至液體種子培養(yǎng)基中，于25 35°C條件下培養(yǎng)16 48h，得到種子液；所述液體種子培養(yǎng)基組成為葡萄糖15 25g/L，蛋白胨5 15g/L，酵母粉8 15 g/L，磷酸鐵0. 05、. 15 g/L,溶劑為人工海水，pH 6^7 ；(3)將步驟(2)種子液以19TlO%的體積比的接種量，移種到液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，25 35°C、150-250r/min振蕩條件下培養(yǎng)1Γ30天，得到發(fā)酵液；所述液體培養(yǎng)基組成為葡萄糖15 25g/L，蛋白胨5 15g/L，酵母粉8 15g/L，磷酸鐵0. 05、. 15g/L，溶劑為人工海水，pH 6 7 ；(4)將步驟(3)的發(fā)酵液于4°C條件下細(xì)胞破碎，離心分離除去菌體，所得發(fā)酵液用正丁醇萃取后收集上層萃取液，旋蒸濃縮揮干制得的油狀提取物總浸膏；(5)將步驟(4)的油狀提取物總浸膏以甲醇水體積比為2 8^10 0的溶液為流動相(10:0時(shí)即全部為甲醇)，進(jìn)行HP-20大孔樹脂層析過柱，梯度洗脫，收集甲醇體積濃度80%以上的洗脫液，旋蒸濃縮揮干，即得所述正丁醇提取物。本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在提供了一株新的具有抗腫瘤活性的海洋真菌小紅酵母(Rhodotorula minuta )100101A,對腫瘤細(xì)胞HepG2 (肝癌細(xì)胞)、PC_12 (神經(jīng)癌細(xì)胞)均具有一定的細(xì)胞毒性，為新藥篩選提供了基礎(chǔ)。


圖I為斜面培養(yǎng)基上海洋小紅酵母10010IA的菌體形態(tài)；圖2為光學(xué)顯微鏡(40倍)下海洋小紅酵母100101A的菌體形態(tài)。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此實(shí)施例I :海洋小紅酵母菌株的分離純化及菌種鑒定(I)菌株的分離純化方法為將采集的海水運(yùn)用稀釋涂布法涂于馬鈴薯平板培養(yǎng)基上，多次平板劃線至出現(xiàn)單菌落，挑取單菌落至新鮮馬鈴薯平板培養(yǎng)基上，28°C培養(yǎng)48h， 以菌株形態(tài)特征區(qū)別進(jìn)行挑選，即得該菌株。(2)對篩選獲得的菌株100101A進(jìn)行18sRNA的PCR產(chǎn)物擴(kuò)增，并與美國國立生物信息中心(NCBI)的基因庫中的微生物18 s RNA核苷酸序列比對，將其命名為海洋小紅酵母Rhodotorula minuta 100101A,提交中國典型培養(yǎng)物保藏中心,保藏號CCTCC No:M2012289，保藏日期2012年7月18日。實(shí)施例2 :海洋小紅酵母的菌種活化及大量發(fā)酵培養(yǎng)(I)將實(shí)施例I中篩選獲得的菌株接種于斜面培養(yǎng)基，于28°C培養(yǎng)48h，得到活化后的菌株，所述斜面培養(yǎng)基按如下組成配制葡萄糖20g，蛋白胨20g，酵母粉10g，磷酸鐵O. Ig,瓊脂20g,人工海水1L，ρΗ6· O。(2)活化后的菌株接種于液體種子培養(yǎng)基中，液體種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基配方相同葡萄糖20g，蛋白胨20gL，酵母粉10g，磷酸鐵O. lg，人工海水1L，ρΗ6· O。(3)將海洋小紅酵母菌株液體種子液以10%的體積比的接種量接種到大規(guī)模發(fā)酵培養(yǎng)基中，在28°C、200r/min搖床恒溫培養(yǎng)14d后取出發(fā)酵液，在超聲波細(xì)胞破碎儀中進(jìn)行菌體破碎20min,然后于4°C條件8000r/min離心15min分離菌體與發(fā)酵液,得小紅酵母發(fā)酵液。實(shí)施例3 :海洋小紅酵母發(fā)酵液粗提物活性成分的提取小紅酵母發(fā)酵液以等體積正丁醇萃取3次后旋蒸濃縮，得發(fā)酵液粗提物。粗提物經(jīng)0. 45 μ m濾膜過濾除雜后過HP-20大孔樹脂層析柱，以甲醇-水體積比分別為2:8，4:6，6: 4，8: 2，10:0五個(gè)極性段進(jìn)行梯度洗脫，各極性段收集洗脫液，旋蒸濃縮揮干分別對應(yīng)得到A、B、C、D、E共5段極性部位。實(shí)施例4 :發(fā)酵液粗提物活性成分的體外抗腫瘤實(shí)驗(yàn)具體步驟如下選取兩株腫瘤細(xì)胞，分別為腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤PC-12細(xì)胞和人肝癌HepG2細(xì)胞，取對數(shù)期的細(xì)胞株制成細(xì)胞懸液，接種于96孔板中，培養(yǎng)48h，待測樣品(5個(gè)極性部位A、B、C、D、E)加入0. P/oDMSOlO μ L溶解后，用無血清的1640細(xì)胞培養(yǎng)基稀釋，力口100 μ L至試驗(yàn)組中，使得最終發(fā)酵液總浸膏的濃度分別為50 μ g/ml、100 μ g/ml、200 μ g/ml、400y g/ml、800y g/ml，5個(gè)極性部位A、B、C、D、E的濃度均為200 μ g/ml，陰性對照組加等量不含樣品的無血清培養(yǎng)基，空白對照組則為無細(xì)胞和樣品的無血清培養(yǎng)基，依托泊苷(VP-16)作為陽性對照品，每個(gè)濃度設(shè)5個(gè)復(fù)孔，腫瘤細(xì)胞在CO2培養(yǎng)箱(37°C)培養(yǎng)48h，每孔加入5mg/ml的MTT20 μ L，繼續(xù)培養(yǎng)4h后，小心移去上清，每孔加DMSO150 μ L，振蕩lOmin，用酶標(biāo)儀充分振蕩使得MTT紫色產(chǎn)物完全溶解，測490nm的A值，根據(jù)公式抑制率=(A陰性對照組-A空白對照組)-(A樣品組-A空白對照組)/(A陰性對照組-A空白對照組)即可求得抑制率。經(jīng)MTT (四甲基偶氮唑藍(lán))比色法體外抗腫瘤實(shí)驗(yàn)表明發(fā)酵液粗提物極性部位對腫瘤細(xì)胞H印G2、PC-12均具有一定的細(xì)胞毒性，其對PC-12和HepG2兩種腫瘤細(xì)胞的抑制活性分別如下表所述表I :不同極性部位對PC-12的抑制活性
權(quán)利要求
1.一株海洋真菌-小紅酵母(Rhodotorula minuta )100101A,保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址中國，武漢，武漢大學(xué)，郵編430072，保藏編號CCTCC No M 2012289，保藏日期2012年7月18日。
2.如權(quán)利要求I所述的小紅酵母100101A在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
3.如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于所述抗腫瘤藥物為治療神經(jīng)癌或肝癌的藥物。
4.如權(quán)利要求2或3所述的應(yīng)用，其特征在于所述小紅酵母100101A提取物在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
5.如權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于所述提取物為正丁醇提取物，由如下方法獲 得小紅酵母100101A接種至液體發(fā)酵培養(yǎng)基，于25 35°C、15(T250r/min振蕩條件下培養(yǎng)1Γ30天，得到發(fā)酵液，發(fā)酵液經(jīng)細(xì)胞破碎，離心取濾液用正丁醇萃取，萃取液濃縮得浸膏，浸膏以甲醇水體積比為2 8^10 0為流動相，進(jìn)行HP-20大孔樹脂層析過柱，梯度洗脫，收集甲醇體積濃度80%以上的洗脫液，旋蒸濃縮揮干，即得所述正丁醇提取物；所述液體培養(yǎng)基組成為葡萄糖15 25g/L，蛋白胨5 15g/L，酵母浸出粉8 15 g/L，磷酸鐵O. 05、. 15 g/L，溶劑為人工海水，pH 6 7。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種具有抗腫瘤活性的海洋真菌——小紅酵母(Rhodotorula minuta)MNP100101A，及其在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。該菌株保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址中國武漢武漢大學(xué)，保藏編號CCTCC NoM2012289，保藏日期2012年7月18日。本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在提供了一株新的具有抗腫瘤活性的海洋真菌小紅酵母(Rhodotorula minuta)MNP100101A，對腫瘤細(xì)胞HepG2(肝癌細(xì)胞)、PC-12(神經(jīng)癌細(xì)胞)均具有一定的細(xì)胞毒性，為新藥篩選提供了基礎(chǔ)。
文檔編號C12R1/645GK102925372SQ20121030684
公開日2013年2月13日 申請日期2012年8月27日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月27日
發(fā)明者王鴻, 吳一書, 謝燕瑾 申請人:浙江工業(yè)大學(xué)