專利名稱：檢測炭疽桿菌的引物、雙重lamp檢測炭疽桿菌的試劑盒及快速可視化檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于以LAMP法檢測炭疽桿菌的引物、含有該引物的試劑盒、采用該試劑盒的檢測方法、以及針對該試劑盒的檢驗方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
炭疽桿菌是人畜共患致病菌，可通過皮膚接觸、呼吸道及消化道感染人和動物，具有高度致病性，其中肺炭疽被列為中國國家法定甲類傳染病(最高級別)。炭疽桿菌可通過空氣飛沫傳播，可形成氣溶膠，易引發(fā)突發(fā)公共衛(wèi)生事件；而炭疽桿菌芽孢可存活十年以上，可構(gòu)成公共衛(wèi)生隱患。炭疽桿菌嚴(yán)重威脅人類健康和生命安全，其檢測和預(yù)防一直倍受 重視。然而，目前的檢測方法面臨兩個主要問題一是如何在條件較簡陋的事發(fā)現(xiàn)場快速確定是否存在炭疽桿菌；二是如何快速診斷出炭疽強(qiáng)毒株，以挽救吸入性感染炭疽強(qiáng)毒株的病人生命，同時確定針對目標(biāo)人群的強(qiáng)制性隔離防疫措施等。傳統(tǒng)炭疽桿菌的檢測診斷都是基于形態(tài)學(xué)特征或表型特征，如革蘭氏陽性染色試驗、噬菌體試驗、串珠和青霉素抑制試驗、拉絲試驗〈粘型菌落〉、溶血試驗、芽孢形成試驗等，這些方法在一定程度上都存在著費時、操作繁瑣、靈敏度低等缺點，均不適合早期快速偵檢?，F(xiàn)有技術(shù)中，免疫膠體金技術(shù)、常規(guī)PCR及DNA探針雜交技術(shù)，均存在特異性和敏感性的問題；實時熒光定量PCR技術(shù)靈敏度高，可靠性好，是全封閉反應(yīng)，但是該技術(shù)需要價格昂貴的熒光定量PCR儀，無法在很多中小醫(yī)院和基層防疫機(jī)構(gòu)普及，且為了保證高特異性往往需要熒光標(biāo)記探針，檢測成本較高。此外，精密貴重儀器對質(zhì)量控制、操作環(huán)境和人員的專業(yè)能力要求較高，難以在疫情現(xiàn)場使用。2000年，日本學(xué)者Notomi等開發(fā)出一種新技術(shù)——LAMP法(環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增法)，擴(kuò)增反應(yīng)全過程均在同一溫度下進(jìn)行，不須像PCR反應(yīng)那樣需要經(jīng)歷幾十個溫度變化的循環(huán)過程，因此對擴(kuò)增所需儀器的要求大大簡化，僅需水浴鍋或其它小型恒溫加熱器即可，并且反應(yīng)時間縮短。LAMP法的基本原理是針對靶基因的6個區(qū)域設(shè)計4飛條引物(包括2條內(nèi)引物和2條外引物，可另加2條非必需的環(huán)引物)，在具有鏈置換特性的Bst DNA聚合酶作用下，外引物的延伸產(chǎn)物將內(nèi)引物的延伸產(chǎn)物置換出來，形成一個啞鈴狀的DNA，然后進(jìn)入循環(huán)擴(kuò)增階段，最終形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)和多環(huán)花椰菜樣結(jié)構(gòu)的DNA片段混合物。LAMP法具有以下優(yōu)點(I)較高特異性和抗干擾能力，只有當(dāng)2對引物與目的片段的6個區(qū)域都匹配上時才能進(jìn)行擴(kuò)增；(2)反應(yīng)體系穩(wěn)定可靠，在室溫下放置2周后仍然穩(wěn)定，并且對于樣品中原有或污染的無關(guān)、干擾片段仍然不敏感，而其他類似技術(shù)則無法做到這一點；(3)敏感性較高，擴(kuò)增快速、高效，I小時內(nèi)產(chǎn)物量可達(dá)約IOltl倍，約為普通PCR的1000倍。因此，LAMP法為病原微生物的核酸檢測提供了一個更簡便、更快速、更有效的手段，尤其適用于疫情現(xiàn)場、野外工作、基層單位等條件相對簡陋的環(huán)境。但是，目前應(yīng)用于病原體檢測的LAMP法，幾乎都存在一個關(guān)鍵問題LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測手段主要是擴(kuò)增結(jié)束后開蓋加入熒光染料SYBR Green I等顯色液，但在此過程中，很難避免核酸氣溶膠污染所致的后續(xù)假陽性結(jié)果。出現(xiàn)假陽性的主要原因是由于擴(kuò)增結(jié)束后核酸片段產(chǎn)物量過于巨大，往往又是同一片段的重復(fù)序列，加熱后會形成氣溶膠，開蓋后即揮散在空氣、塵埃中以及器皿、衣物、工作臺和耗材試劑等表面，而LAMP方法又過于靈敏，氣溶膠污染后將造成后續(xù)檢測的高假陽性率。日本榮研公司的LA-320實時濁度儀專用于LAMP法，可實時監(jiān)測濁度變化，無需開蓋，可避免前述假陽性現(xiàn)象，但該儀器價格昂貴約60萬元，限制了其推廣應(yīng)用。此外，值得注意的是，現(xiàn)有利用某單一基因鑒定炭疽桿菌的方法并不完全可靠炭疽桿菌與枯草芽孢桿菌等其它蠟樣菌群有很高的同源性，重要區(qū)別在于炭疽桿菌含有2個與毒力密切相關(guān)的特異性質(zhì)粒(pXOl和pX02) ;pX01質(zhì)粒上包含分別編碼致死因子、保護(hù)性抗原、水腫因子的lef、PA和cya基因，pX02質(zhì)粒上則包含與芽孢形成有關(guān)的基因如 capA、capB、capC基因。目前已有的炭疽桿菌核酸檢測方法基本上都會檢測這些質(zhì)粒上的特異致病因子，但是炭疽桿菌的質(zhì)粒并不穩(wěn)定，容易缺失而使炭疽桿菌成為弱毒株或無毒株，而且自然環(huán)境下這些質(zhì)?？杀粚?dǎo)入其它菌株，即在普通蠟狀芽胞桿菌群間水平轉(zhuǎn)移。相較之下，炭疽桿菌的染色體表達(dá)相對穩(wěn)定，可在準(zhǔn)確鑒定中發(fā)揮重要作用。經(jīng)檢索發(fā)現(xiàn)，申請?zhí)?01110044466. 8、公布號為CN102146470A的中國發(fā)明專利申請?zhí)峁┮环N炭疽芽孢桿菌檢測試劑盒及其使用方法，包括以炭疽芽孢桿菌PA基因為靶基因、基于環(huán)介導(dǎo)恒溫擴(kuò)增技術(shù)設(shè)計的兩對引物內(nèi)引物FIP/BIP和外引物F3/B3。但是，該試劑盒僅能檢測到核酸來源是否含有炭疽桿菌質(zhì)粒PX01，也就是說，有可能會誤檢到含有毒性質(zhì)粒PXOl的蠟狀芽胞桿菌。此外，該專利為了避免氣溶膠污染，必須使用特制反應(yīng)管，但這樣一來，使用者必須額外購買這種反應(yīng)管，增加使用成本，很不方便。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一目的是針對現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，提供一種用于以LAMP法檢測炭疽桿菌的引物，可用于確證是否存在炭疽桿菌。本發(fā)明的第二目的是提供含有上述引物的試劑盒，可確證是否存在炭疽桿菌。本發(fā)明的第三目的是提供采用前述試劑盒的檢測方法，可不用開蓋即實現(xiàn)可視化檢測，避免出現(xiàn)假陽性現(xiàn)象，無需使用昂貴的實時濁度儀。本發(fā)明的第四目的是提供針對前述試劑盒的檢驗方法，確保使用正常的試劑盒來得到可靠的結(jié)果。申請人:經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)炭疽桿菌染色體中的gyrB基因高度保守，若作為鑒定目標(biāo)，則可確保炭疽桿菌鑒定的準(zhǔn)確性；與PA基因相比，炭疽桿菌質(zhì)粒pXOl上編碼致死因子的Ief基因與炭疽桿菌致病性的關(guān)聯(lián)度更高，更具有代表性，更適宜作為鑒定目標(biāo)。通常認(rèn)為，在擴(kuò)增前就將顯色劑加入反應(yīng)體系應(yīng)能避免擴(kuò)增后開蓋導(dǎo)致的氣溶膠污染，然而實際研究表明，采用現(xiàn)有反應(yīng)體系時，擴(kuò)增前加入顯色劑會導(dǎo)致顯色劑不穩(wěn)定、失效或嚴(yán)重抑制擴(kuò)增反應(yīng)進(jìn)行，無法進(jìn)行檢測。申請人經(jīng)反復(fù)深入地實驗研究后，終于得出在擴(kuò)增前加入顯色劑仍能正常檢測的炭疽桿菌核酸恒溫擴(kuò)增反應(yīng)體系，反應(yīng)結(jié)束時即顯示出結(jié)果且重復(fù)性良好，不存在擴(kuò)增后開蓋操作，從而徹底解決了氣溶膠污染問題。同時，該反應(yīng)體系使用普通反應(yīng)管即可實現(xiàn)，非常方便。結(jié)合上述發(fā)現(xiàn)，實現(xiàn)本發(fā)明第一目的的技術(shù)方案如下一種用于LAMP檢測炭疽桿菌的引物，其特征是，包括Ief引物序列集和gyrB引物序列集；其中，Ief引物序列集包括外引物對LF-F3和LF-B3，以及內(nèi)引物對LF-FIP和LF-BIP ；LF-F3的序列如SEQ ID NO: I所示，LF-B3的序列如SEQ ID NO: 2所示，LF-FIP的序列如SEQ ID NO:3 所示，LF-BIP 的序列如 SEQ ID NO:4 所示；gyrB引物序列集包括外引物對gy_F3和gy_B3,內(nèi)引物對gy-FIP和gy-BIP,以及環(huán)引物對gy-LF和gy-LB ;gy-F3的序列如SEQ ID NO: 5所示，gy_B3的序列如SEQ ID NO: 6所示，gy-FIP的序列如SEQ ID NO: 7所示,gy-BIP的序列如SEQ ID NO: 8所示,gy-LF的序列如SEQ ID NO:9所示，gy-LB的序列如SEQ ID NO: 10所示。采用該引物后，既檢測炭疽桿菌質(zhì)粒pXOl，又檢測炭疽桿菌染色體，可用于確證是否存在炭疽桿菌。結(jié)合上述發(fā)現(xiàn)，實現(xiàn)本發(fā)明第二目的的技術(shù)方案如下一種雙重LAMP檢測炭疽桿菌的試劑盒，其特征是，包括前述用于以LAMP法檢測炭疽桿菌的引物。采用該試劑盒后，可確證是否存在炭疽桿菌。實現(xiàn)本發(fā)明第三目的的技術(shù)方案如下一種雙重LAMP檢測炭疽桿菌的快速可視化檢測方法，其特征是，采用前述以LAMP法檢測炭疽桿菌的試劑盒，該方法包括以下步驟第一步、向透明反應(yīng)管A、B中分別加入體積相同的試劑盒2X反應(yīng)緩沖液、I管或II管的引物混合液、BstDNA聚合酶、顯色液、超純水，然后混合，得到體積相同的反應(yīng)液A、B ;其中反應(yīng)管A中加入I管的引物混合液，反應(yīng)管B中加入II管的引物混合液；試劑盒2X反應(yīng)緩沖液、I管或II管的引物混合液、BstDNA聚合酶、顯色液、超純水的體積比為(8-12)(I. 5-3. 5) (0. 5-1. 5) (0. 3-0. 9) (3. 1-4. 7)；第二步、向反應(yīng)管A、B中分別加入體積相同的待測核酸樣品，蓋好反應(yīng)管A、B后混勻；第三步、將反應(yīng)管A、B先分別在60°C _64°C恒溫條件下放置45_80min進(jìn)行LAMP擴(kuò)增，再置于80°C -95°C 5-10min滅活BstDNA聚合酶；第四步、觀察反應(yīng)液A、B的顏色，若兩者顏色均為天藍(lán)色，則待測核酸樣品的來源含有炭疽桿菌強(qiáng)毒株或弱毒株；若兩者顏色均為紫羅蘭色，則待測核酸樣品的來源不含炭疽桿菌；若反應(yīng)液A顏色為紫羅蘭色，且反應(yīng)液B顏色為天藍(lán)色，則待測核酸樣品的來源含有炭疽桿菌弱毒株或無毒株；若反應(yīng)液A顏色為天藍(lán)色，且反應(yīng)液B顏色為紫羅蘭色，則待測核酸樣品的來源含有具有毒性質(zhì)粒PXOl的蠟樣芽胞桿菌。采用該檢測方法后，可不用開蓋即實現(xiàn)可視化檢測，避免出現(xiàn)假陽性現(xiàn)象，無需使用昂貴的實時濁度儀。實現(xiàn)本發(fā)明第四目的的技術(shù)方案如下一種針對前述雙重LAMP檢測炭疽桿菌試劑盒的檢驗方法，其特征是，包括以下步驟第一步、制備兩套含反應(yīng)液A的反應(yīng)管A、含反應(yīng)液B的反應(yīng)管B:向透明反應(yīng)管A、B中分別加入體積相同的試劑盒2X反應(yīng)緩沖液、I管或II管的引物混合液、BstDNA聚合酶、顯色液、超純水，然后混合，得到體積相同的反應(yīng)液A、B ;其中反應(yīng)管A中加入I管的引物混合液，反應(yīng)管B中加入II管的引物混合液；試劑盒2X反應(yīng)緩沖液、I管或II管的引物混合液、BstDNA聚合酶、顯色液、超純水的體積比為(8-12) :(1. 5-3. 5) :(0. 5-1. 5)(O. 3-0. 9) (3. 1-4. 7)；第二步、向第一套反應(yīng)管A、B中分別加入體積相同的蒸餾水，蓋好反應(yīng)管A、B后混勻，作為陰性對照；向第二套反應(yīng)管A、B中分別加入體積相同的陽性對照品，蓋好反應(yīng)管A、B后混勻，作為陽性對照；蒸餾水、陽性對照品的加入體積相同；第三步、將反應(yīng)管A、B先分別在60°C _64°C恒溫條件下放置45_80min進(jìn)行LAMP擴(kuò)增，再置于80°C -95°C 5-10min滅活BstDNA聚合酶；第四步、觀察陰性對照反應(yīng)液A、B和陽性對照反應(yīng)液A、B的顏色，若陰性對照反應(yīng)液A、B顏色均為紫羅蘭色，且陽性對照反應(yīng)液A、B顏色均為天藍(lán)色，則第一步所用試劑盒是正常的；若各反應(yīng)液顏色與前述情況不完全相符或完全不相符，則第一步所用試劑盒不正
堂
巾O采用該驗證方法后，可確保使用正常的試劑盒來得到可靠的結(jié)果。本發(fā)明結(jié)果可靠，成本相對較低，尤其適用于條件簡陋的衛(wèi)生事件現(xiàn)場。


圖I為本發(fā)明實施例2陽性對照品質(zhì)粒PGEM-Ief-gyrb的示意圖。圖2為圖I實施例PGEM-T easy載體的示意圖。圖3為本發(fā)明實施例5檢測結(jié)果圖。圖4為本發(fā)明實施例6電泳結(jié)果圖。
具體實施例方式下面參照附圖并結(jié)合實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。但是本發(fā)明不限于所給出的例子。以下內(nèi)容中涉及的實驗操作，如未注明具體實驗條件，則按照常規(guī)條件進(jìn)行，例如，可參照SAMBR00K. J等編著的《分子克隆實驗指南》第3版(Molecular Cloning:ALaboratory Manual; NEW York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001)中述及的條件，或按照制造廠商所建議的條件。以下內(nèi)容中涉及的實驗材料和試劑，如未特別說明則為市售品。實施例I :lef、gyrB引物序列集首先，在NCBI (美國國立生物技術(shù)信息中心)GenBank數(shù)據(jù)庫中檢索獲得炭疽桿菌質(zhì)粒PXOl的Ief基因序列和炭疽桿菌染色體的gyrB基因序列，并通過ClustalX軟件進(jìn)行序列比對，得到兩種基因的特異性保守序列；然后，通過LAMP引物設(shè)計軟件(PrimerExplorer software, version 4. 0),針對上述特異性保守序列分別進(jìn)行LAMP引物設(shè)計,得到可應(yīng)用于同一反應(yīng)體系的lef、gyrB引物序列集。Ief引物序列集包括外引物對LF-F3和LF-B3，以及內(nèi)引物對LF-FIP和LF-BIP。LF-F3的序列如SEQ ID NO: I所示;LF_B3的序列如SEQ ID NO: 2所示；LF-FIP的序列如SEQ ID NO: 3 所示；LF-BIP 的序列如 SEQ ID NO:4 所示。gyrB引物序列集包括外引物對gy_F3和gy_B3,內(nèi)引物對gy_FIP和gy-BIP,以及環(huán)引物對gy-LF和gy-LB。gy-F3的序列如SEQ ID NO: 5所示；gy_B3的序列如SEQ ID NO: 6所示；gy-FIP的序列如SEQ ID NO: 7所示；gy-BIP的序列如SEQ ID NO: 8所示；gy-LF的序列如SEQ ID NO:9所示；gy-LB的序列如SEQ ID NO: 10所示。實施例2 以LAMP法檢測炭疽桿菌的試劑盒本實施例試劑盒包括實施例I的Ief引物序列集和gyrB引物序列集。其中，由Ief引物序列集構(gòu)成的引物混合液放置于I管中，外引物對LF-F3和LF-B3與內(nèi)引物對LF-FIP和LF-BIP的摩爾比為I: (5-10)，優(yōu)選1:8 ;由gyrB引物序列集構(gòu)成的引物混合液放置于II管中，外引物對gy_F3和gy_B3、內(nèi)引物對gy-FIP和gy-BIP、及環(huán)引物對gy-LF和gy-LB的摩爾比為I: (5-10) : (2-6)，優(yōu)選1:8:4。例如1管中，每2· 5μ I弓丨物混合液含有4pmol LF_F3、4pmol LF-B3、32pmolLF-FIP、及 32pmol LF-BIP ； II管中，每 2· 5μ I 引物混合液含有 4pmol gy_F3、4pmolgy-B3、32pmol gy-FIP>32pmoI gy-BIP、16pmol gy-LB、及 16pmol gy-LF。
本實施例試劑盒還包括(I)陽性對照品含有炭疽桿菌Ief基因片段及gyrB基因片段的質(zhì)粒PGEM-lef-gyrb(按常規(guī)分子克隆方法獲得)，其濃度為20_100mg/L，優(yōu)選50mg/L。如圖I至圖2所示，質(zhì)粒PGEM-Ief-gyrb由PGEM-T easy載體、Ief基因、gryB基因連接組成，Ief 基因序列如SEQ ID NO: 11所示，gryB基因序列如SEQ ID NO: 12所示。(2) 2X反應(yīng)緩沖液該反應(yīng)緩沖液含有30-60mmol/L (優(yōu)選40mmol/L) ρΗ8· 8的Tris-HCl，16-30mmol/L(優(yōu)選 20mmol/L)的 KCl，10_30mmol/L(優(yōu)選 20mmol/L)的(NH4)2SO4,質(zhì)量濃度為O. 1-0. 3% (優(yōu)選O. 2%)的Triton X-100,由濃度均為2. 0-3. 6mmol/L (優(yōu)選
2.8mmol/L)的 dATP、dTTP、dCTP、dGTP 組成的 dNTPs，O. 1-2. OmmoI/L (優(yōu)選 I. 6mmol/L)的甜菜堿(C5H11NO2),以及 14_18mmol/L (優(yōu)選 16mmol/L)的 MgCl2。(3)濃度為6_12υ/μ I (優(yōu)選8U/μ I)的BstDNA聚合酶(大片段，美國NEB公司)。(4)顯色液濃度為2_20mmol/L (優(yōu)選4mmol/L)的金屬離子指示劑HNB (hydroxynaphthol blue,羥基萘酚藍(lán))儲存液，在反應(yīng)前加入反應(yīng)體系內(nèi)，從而實現(xiàn)不開蓋可視化檢測。具體地，指示劑HNB購自美國Sigma-Alorich公司，貨號CAS 63451_35_4，規(guī)格33936-10G ;該指示劑加入反應(yīng)體系后的終濃度為120-160 μ mol/L。需要說明的是，以上(2)的配方、(3)的濃度以及(4)的濃度是決定顯色劑在擴(kuò)增前加入反應(yīng)體系仍能正常顯色并且重復(fù)性良好的重要因素，是申請人經(jīng)過反復(fù)實驗、深入研究才得出的，是申請人付出大量心血的結(jié)晶。實施例3 以LAMP法檢測炭疽桿菌的快速可視化檢測方法本實施例檢測方法采用實施例2試劑盒進(jìn)行檢測。本實施例檢測方法包括以下步驟第一步、向透明反應(yīng)管A、B中分別加入體積相同的試劑盒2X反應(yīng)緩沖液、I管或II管的引物混合液、BstDNA聚合酶、顯色液、超純水，然后混合，得到體積相同的反應(yīng)液A、B ;其中反應(yīng)管A中加入I管的引物混合液，反應(yīng)管B中加入II管的引物混合液；試劑盒2X反應(yīng)緩沖液、I管或II管的引物混合液、BstDNA聚合酶、顯色液、超純水的體積比為(8-12)(I. 5-3. 5) (0. 5-1. 5) (0. 3-0. 9) (3. 1-4. 7)；例如，反應(yīng)液A可以按下表得到
權(quán)利要求
1.一種用于LAMP檢測炭疽桿菌的引物，其特征是，包括Ief引物序列集和gyrB引物序列集；其中， Ief引物序列集包括外引物對LF-F3和LF-B3，以及內(nèi)引物對LF-FIP和LF-BIP ;LF_F3的序列如SEQ ID NO: I所示，LF-B3的序列如SEQ ID NO: 2所示，LF-FIP的序列如SEQ IDNO: 3所示，LF-BIP的序列如SEQ ID NO:4所示； gyrB引物序列集包括外引物對gy_F3和gy_B3,內(nèi)引物對gy_FIP和gy-BIP,以及環(huán)引物對gy-LF和gy-LB ；gy-F3的序列如SEQ ID NO: 5所示，gy-B3的序列如SEQ ID NO:6所示，gy-FIP的序列如SEQ ID NO: 7所示,gy-BIP的序列如SEQ ID NO: 8所示,gy-LF的序列如SEQ ID N0:9所示，gy-LB的序列如SEQ ID NO: 10所示。
2.一種雙重LAMP檢測炭疽桿菌的試劑盒，其特征是，包括權(quán)利要求I所述用于LAMP檢測炭疽桿菌的引物。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述雙重LAMP檢測炭疽桿菌的試劑盒，其特征是，還包括2X反應(yīng)緩沖液，所述反應(yīng)緩沖液含有30-60mmol/L pH8. 8的Tris_HCl，16-30mmol/L的KC1，10-30mmol/L 的(NH4) 2S04，質(zhì)量濃度為 0· 1-0. 3% 的 TritonX-100，由濃度均為 2· 0-3. 6mmol/L 的 dATP、dTTP、dCTP、dGTP 組成的 dNTPs，0. 1-2. OmmoI/L 的甜菜堿 C5H11NO2,以及14~1 Hmmol /I,的 MgCl2。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述雙重LAMP檢測炭疽桿菌的試劑盒，其特征是，還包括濃度為6-12U/ μ I的BstDNA聚合酶，以及濃度為2-20mmol/L的金屬離子指示劑HNB儲存液。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述雙重LAMP檢測炭疽桿菌的試劑盒，其特征是，還包括陽性對照品:濃度為20-100mg/L的含有炭疽桿菌Ief基因片段及gyrB基因片段的質(zhì)粒PGEM-lef-gyrb。
6.一種雙重LAMP檢測炭疽桿菌的快速可視化檢測方法，其特征是，采用權(quán)利要求5所述雙重LAMP檢測炭疽桿菌的試劑盒，該方法包括以下步驟 第一歩、向透明反應(yīng)管A、B中分別加入體積相同的試劑盒2X反應(yīng)緩沖液、I管或II管的引物混合液、BstDNA聚合酶、顯色液、超純水，然后混合，得到體積相同的反應(yīng)液A、B ;其中反應(yīng)管A中加入I管的引物混合液，反應(yīng)管B中加入II管的引物混合液；試劑盒2X反應(yīng)緩沖液、I管或II管的引物混合液、BstDNA聚合酶、顯色液、超純水的體積比為(8-12)(I. 5-3. 5) (0. 5-1. 5) (0. 3-0. 9) (3. 1-4. 7)； 第二步、向反應(yīng)管A、B中分別加入體積相同的待測核酸樣品，蓋好反應(yīng)管A、B后混勻； 第三步、將反應(yīng)管A、B先分別在60°C _64°C恒溫條件下放置45-80min進(jìn)行LAMP擴(kuò)增，再置于80°C -95°C 5-10min滅活BstDNA聚合酶； 第四步、觀察反應(yīng)液A、B的顔色，若兩者顏色均為天藍(lán)色，則待測核酸樣品的來源含有炭疽桿菌強(qiáng)毒株或弱毒株；若兩者顏色均為紫羅蘭色，則待測核酸樣品的來源不含炭疽桿菌；若反應(yīng)液A顏色為紫羅蘭色，且反應(yīng)液B顔色為天藍(lán)色，則待測核酸樣品的來源含有炭疽桿菌弱毒株或無毒株；若反應(yīng)液A顔色為天藍(lán)色，且反應(yīng)液B顏色為紫羅蘭色，則待測核酸樣品的來源含有具有毒性質(zhì)粒PXOl的蠟樣芽胞桿菌。
7.ー種針對權(quán)利要求5所述雙重LAMP檢測炭疽桿菌的試劑盒的檢驗方法，其特征是，包括以下步驟 第一歩、制備兩套含反應(yīng)液A的反應(yīng)管A、含反應(yīng)液B的反應(yīng)管B :向透明反應(yīng)管A、B中分別加入體積相同的試劑盒2X反應(yīng)緩沖液、I管或II管的引物混合液、BstDNA聚合酶、顯色液、超純水，然后混合，得到體積相同的反應(yīng)液A、B ;其中反應(yīng)管A中加入I管的引物混合液，反應(yīng)管B中加入II管的引物混合液；試劑盒2X反應(yīng)緩沖液、I管或II管的引物混合液、BstDNA 聚合酶、顯色液、超純水的體積比為(8-12) (I. 5-3. 5) (O. 5-1. 5) (O. 3-0. 9)(3. 1-4. 7)； 第二步、向第一套反 應(yīng)管A、B中分別加入體積相同的蒸懼水,蓋好反應(yīng)管A、B后混勻，作為陰性對照；向第二套反應(yīng)管A、B中分別加入體積相同的陽性對照品，蓋好反應(yīng)管A、B后混勻，作為陽性對照；蒸餾水、陽性對照品的加入體積相同； 第三步、將反應(yīng)管A、B先分別在60°C _64°C恒溫條件下放置45-80min進(jìn)行LAMP擴(kuò)增，再置于80°C -95°C 5-10min滅活BstDNA聚合酶； 第四步、觀察陰性對照反應(yīng)液A、B和陽性對照反應(yīng)液A、B的顔色，若陰性對照反應(yīng)液A、B顔色均為紫羅蘭色，且陽性對照反應(yīng)液A、B顔色均為天藍(lán)色，則第一歩所用試劑盒是正常的；若各反應(yīng)液顏色與前述情況不完全相符或完全不相符，則第一歩所用試劑盒不正常。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于以LAMP法檢測炭疽桿菌的引物、雙重LAMP檢測炭疽桿菌的試劑盒、雙重LAMP檢測炭疽桿菌的快速可視化檢測方法、以及針對該試劑盒的檢驗方法。該引物包括lef引物序列集和gyrB引物序列集，既可以檢測炭疽桿菌質(zhì)粒pX01，又可以檢測炭疽桿菌染色體。該試劑盒包括前述引物，可獲得準(zhǔn)確的檢測結(jié)果。該檢測方法采用前述試劑盒進(jìn)行，可不用開蓋即實現(xiàn)可視化檢測，避免出現(xiàn)假陽性現(xiàn)象，無需使用昂貴的實時濁度儀。該檢驗方法可確保使用正常的試劑盒來得到可靠的結(jié)果。本發(fā)明結(jié)果可靠，成本相對較低，尤其適用于條件簡陋的衛(wèi)生事件現(xiàn)場。
文檔編號C12N15/11GK102816849SQ20121030698
公開日2012年12月12日 申請日期2012年8月24日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月24日
發(fā)明者張錦海, 王長軍, 譚維國, 呂恒, 曹勇平 申請人:中國人民解放軍南京軍區(qū)軍事醫(yī)學(xué)研究所