專利名稱：一種中國人舌部鱗狀上皮細胞癌細胞系ctsc-2及其建立方法
技術領域：
本發(fā)明涉及人舌部鱗狀上皮細胞癌細胞技術領域，具體地，涉及一種中國人舌部鱗狀上皮細胞癌細胞系CTSC-2及其建立方法。
背景技術：
I. I舌部鱗狀上皮細胞癌的發(fā)病與預后舌癌是最常見的口腔鱗狀上皮細胞癌，常發(fā)生在舌前2/3處。舌癌高發(fā)于東南亞，以印度為最高，年發(fā)生率達到9. 4/100萬。近年來研究顯示，世界范圍內舌癌總發(fā)生率逐步提高，而且有年輕化的趨勢。由于其發(fā)生部位的組織學特點以及舌癌的生物學特性，舌癌使患者舌部運動受限，導致吞咽、說話、進食困難。另外，舌癌易轉移，預后較差。I. 2腫瘤干細胞研究的進展I. 2. I腫瘤干細胞理論的提出與發(fā)展傳統(tǒng)觀念認為，腫瘤是一群由體細胞突變，獲得無限增殖能力的細胞組成，但是小鼠致瘤實驗和體外克隆形成實驗結果表明，并非所有的腫瘤細胞都可以增殖。說明腫瘤不是一個均質的個體，它具有異質性，在組織中存在不同的細胞亞群。腫瘤組織中可能有一部分具有干細胞特性的細胞，這類型細胞被稱為腫瘤干細胞(cancer stem cell, CSC)。腫瘤干細胞理論最早在白血病中被證實，1994年Lapidot等通過FACS利用細胞表面標志⑶34+⑶38-和小鼠致瘤模型中分離出人急性粒細胞白血病(Acutemyeloidleukemia，AML)干細胞，隨后，Bonnet等發(fā)現(xiàn)只有⑶34+/⑶38-白血病細胞能在非糖尿病重度聯(lián)合免疫缺陷(nonobese diabetic/severe combined immunodeflcient, N0D/SCID)小鼠體內致瘤。2003年，Clarke等第一次將腫瘤干細胞理論運用到實體瘤中，他們在乳腺癌 中證實了這個觀點，⑶44+⑶24-/low細胞只需要100個便可以致瘤。之后，研究發(fā)現(xiàn)膠質母細胞瘤等腦腫瘤、肝癌、肺癌等癌癥中也能分離出腫瘤干細胞，支持了這個學說。2006年，AACR(American As sociation for Cancer Research)對腫瘤干細胞做出了定義腫瘤中具有自我更新能力，并能產(chǎn)生異質性腫瘤細胞的細胞。它具有三大特性1、分化能力腫瘤干細胞在腫瘤中擔任形成和分化各類型腫瘤細胞的角色，在腫瘤生長過程中，不斷補充所需的各類腫瘤細胞。2、自我更新能力生成一部分與自己相同的，具有增殖、擴張和分化潛能的細胞，從而維持干細胞的衡定。3、穩(wěn)態(tài)控制能力調節(jié)和平衡腫瘤的分化，根據(jù)環(huán)境的刺激對腫瘤做出調控。I. 2. 2腫瘤干細胞在口腔癌中的研究及其應用口腔癌同一癌灶組織內包含有不同分化程度、不同階段的癌細胞。有研究證實，頭頸部鱗狀上皮細胞癌中存在一群具有自我更新、多向分化潛能和有致瘤能力的癌細胞。腫瘤干細胞大多處于休眠狀態(tài)，對放、化療不敏感，是導致手術后腫瘤易復發(fā)、耐藥強、難治愈的根源，腫瘤干細胞理論的提出可以使治療的目標從腫瘤整體轉移至腫瘤干細胞，提出針對癌細胞和腫瘤干細胞相結合的綜合性治療策略。腫瘤干細胞的研究也為腫瘤的研究帶來了一個新的思路。I. 3細胞系的建立建立腫瘤細胞系是研究腫瘤致關重要的環(huán)節(jié)。細胞系廣泛應用于生物學各個研究領域。它是指直接從生物體的組織中分離培養(yǎng)出細胞，為后續(xù)研究提供穩(wěn)定細胞系的一種方法。細胞系是研究特定細胞的生長、代謝、調控特性，細胞與細胞間相互作用，細胞與基質的相互作用等有效的研究材料。人類的第一株連續(xù)細胞系是1951年由George Otto Gey實驗室建立的子宮頸癌細胞系(Hela)，這株細胞系的建立是人體細胞體外培養(yǎng)的里程碑，Hela細胞推進了細胞、基因、病毒、疫苗等許多研究領域的進程，也加深了人們對腫瘤的認識發(fā)現(xiàn)腫瘤的各種特性、研究腫瘤發(fā)生發(fā)展的原因和過程、篩選抗癌藥物等。除了研究細胞本身的特性和癌癥的發(fā)生發(fā)展外，還應用于遺傳、免疫、分化、發(fā)育的研究領域。此外，國內外不少企業(yè)還可以利用細胞進行生產(chǎn)各種因子、蛋白等。細胞的廣泛應用推動了細胞生物學的蓬勃發(fā)展?！?br> 原代培養(yǎng)主要有機械法和酶消化法。機械法主要是利用物理剪切，直接將組織剪碎，然后將這些組織小塊貼壁培養(yǎng)的方法。酶消化法是應用適當?shù)拿噶呀饨M織從而分離出單細胞，直接懸浮或貼壁培養(yǎng)的方法。用于消化的酶主要有胰蛋白酶、膠原酶、鏈酶蛋白酶、透明質酸酶等。鱗狀上皮細胞癌細胞系的鑒定有以下幾個方面1、病理切片鑒定世界衛(wèi)生組織(WH0，2005)根據(jù)細胞和細胞核的多形性、細胞分裂狀態(tài)、角化程度等將其分為高、中、低三級。高分化鱗癌與正常鱗狀上皮類似、角化明顯、核分裂相少、細胞和細胞核多形性不明顯；中分化鱗癌角化較少見，核分裂相多、細胞多形性明顯；低分化鱗癌有大量的核分裂相、細胞多形性明顯、角化非常少見；2、細胞形態(tài)一般為多角形上皮樣，核質比高，核仁清晰個數(shù)較多，細胞排列緊密后呈鋪路石樣；3、細胞間橋粒連接相鄰細胞之間的膜上有一塊圓形區(qū)域，負責細胞間的連接、通訊、抵抗外力拉扯，橋粒多見于上皮，皮膚、口腔、食管等處的復層扁平上皮細胞間較多，能被胰蛋白酶、膠原酶及透明質酸酶所破壞，電鏡下可見致密斑和中間纖絲，上皮細胞中多是角蛋白絲；4、分子標志主要是細胞角蛋白(cytokeratin,CK)，特異地表達于上皮細胞，是構成上皮細胞內細胞骨架的中間纖絲類蛋白質，共有20種，CKI-9是偏堿性或中性的II型角蛋白，CK10-20是偏酸性的I型角蛋白，這些角蛋白一般表達于特定的器官或組織，CK8、CK18、CK19常表達于單層上皮。鱗狀上皮細胞癌的上述特征為分析新建立的舌部鱗狀上皮細胞癌細胞系的生物學特性提供了理論依據(jù)。第一株舌部鱗狀上皮細胞癌細胞系建立于1981年，是由日本報道的，這一株細胞系未能使小鼠致瘤。而后1983年在我國上海報道建立了一株舌癌Tca8113,1995在我國香港報道建立了一株舌癌細胞系PWH-S1?，F(xiàn)存在American type culture colIection(ATCC)中的舌癌細胞系共有5株，分別為SCC-15、SCC-4、SCC-25、SCC-9、CAL27，均是20世紀80年代的，之后鮮有報道。不同舌癌細胞的生物學特性會存在差異，這種差異源于患者本身和接受治療的方法。有些舌癌的分化度低，惡性程度高；有些舌癌的分化度高，惡性程度低。有些患者在術前接受化療，因此術后所得到的細胞有較高的耐藥性。正是這種差異的存在，使我們對舌癌的多樣性和復雜性有了更多的認識，而存在差異的舌癌細胞系便成為研究舌癌發(fā)生發(fā)展的有效體外模型。

發(fā)明內容
為此，本發(fā)明提供了一種中國人舌部鱗狀上皮細胞癌細胞系CTSC-2及其建立方法。本發(fā)明的技術方案如 下中國人舌部鱗狀上皮細胞癌細胞系CTSC-2的建立方法，包括如下具體步驟A)采用組織塊貼壁法進行舌部鱗狀上皮細胞癌細胞的原代培養(yǎng)；B)當細胞密度達到約80%的時候進行傳代培養(yǎng)；C)將傳代穩(wěn)定的細胞經(jīng)RT-PCR檢測表明細胞表達人舌部鱗狀上皮細胞癌細胞標志性分子CK8、18、19 ；D)經(jīng)免疫印跡實驗檢測貼壁細胞表達人舌部鱗狀上皮細胞癌細胞標志性分子CK8U8蛋白，由此從分子水平上證明成功建立中國人舌部鱗狀上皮細胞癌細胞系CTSC-2。所述的中國人舌部鱗狀上皮細胞癌細胞系CTSC-2的建立方法，步驟A的具體方法為I) I型膠原包被培養(yǎng)皿，室溫靜止I小時以上，IXPBS洗皿一次，待用；2)準備培養(yǎng)液，放于37°C恒溫水浴鍋中溫育10分鐘；3)在超凈臺中取出舌部鱗狀上皮細胞癌組織，在酒精中消毒不超過10秒，在IXPBS中浸泡一下，除去不需要的部位，放到培養(yǎng)液中；4)將組織剪成小碎塊，均勻分種入培養(yǎng)皿中，加入適量培養(yǎng)液，使組織一半浸于培養(yǎng)液中；5)置于37°C，5%C02的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；6)第二天補充適量培養(yǎng)液至稍稍浸沒組織塊；7)視細胞生長情況進行適當換液。所述的中國人舌部鱗狀上皮細胞癌細胞系CTSC-2的建立方法，步驟B的具體方法為I)棄培養(yǎng)液，用I XPBS洗一次，加入胰蛋白酶消化；2)加入血清終止消化；3)吹打細胞，置于離心管中，加入適量的培養(yǎng)液吹打；4)離心 lOOOrpm，5 分鐘；5)棄上清，加入適量培養(yǎng)液吹打散；6)將細胞懸液加入新的培養(yǎng)皿中，得到所述中國人舌部鱗狀上皮細胞癌細胞系CTSC-2。所述的中國人舌部鱗狀上皮細胞癌細胞系CTSC-2在研究治療人舌部鱗狀上皮細胞癌的藥物中的用途。所述的中國人舌部鱗狀上皮細胞癌細胞系CTSC-2在治療人舌部鱗狀上皮細胞癌的藥物中的用途。所述中國人舌部鱗狀上皮細胞癌細胞系CTSC-2已經(jīng)在中國典型培養(yǎng)物保藏中心(武漢大學保藏中心)進行保藏。本發(fā)明的有益效果為本發(fā)明建立了中國人舌部鱗狀上皮細胞癌細胞系CTSC-2，為研究人舌部鱗狀上皮細胞癌的特性及其治療藥物提供了物質基礎。


圖I、細胞來源患者組織切片H&E染色，光鏡下觀察原代細胞和CTSC-2第16代傳代細胞系的細胞形態(tài)。圖2、透射電鏡下觀察CTSC-2細胞的超微結構圖。圖3、瓊脂糖凝膠檢測正常頰粘膜細胞、CAL27舌癌細胞系、CTSC-2細胞的CK8、18、19的mRNA的表達情況；圖4、Western免疫印跡方法檢測CAL27舌癌細胞系、CTSC-2細胞的CK8、18和 E-cadherin的蛋白表達情況。圖5、CTSC-2細胞染色體顯示；圖6、隨機選擇計算了 100個分散均勻的CTSC-2細胞染色體后用SSCP統(tǒng)計所得結
果O圖7、CTSC-2細胞的細胞生長曲線；圖8、CTSC-2細胞的克隆形成；圖9、CTSC-2CTSC-2細胞小鼠移植瘤組織切片H&E染色；圖10、免疫熒光檢測 CTSC-2 細胞系對 CD133，Sox2, Nanog, 0ct4, SSEA-1, SSEA-4,TRA-1-60, TRA-1-81 的表達；圖11、無血清懸浮培養(yǎng)富集CTSC-2細胞系腫瘤干細胞及其形態(tài)學觀察；圖12、H&E染色CTSC-2球囊細胞；圖13、CTSC-2球囊細胞和貼壁細胞對CK8、CK18、CK19的表達；圖14、CTSC_2貼壁細胞和球囊細胞在BME中的克隆形成統(tǒng)計結果；圖15、流式細胞儀檢測CTSC-2球囊細胞和貼壁細胞的干細胞分子標志物表達的對比；圖16、用脂肪誘導培養(yǎng)的方法檢測CTSC-2球囊細胞的分化能力結果。
具體實施例方式以下將結合具體實施例對本發(fā)明所述中國人舌癌細胞系CTSC-2的建立方法進一步說明。一、舌部鱗狀上皮細胞癌細胞系CTSC-2的建立以及特性鑒定材料說明I臨床標本本實驗所用的口腔組織均取自中山大學附屬光華口腔醫(yī)院手術切除標本。2細胞系本實驗所用的舌部鱗狀上皮細胞癌CAL27細胞株購自ATCC。3主要儀器儀器名稱儀器廠家儀器名稱儀器廠家
PCR擴增儀Eppendorf垂直轉頭低速離心機 Thermo
高速冷凍離心機Thermo蟠動泵Millpore
電動移液槍Drummond負壓栗Millpore
可調微量移液器Thermo紅外南方牛.化
電子分析天平Sartorius流式細胞儀Bi!
凝膠成像系統(tǒng)GE 動脫水機Thermo 水平電泳系統(tǒng)TOYOBO組織包趣機Thermo
乘直電泳系統(tǒng)Bio-rad組織切片機Thermo
T-式恒溫器海門其林W爾4Γ冰箱海爾
烘箱Thermo蠕動泵Millpore
PH計Sartorious負壓象Millpore
純水系統(tǒng)ELGA紅外南方牛:化
電動玻璃勻漿機寧波新芝牛:物科技流式細胞儀BD
紫外分光光度計Nanodrop ThermoA動脫水機Thermo
超凈工作臺Esco組織包埋機Thermo
倒置熒光顯微鏡Nikon組織切片機Thermo
細胞計數(shù)儀Beckman4°C冰箱海爾
CO培養(yǎng)箱SHELLAB
24、主要試劑試劑名稱廠家試劑名稱廠家
瓊脂糖SipanReal Envision〔抗檢測系統(tǒng) Gene Tech
低熔點瓊脂糖AuiiFBS胎牛血淸GIBCO
RT-PCR KitToYoBo胰酶GIBCO
DL2000 DNA Ladder MarkerTakaraDMSOSigma
PCR 上樣 bufferTakaraG418GIBCO
30%丙烯酰胺膠溶液(37. 5:1，29:1) Bio-rad預染釀rkerPromega
TEMEDWakoRAPI上海閃晶
過硫酸銨fcko脫脂奶粉威佳
SDSSigma石蠟Leica
EDTAAmrescoDNA 提取試劑盒QIGEN
TrizolInvitrogen SSCP 試劑盒GE
RNAlaterAmbionPISigma
Nuclease-Free WaterAmbionI 型鼠尾膠原Sigma
甲酰胺Woko牛腦提取物BPEInvitroge
E
各種墻養(yǎng)基粉劑SigmaReal Envision二抗檢測系統(tǒng)Gene Tech
發(fā)光Hiar kerCST其他試劑為國產(chǎn)分析純5主要溶液以及配方5. I細胞培養(yǎng)I) IOXPBS Buffer:NaCl 80g, KCl 2g, Na2HPO4 11. 55g, KH2PO4 2g，加入約 800ml
的超純水，磁力攪拌器充分攪拌溶解，調節(jié)PH值至7. 4，定容至1L，高溫高壓滅菌后，室溫保存。2)胎牛血清(FBS):購自Hyclone公司，4°C保存，和培養(yǎng)基配成適當比例。3) IOXTrypsin-EDTA(TE):稱取 I. 25g trypsin, I. OOg EDTA 溶解于 250ml 的IXPBS中，過濾除菌，-20°C保存。使用前用IXPBS buffer稀釋成適當濃度消化細胞。4)DMEM/F12 (DF)培養(yǎng)基溶解于IL的超純水中，調節(jié)pH值到7. 2，利用蠕動泵和0.22 μ m濾膜過濾除菌。4°C保存。2XDF分量加倍，水量不變。DF (-)表示不加入Ampicillin 和 Kanamycin。5)鼠尾I型膠原原代培養(yǎng)時，用IXPBS稀釋成1%的濃度，每個六厘米的皿上加入I. 5mL覆蓋皿底，室溫包被I小時以上。6)軟瓊脂soft agar加超純水,高溫高壓滅菌配成O. 66%和I. 33%。7)秋水仙素40 μ g/mL母液,最終使用濃度為O. 2 μ g/mL。8)舌癌原代培養(yǎng)液DF+10%FBS。
5. 2核酸電泳I) 50XTAE 電泳 Buffer (ρΗ8· 5):在 IL 的玻璃瓶中加入 242g Tris,18. 6gNa2EDTA ·2Η20，然后加入約800ml的二級水，充分攪拌溶解，再加入57. Iml的醋酸，充分攪拌，加二級水定容至1L，室溫保存。使用時以1:50稀釋。2)溴化乙錠(EB):儲存液濃度為10mg/ml，工作濃度為O. 5μ g/ml。3) 1%瓊脂糖電泳凝膠稱取Ig瓊脂糖(agarose),加入100ml I XTAEbuffer,力口熱煮沸至瓊脂糖完全溶解，冷至50°C左右，加入5μ I EB儲存液，使終濃度為O. 5 μ g/ml，搖勻后灌制凝膠平板。5. 3ffestern 免疫印跡I)蛋白裂解液(RIPA):
4BZjf 液HiJ體系
50 mil Tris pH8, OIM Tris pH8, O2.5 ml
150 mM NaCloM NaCII, 5 ml
I mM EDTA0. oM EDTA0, I ml
1% Triton x-100Triton x-1000. 5 ml
0.1% SDS10% SDS0.5ml
0.25% Sodium deoxycholat.e Sodium deoxycholate 0. 125 g
dd waterFiJl up to 500 ml 44.9 ml2)蛋白酶抑制劑EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail 藥片(Roche, Cat.No. 04 69 3159 001) ;cocktail 中包含有 Pancreas-extract, Thermolysin (Metalloprotease), Chymotrypsin, Trypsin, Papain 等蛋白酶抑制劑。一片藥片加 ImllXPBS 配成10XcocktaiI儲存液，使用時稀釋成IX。3)蛋白定量按照GE 2-D Quant Kit說明書進行。4)1M Tris-HCl (pH6. 8):稱量 121. Ig Tris 置于 IL 瓶子中，加入約 800ml 的二級
水，充分攪拌溶解，用溶鹽酸調節(jié)PH值至6. 8，將溶液定容至1L，高溫高壓滅菌后，室溫保存。5)1. 5M Tris-HCl (pH8. 8):稱量 181. 7g Tris 置于 IL 瓶子中，加入約 800ml 的二
級水，充分攪拌溶解，用溶鹽酸調節(jié)PH值到8. 8，將溶液定容至1L。高溫高壓滅菌后，室溫保存。6)10%(ff/V)過硫酸銨稱I. Og過硫酸銨，加入IOml 二級水充分溶解，4°C暫時保存?；蚍盅b成100 μ I小份，密封，-20°c保存。7)5XTris-Glycine Buffer (SDS-PAGE 電泳緩沖液)稱取 15. lgTris，94g甘氨酸，
5.Og SDS，加二級水定容至1L，室溫保存。使用時用二級水稀釋成IX緩沖液。8) 5XSDS-PAGE Loading Buffer :在 50ml 的塑料離心管中加入 I. 25ml 的 IMTris-HCl (pH6. 8), 0. 5g SDS, 25mg溴酹藍,2. 5ml甘油，然后加二級水定容至50ml,稍加熱溶解后，小份(Iml/管)分裝后，室溫保存。使用前每Iml Loading Buffer加入50 μ I 2-巰基乙醇或O. 25ml的IM DTT，充分混勻，室溫保存。9) 5% 濃縮膠
試劑體積(mL)
二級水2.01
30%Arc-Bis (體積比37. 5:1)0.5
I,OMTris-HCl (p冊.8)O. 375
ICWSDS0.03
10% APSO. 03
TEMEDO.003
Total310) 10% 分離膠
試劑體積(mL)
二級水5. 95
30%Arc-Bi s (體積比37. 5:1)5
I.5MTris-HCl(pH8.8)3. 75
101SDSO. 15
10% APSO. 15
TEMED0.006
Total1511)轉膜液2. 9g Glycine, 5. 8g Tris，0.37g SDS，200ml 的甲醇，用二級水定容至1L,室溫保存。12)1XTBST buffer 8. 8g NaCl，20ml 的 IM Tris-HCl (ρΗ8· 0)，加約 800ml 的二級水，充分攪拌溶解，用二級水定容至1L,最后加入I. Oml Tween 20后充分混勻，室溫保存。13)封閉液稱取O. 5g脫脂奶粉加至IOml TBST buffer中，充分混勻溶解，現(xiàn)配現(xiàn)用。14) ECL 發(fā)光液pierce ECL enhance chemiluminescent westhern blottingsubstrate,購自Thermo,使用前I: I混合兩種液體，現(xiàn)配現(xiàn)用。5. 4組織化學I) 10%福爾馬林液50mL甲醛溶液(37%_40%)加到450mLl XPBS中，室溫保存。2)4% 多聚甲醒(4%PFA):將 20g 的 paraformaldehyde 倒入 400mL 的 I XPBS 中，65°C溶解，溶解時每隔10-20分鐘搖勻一下，近于完全溶解時，加入40 μ I的IM Na0H，lXPBS定容至500mL，混勻后降溫至室溫，4°C保存。5. 5 抗體
權利要求
1.中國人舌部鱗狀上皮細胞癌細胞系CTSC-2的建立方法,其特征在于,包括如下具體步驟 A)采用組織塊貼壁法進行舌部鱗狀上皮細胞癌細胞的原代培養(yǎng)； B)當細胞密度達到約80%的時候進行傳代培養(yǎng)； C)將傳代穩(wěn)定的細胞經(jīng)RT-PCR檢測表明細胞表達人舌部鱗狀上皮細胞癌細胞標志性分子 CK8、18、19 ； D)經(jīng)免疫印跡實驗檢測貼壁細胞表達人舌部鱗狀上皮細胞癌細胞標志性分子CK8、18蛋白，由此從分子水平上證明成功建立中國人舌部鱗狀上皮細胞癌細胞系CTSC-2。
2.如權利要求I所述的中國人舌部鱗狀上皮細胞癌細胞系CTSC-2的建立方法，其特征在于，步驟A的具體方法為 O I型膠原包被培養(yǎng)皿，室溫靜止Ih以上，IXPBS洗皿一次，待用； 2)準備培養(yǎng)液，放于37°C恒溫水浴鍋中溫育10分鐘； 3)在超凈臺中取出舌部鱗狀上皮細胞癌組織，在酒精中消毒不超過10秒，在IXPBS中浸泡一下，除去不需要的部位，放到培養(yǎng)液中； 4)將口腔組織剪成小碎塊，均勻分種入培養(yǎng)皿中，加入適量培養(yǎng)液，使組織一半浸于培養(yǎng)液中； 5)置于370C, 5%C02的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)； 6)第二天補充適量培養(yǎng)液至稍稍浸沒組織塊； 7)視細胞生長情況進行適當換液。
3.如權利要求I所述的中國人舌部鱗狀上皮細胞癌細胞系CTSC-2的建立方法，其特征在于，步驟B的具體方法為 O棄培養(yǎng)液，用IXPBS洗一次，加入胰蛋白酶消化； 2)加入血清終止消化； 3)吹打細胞，置于離心管中，加入適量的培養(yǎng)液吹打；4)離心IOOOrpm, 5min ； 5)棄上清，加入適量培養(yǎng)液吹打散； 6)將細胞懸液加入新的培養(yǎng)皿中，得到所述中國人舌部鱗狀上皮細胞癌細胞系CTSC-2。
4.如權利要求I所述的中國人舌部鱗狀上皮細胞癌細胞系CTSC-2在研究治療人舌部鱗狀上皮細胞癌的藥物中的用途。
5.如權利要求I所述的中國人舌部鱗狀上皮細胞癌細胞系CTSC-2在治療人舌部鱗狀上皮細胞癌的藥物中的用途。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種中國人舌部鱗狀上皮細胞癌細胞系CTSC-2的建立方法，為研究人舌部鱗狀上皮細胞癌的特性及其治療藥物提供了物質基礎。該方法包括如下具體步驟采用組織塊貼壁法進行舌部鱗狀上皮細胞癌細胞的原代培養(yǎng)；當細胞密度達到約80%的時候進行傳代培養(yǎng)；將傳代穩(wěn)定的細胞經(jīng)RT-PCR檢測表明細胞表達人舌部鱗狀上皮細胞癌細胞標志性分子CK8、18、19；經(jīng)免疫印跡實驗檢測貼壁細胞表達人舌部鱗狀上皮細胞癌細胞標志性分子CK8、18蛋白，由此從分子水平上證明成功建立中國人舌部鱗狀上皮細胞癌細胞系CTSC-2。
文檔編號C12N5/09GK102911916SQ20121030699
公開日2013年2月6日 申請日期2012年8月24日 優(yōu)先權日2012年8月24日
發(fā)明者張雁, 賀姮, 張海霞, 汪華 申請人:東莞中山大學研究院