專利名稱：一種組織工程角膜的制備方法及其裝置的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于組織工程學(xué)醫(yī)用生物材料技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種臨床移植用組織工程角膜的制備方法及其裝置。
背景技術(shù)：
角膜為透明、無血管的組織結(jié)構(gòu)，從外至內(nèi)分為上皮細(xì)胞層、前彈力層、基質(zhì)層、后彈力層和內(nèi)皮細(xì)胞層。其中上皮細(xì)胞層由5 7層上皮細(xì)胞構(gòu)成，由外至內(nèi)為表層、基底上層和基底層；基底層與前彈力層之間存在著細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)沉積形成的基底膜結(jié)構(gòu)，基底層由單層柱狀基底層細(xì)胞組成，含有大量干細(xì)胞，向上分裂不斷產(chǎn)生子代細(xì)胞；子代細(xì)胞分化為2 3層翼狀細(xì)胞基底上層，對角膜上皮細(xì)胞層的營養(yǎng)與結(jié)構(gòu)支持起到重要作用；表 層細(xì)胞進(jìn)一步分化形成未角化的扁平多邊形細(xì)胞，具有良好的屏障功能；角膜緣位于角膜與鞏膜之間為環(huán)狀結(jié)構(gòu)，縱貫上皮細(xì)胞層(角膜與鞏膜之間無明顯界限，呈過渡狀，角膜緣為圓環(huán)狀，一部分在角膜上，一部分在鞏膜上)，是角膜的干細(xì)胞池，由角膜緣干細(xì)胞分裂產(chǎn)生的新細(xì)胞由邊緣向中心移動和增殖，以及由基底層細(xì)胞產(chǎn)生的子代細(xì)胞向表層更新，共同維持角膜上皮細(xì)胞層的結(jié)構(gòu)與功能。外傷、感染、遺傳因素均能導(dǎo)致角膜結(jié)構(gòu)損傷，引起視力下降甚至失明，角膜盲是致盲的主要原因之一。目前角膜盲最好的治療方式為角膜移植，我國約有500萬患者，并以每年150 200萬的速度遞增。由于供體角膜來源的稀缺限制了角膜移植術(shù)的開展，每年接受異體移植的患者僅3000例左右。為解決這一問題，近年來有大量的研究致力于角膜替代物的研發(fā)。由于人工合成材料所制備角膜替代物的成分單一，難以形成天然角膜的微觀結(jié)構(gòu)，且在透明度、機(jī)械強(qiáng)度、穩(wěn)定性、生物相容性等方面存在著不足。因此，以動物源性的角膜經(jīng)過脫細(xì)胞處理后形成的免疫原性較低的角膜基質(zhì)，因具有接近天然角膜的膠原排列結(jié)構(gòu)和良好的力學(xué)性能而獲得廣泛認(rèn)可。但是角膜病損常伴有復(fù)雜的炎癥反應(yīng)、大量血管新生，尤其是熱、化學(xué)性燒傷，史蒂文斯-約翰遜綜合癥，眼表瘢痕化天皰瘡等引起的角膜緣干細(xì)胞缺乏可致角膜結(jié)膜化，形成炎性瘢痕組織，大量血管新生，是角膜盲的重要病因之一。在這類高危角膜移植中，普通的脫細(xì)胞角膜基質(zhì)，甚至異體角膜移植也很難獲得長期有效的結(jié)果。因此治療這類高危適應(yīng)癥，必須同時(shí)重建角膜上皮功能并以透明基質(zhì)替換原有不透明的瘢痕組織。基于這兩點(diǎn)，具有自我更新的上皮細(xì)胞層結(jié)構(gòu)的組織工程角膜是未來角膜替代物發(fā)展的方向。傳統(tǒng)的脫細(xì)胞角膜(如中國專利200410018107. 5和200810026972. 2)僅能提供角膜基質(zhì)，缺乏具有活性功能的角膜上皮結(jié)構(gòu)，不具有角膜上皮屏障功能以及角膜緣和角膜基底層細(xì)胞的更新能力，不適于高危角膜移植。中國專利申請03140113. 9公開了一種人工組織工程化的生物角膜，雖進(jìn)行了上皮及內(nèi)皮細(xì)胞的復(fù)合，但所用載體為含有基質(zhì)細(xì)胞的新鮮角膜或經(jīng)過保存處理的不含基質(zhì)細(xì)胞的角膜，其保留了細(xì)胞或是細(xì)胞殘留成分，會引起免疫排斥反應(yīng)，尤其在免疫赦免喪失的聞危移植中存在很大風(fēng)險(xiǎn)。
此外，也有文獻(xiàn)及專利報(bào)道，利用自體細(xì)胞于體外擴(kuò)增培養(yǎng)或是將干細(xì)胞種植于羊膜、纖維蛋白膠、膠原等支架材料上再移植，均存在有不足。中國專利申請03150375. 6中采用自體角膜緣細(xì)胞為種子細(xì)胞，僅適用于單側(cè)角膜緣損傷的患者，當(dāng)雙眼病損時(shí)則無法取材，并且取材對健眼存在有損傷風(fēng)險(xiǎn)；重要的是無法實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化，不能滿足患者的迫切需求。中國專利申請201110039014. O公開了一種人角膜上皮細(xì)胞系的構(gòu)建方法，其種子細(xì)胞來源存在免疫原性問題，在高危角膜移植中，免疫赦免地位被打破，增加了排斥風(fēng)險(xiǎn)；且培養(yǎng)體系中采用胎牛血清，引入了牛源性病毒的傳播風(fēng)險(xiǎn)。中國專利申請200410026031. O和200580021629. 3是以干細(xì)胞與羊膜復(fù)合形成角
膜上皮片。因羊膜基質(zhì)較薄、機(jī)械強(qiáng)度及穩(wěn)定性差，僅適用于眼表重建，需將替代損傷基質(zhì)與眼表重建分步進(jìn)行，使治療周期長、痛苦程度高。
中國專利申請200580007682. 8公開了一種將角膜上皮細(xì)胞與膠原凝膠復(fù)合形成角膜上皮片的方法。所形成的角膜上皮片機(jī)械強(qiáng)度及穩(wěn)定性較差，應(yīng)用于高危移植時(shí)，植床復(fù)雜的炎性環(huán)境及大量的基質(zhì)金屬蛋白酶均能導(dǎo)致植片降解，增加移植失敗率；而且膠原凝膠不具備天然角膜的微觀結(jié)構(gòu)，與異體移植相比，移植后與植床的融合較為困難。中國專利申請200710129136. 2公開了一種組織工程化角膜上皮移植膜的制備方法，其存在有異體細(xì)胞免疫原性和胎牛血清使用風(fēng)險(xiǎn)的問題，而且僅考慮了干細(xì)胞性的維持，未考慮角膜上皮的天然組成結(jié)構(gòu)及向心和向表層共同作用的細(xì)胞更新方式，移植后角膜上皮再次缺損的風(fēng)險(xiǎn)較大。

發(fā)明內(nèi)容
針對現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，本發(fā)明的目的是提出一種組織工程角膜的制備方法及其裝置，所制備的組織工程角膜具有天然角膜上皮細(xì)胞層結(jié)構(gòu)與功能，在移植后能實(shí)現(xiàn)細(xì)胞由邊緣向中心更新及由基底層向表層更新。本發(fā)明所提出的組織工程角膜的制備方法，包括以下步驟步驟一、接種羊膜上皮細(xì)胞將哺乳動物源性的脫細(xì)胞角膜基質(zhì)(有前彈力層和基質(zhì)層結(jié)構(gòu))置于細(xì)胞培養(yǎng)皿中，將羊膜上皮細(xì)胞按I X IO5 I X IO6個(gè)/cm2的密度接種于脫細(xì)胞角膜基質(zhì)的前彈力層表面；加入培養(yǎng)液A，于37°C條件下，在體積濃度分別為85% 93 %的N2、5 %的CO2和2 % 10 %的O2環(huán)境中培養(yǎng)5 7天；每兩天換液，待羊膜上皮細(xì)胞于前彈力層表面生長匯合、并生長至I 2層時(shí)，得到復(fù)合羊膜上皮細(xì)胞的構(gòu)建體；所述培養(yǎng)液A是以濃度為17. 6g/L的MCDB153培養(yǎng)基水溶液為基液，內(nèi)含有表皮生長因子(EGF) 2 μ g/L、人胰島素10mg/L、L-谷氨酰胺2mM、非必需氨基酸10ml/L、丙酮酸鈉I. 18g/L、花生四烯酸2mg/L、腺嘌呤10mg/L、三碘甲狀腺氨酸20ng/L、亞硒酸鈉5mg/L和轉(zhuǎn)鐵蛋白100mg/L ;培養(yǎng)液A與含血清的羊膜上皮細(xì)胞培養(yǎng)液相比，能促進(jìn)羊膜上皮細(xì)胞中干細(xì)胞的克隆化生長，抑制分化細(xì)胞的生長，更好地維持羊膜上皮細(xì)胞的干細(xì)胞性。本步驟在低氧條件下培養(yǎng)，是因?yàn)樯砬闆r下人體組織平均氧含量為3%，富含干細(xì)胞的胚體氧濃度更低，低氧培養(yǎng)是維持干/祖細(xì)胞未分化狀態(tài)的重要因子，可以促進(jìn)自我更新及增殖。因此，采用培養(yǎng)液A低氧培養(yǎng)，能有效維持羊膜上皮細(xì)胞的干細(xì)胞性。經(jīng)檢測表達(dá)干細(xì)胞標(biāo)記階段特異性胚胎抗原_3(SSEA-3)、階段特異性胚胎抗原-4(SSEA-4)、腫瘤排斥抗原1-60 (TRA 1-60)和腫瘤排斥抗原1-81 (TRA 1-81)等具備多向分化能力。步驟二、氣液交替培養(yǎng)上皮細(xì)胞膜片將步驟一所得構(gòu)建體的基質(zhì)面(脫細(xì)胞角膜基質(zhì)層的一面)與培養(yǎng)液A接觸培養(yǎng)；將羊膜上皮細(xì)胞面與培養(yǎng)液B間歇性接觸培養(yǎng)，即用培養(yǎng)液B培養(yǎng)IOs后再暴露于空氣20s，如此反復(fù)循環(huán)12h ;培養(yǎng)過程在光照條件下，37°C、體積濃度5%的CO2環(huán)境中進(jìn)行；其中培養(yǎng)液B的組成是在純水中含2 10μ g/L的EGF，100 300ng/L轉(zhuǎn)化生長因子a (TGF- α )，2 13 μ g/L轉(zhuǎn)化生長因子β ! (TGF- β J，10 30 μ g/L維生素A，100 300mg/L維生素C，45 μ M酪氨酸，100 200 μ M谷胱甘肽，20 100mg/L葡萄糖，I 2mM氯化鈣，10 25g/L硫酸軟骨素，I 10g/L透明質(zhì)酸，pH 7. 2 7. 4，滲透壓280 320m0sm/kg ;培養(yǎng)液B模擬人淚液成分配制，能夠誘導(dǎo)羊膜上皮細(xì)胞形成類似角膜上皮細(xì)胞層的結(jié)構(gòu)。本步驟模擬了人眼瞼打開后外界對角膜生長的刺激因素。在眼瞼打開后，外界環(huán)境的改變促使角膜上皮細(xì)胞迅速增殖及細(xì)胞層數(shù)增加，并進(jìn)一步分化。引起角膜生長變化 的主要外界刺激因素是光和氧，及淚液成分變化。有研究報(bào)道，多細(xì)胞動物發(fā)育和形態(tài)形成過程中，信號分子(成形素morphogen)能夠通過快速的自由擴(kuò)散以及細(xì)胞表面受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用建立，并維持其濃度梯度分布，從而給予細(xì)胞位置信號，控制組織生長發(fā)育。在本步驟中，通過培養(yǎng)液B和羊膜上皮細(xì)胞面的間歇性接觸培養(yǎng)，使得培養(yǎng)液B中信號分子(如EGF)、氧分子在羊膜上皮細(xì)胞面自由擴(kuò)散為從上到下，從中心向邊緣的濃度梯度，促進(jìn)了上皮細(xì)胞的快速增殖，形成類似天然結(jié)構(gòu)的上皮細(xì)胞膜片，細(xì)胞分化程度從上到下、從中心到邊緣逐漸降低；通過氣液交替培養(yǎng)使誘導(dǎo)液在構(gòu)建體表面往復(fù)運(yùn)動，從而給予上皮細(xì)胞膜片的表層細(xì)胞成熟信號；構(gòu)建體表面處于氣液交替的循環(huán)中，不同于傳統(tǒng)靜止培養(yǎng)方法，能夠充分接觸氣體分子；培養(yǎng)液A、脫細(xì)胞角膜基底膜ECM成分共同維持著上皮細(xì)胞膜片基底層細(xì)胞及邊緣細(xì)胞的干細(xì)胞性。步驟三、角膜結(jié)構(gòu)成熟培養(yǎng)分別更換步驟二中的培養(yǎng)液A和培養(yǎng)液B，將步驟二所得構(gòu)建體的基質(zhì)面與培養(yǎng)液A接觸，將羊膜上皮細(xì)胞面與培養(yǎng)液B接觸，液下培養(yǎng)12h ；培養(yǎng)過程在37 °C、無光照條件下，體積濃度分別為85 % 93 %的N2、5 %的CO2和2 % 10 %的O2的混合氣體環(huán)境中進(jìn)行；將步驟二與步驟三交替進(jìn)行，每12小時(shí)交替一次，培養(yǎng)持續(xù)10 15天，最終得到結(jié)構(gòu)進(jìn)一步成熟的組織工程角膜。步驟三模擬了睡眠狀態(tài)下眼瞼閉合時(shí)角膜所處的生理環(huán)境，與步驟二協(xié)同模擬日夜時(shí)段外界刺激因素的變化，促進(jìn)了角膜結(jié)構(gòu)的進(jìn)一步成熟。本發(fā)明所制備的組織工程角膜有接近天然角膜的熱穩(wěn)定性和透明度。經(jīng)檢測，在680nm波長下，離體15分鐘的新鮮角膜的透光率為93% 96% ;本發(fā)明制備的組織工程角膜透光率為90 % 95 %，透明度與新鮮角膜無顯著差異。上皮細(xì)胞膜片中央?yún)^(qū)從下自上依次為具有自我更新能力的柱狀基底層細(xì)胞、具有部分分裂增殖能力的翼細(xì)胞、及表層扁平的終末分裂細(xì)胞，細(xì)胞復(fù)層5 7層；邊緣區(qū)細(xì)胞形態(tài)差異不顯著，維持著良好的干細(xì)胞性。本發(fā)明制備的組織工程角膜是一種優(yōu)良的角膜替代物，可以應(yīng)用于角膜潰瘍、角膜白斑、角膜營養(yǎng)不良等各類型角膜板層移植適應(yīng)癥，尤其在伴有持續(xù)性上皮缺損、角膜緣干細(xì)胞缺乏的高危移植中能夠顯現(xiàn)出很好的臨床療效。
本發(fā)明制備方法采用的角膜雙面培養(yǎng)裝置，由下至上依次為底盒、固定卡環(huán)、托盒、盒蓋；底盒呈圓形盒狀；托盒外底部有三個(gè)支腿，托盒高度小于底盒高度，能置于底盒內(nèi)，托盒中心開有通孔，通孔直徑與所培養(yǎng)角膜相適應(yīng)；固定卡環(huán)內(nèi)徑與托盒通孔直徑一致，固定卡環(huán)與托盒外底部能夠通過旋卡方式固定；盒蓋能與底盒匹配扣合，盒蓋上設(shè)置有一進(jìn)出液管直插底盒內(nèi)底，再設(shè)置一進(jìn)出液三通管，該三通管的一端在盒蓋外，另兩端通向托盒內(nèi)底兩側(cè)。本發(fā)明角膜雙面培養(yǎng)裝置的使用方法為，把所培養(yǎng)角膜(構(gòu)建體)上皮細(xì)胞面朝上放在固定卡環(huán)中心，將固定卡環(huán)對應(yīng)于托盒外底后旋卡密封固定，避免液體由二者之間滲漏，使角膜羊膜上皮細(xì)胞面朝上被夾在固定卡環(huán)與托盒外底之間，并且角膜的上下兩面在固定卡環(huán)和托盒的通孔處裸露；再將托盒偏置在底盒內(nèi)，扣上盒蓋，盒蓋上的進(jìn)出液直管伸至底盒內(nèi)底實(shí)現(xiàn)培養(yǎng)液(A)的交換(進(jìn)出)，盒蓋上的進(jìn)出液三通管有兩端伸至托盒內(nèi)底
兩側(cè)實(shí)現(xiàn)培養(yǎng)液(B)的交換(進(jìn)出)，盒蓋上的兩個(gè)進(jìn)出液管口可分別與蠕動泵連接，實(shí)現(xiàn)底盒和托盒中培養(yǎng)液進(jìn)出的自動控制。與現(xiàn)有技術(shù)及產(chǎn)品相比，本發(fā)明的角膜雙面培養(yǎng)裝置，I)改變了傳統(tǒng)靜止培養(yǎng)方式，使構(gòu)建體表面能夠充分接觸氣體，增加構(gòu)建體上皮細(xì)胞膜片的復(fù)層層數(shù)；傳統(tǒng)方法僅能形成I 3層細(xì)胞堆積，而本發(fā)明裝置能實(shí)現(xiàn)5 7層細(xì)胞堆積，細(xì)胞狀態(tài)顯著改善，使存活率大于90%。2)能夠模擬天然生長機(jī)制，用氧濃度、光刺激等因素的節(jié)律性變化誘導(dǎo)培養(yǎng)，具有更加接近天然角膜的成熟結(jié)構(gòu)，上皮基底層細(xì)胞與脫細(xì)胞角膜基質(zhì)間連接緊密，形成了大量半橋粒結(jié)構(gòu)；且誘導(dǎo)因素均可量化，結(jié)果重現(xiàn)性好；3)通過培養(yǎng)液B的節(jié)律性流動，誘導(dǎo)形成的上皮細(xì)胞膜片表層更為光滑，且透明度及屏障功能顯著提高；4)模擬天然淚液成分，通過培養(yǎng)液A與培養(yǎng)液B的濃度梯度，形成了由上向下、由中心向邊緣干細(xì)胞性逐漸下降的區(qū)域變化，能夠?qū)崿F(xiàn)天然角膜上皮由基底層向表層、由邊緣向中心同時(shí)更新。


附圖I為本發(fā)明設(shè)計(jì)的角膜雙面培養(yǎng)裝置一種實(shí)例的結(jié)構(gòu)示意圖；圖中I為盒蓋，2為托盒，3為固定卡環(huán),4為底盒,5為進(jìn)出液直管,6為進(jìn)出液三通管,7為通孔；使用時(shí),將構(gòu)建體(角膜)置于2與3之間，固定卡環(huán)與托盒是通過卡槽旋緊密封固定。附圖2為本發(fā)明方法制備的組織工程角膜外觀照片和組織學(xué)染色切片照片；A為角膜外觀照片為HE染色切片結(jié)果照片，可見類似人天然角膜的復(fù)層上皮結(jié)構(gòu)；附圖3為本發(fā)明方法制備的組織工程角膜透射電鏡的結(jié)果照片，可見上皮基底層細(xì)胞與脫細(xì)胞角膜基質(zhì)間連接緊密，形成了大量半橋粒結(jié)構(gòu)；由于半橋粒是天然基底層上皮細(xì)胞的一種特殊結(jié)構(gòu)，通過其與基底膜實(shí)現(xiàn)錨定連接；證明本發(fā)明制備的組織工程角膜形成了近似天然的上皮細(xì)胞與角膜前彈力膜間的連接結(jié)構(gòu)；附圖4為兔角膜堿燒傷后未修復(fù)空白對照組照片。A為堿燒傷造模后，可見大面積白斑為堿燒傷后7天結(jié)果，仍可見大面積白斑；C為堿燒傷后30天結(jié)果，可見大量血管新生及燒傷區(qū)域基質(zhì)潰瘍；D為堿燒傷后30天熒光素鈉染色結(jié)果，可見持續(xù)上皮缺損；附圖5為本發(fā)明制備的組織工程角膜修復(fù)兔角膜大面積堿燒傷實(shí)驗(yàn)組照片。A為I周照片，B為4周照片，C為6月照片；可以看出在移植I周、4周及6月過程中組織工程角膜始終穩(wěn)定存在于植床并保持著良好的透明度，與植床逐漸整合，無不良反應(yīng)。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合實(shí)例說明本發(fā)明技術(shù)方案的具體實(shí)施方式
。其中，哺乳動物源性脫細(xì)胞角膜基質(zhì)可以參考現(xiàn)有方法(如中國專利申請200410018107. 5)。所使用的角膜雙面培養(yǎng)裝置采用醫(yī)用高分子透明材料制備，例如醫(yī)用級聚苯乙烯(注塑成型)；實(shí)例I中的規(guī)格為底盒直徑3cm，深度2cm，托盒支腿O. 5cm，托盒直徑2cm，深度O. 8cm，通孔直徑I. Icm,盒蓋直徑3. 5cm ;實(shí)例2中的規(guī)格為底盒直徑3. 5 cm，深度2cm，托盒支腿O. 5cm，托盒直徑2. 5cm,深度Icm,通孔直徑I. 8cm,盒蓋直徑4cm。實(shí)施例I、步驟一、羊膜上皮細(xì)胞接種將脫細(xì)胞豬角膜基質(zhì)置于12孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，將經(jīng)培養(yǎng)液A培養(yǎng)的2代羊膜上皮細(xì)胞，以I X IOVcm2密度接種于脫細(xì)胞角膜基質(zhì)的前彈力層表面；加入2ml培養(yǎng)液A，液面下培養(yǎng)；所述的培養(yǎng)液A是以濃度為17. 6g/L的MCDB153培養(yǎng)基水溶液為基液，內(nèi)含有=EGF為2μ g/L、人胰島素10mg/L、L-谷氨酰胺2mM、非必需氨基酸10ml/L、丙酮酸鈉I. 18g/L、花生四烯酸2mg/L、腺嘌呤10mg/L、三碘甲狀腺氨酸20ng/L、亞硒酸鈉5mg/L、轉(zhuǎn)鐵蛋白100mg/L ;細(xì)胞培養(yǎng)箱的條件為，在體積濃度分別為90%的N2,5%的C02，5%的O2的混合氣體環(huán)境中，37°C培養(yǎng)7天；每兩天更換培養(yǎng)液，待羊膜上皮細(xì)胞于脫細(xì)胞角膜基質(zhì)前彈力面生長匯合時(shí)，細(xì)胞生長至I 2層。獲得脫細(xì)胞角膜基質(zhì)表面復(fù)合有羊膜上皮細(xì)胞的構(gòu)建體。步驟二、氣液交替培養(yǎng)上皮細(xì)胞膜片按前述使用方法將構(gòu)建體采用角膜雙面培養(yǎng)裝置進(jìn)行角膜雙面培養(yǎng)；先用硅膠管連接盒蓋上的進(jìn)出液直管口，通過0. 22 μ m過濾器，連接蠕動泵通至培養(yǎng)液A瓶；再用硅膠管連接盒蓋上的進(jìn)出液三通管口，通過0. 22 μ m過濾器，連接蠕動泵通至培養(yǎng)液B瓶；配制培養(yǎng)液B :在純水中添加10 μ g/L的EGF、100ng/L的TGF-α ,2 μ g/L 的 TGF-β I、10 μ g/L 維生素 A、150mg/L 維生素 C、45 μ M 酪氨酸、107 μ M 谷胱甘肽、60mg/L葡萄糖、I. 2mM氯化Hl0g/L硫酸軟骨素和10g/L透明質(zhì)酸,調(diào)pH至7. 2,調(diào)滲透壓至280m0sm/kg ;將培養(yǎng)液A和B分別裝瓶；打開全光譜光源，將角膜雙面培養(yǎng)裝置放入37°C、體積濃度為5%的CO2環(huán)境中；向底盒中通入6ml培養(yǎng)液A ；向托盒中循環(huán)通入培養(yǎng)液B培養(yǎng)12h，每個(gè)循環(huán)過程為30秒，即加200 μ I培養(yǎng)液B培養(yǎng)IOs (包括加液_培養(yǎng)_抽液的全過程)，(抽液后)暴露于空氣20so步驟三、角膜結(jié)構(gòu)成熟培養(yǎng)分別更換步驟二中底盒的培養(yǎng)液A和托盒的培養(yǎng)液B (600 μ I)，進(jìn)行液下培養(yǎng)12h ;培養(yǎng)過程在細(xì)胞培養(yǎng)箱37°C、無光照條件下，體積濃度分別為90%的N2、5%的CO2和5%的O2的混合氣體環(huán)境中進(jìn)行；將步驟二與步驟三交替進(jìn)行，每12小時(shí)交替一次，培養(yǎng)持續(xù)14天，得到結(jié)構(gòu)進(jìn)一步成熟的組織工程角膜。本實(shí)例以脫細(xì)胞豬角膜基質(zhì)為支架，采用培養(yǎng)液A培養(yǎng)的第2代羊膜上皮細(xì)胞。用HE染色驗(yàn)證所制備的組織工程角膜結(jié)構(gòu)特點(diǎn)(附圖2B)。采用透射電鏡觀察所制備的組織工程角膜上皮細(xì)胞膜片與脫細(xì)胞角膜基質(zhì)前彈力膜間形成了大量半橋粒結(jié)構(gòu)。半橋粒是基底層上皮細(xì)胞上的一種特殊結(jié)構(gòu)，上皮細(xì)胞借助于半橋粒與基底膜實(shí)現(xiàn)錨定連接。因此所構(gòu)建的組織工程角膜形成了近似天然的上皮細(xì)胞與角膜前彈力膜間的連接結(jié)構(gòu)(附圖3)。
實(shí)施例2、步驟一、羊膜上皮細(xì)胞接種將脫細(xì)胞牛角膜基質(zhì)置于12孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，按8X IOVcm2密度接種原代羊膜上皮細(xì)胞于脫細(xì)胞角膜基質(zhì)的前彈力層表面；加入4ml培養(yǎng)液A,液面下培養(yǎng)；所述的培養(yǎng)液A與實(shí)施例I相同；細(xì)胞培養(yǎng)箱的條件為，在體積濃度分別為93%的N2, 5%的CO2, 2%的O2的混合氣體環(huán)境中，37°C培養(yǎng)5天；每兩天換液一次，待羊膜上皮細(xì)胞于脫細(xì)胞角膜基質(zhì)前彈力層表面生長匯合時(shí)，細(xì)胞生長至I 2層。獲得脫細(xì)胞角膜基質(zhì)表面復(fù)合有羊膜上皮細(xì)胞的構(gòu)建體。步驟二、氣液交替培養(yǎng)上皮細(xì)胞膜片與實(shí)例I相同，按前述使用方法將構(gòu)建體采用角膜雙面培養(yǎng)裝置進(jìn)行角膜雙面培養(yǎng)；配制培養(yǎng)液B :在純水中添加5 μ g/L的EGF、200ng/L 的 TGF-α、13 μ g/L 的 TGF-β ^20 μ g/L 維生素 A、260mg/L 維生素 C、45yM 酪氨酸、107 μ M谷胱甘肽、100mg/L葡萄糖、I. 6mM氯化Hl5g/L硫酸軟骨素和5g/L透明質(zhì)酸，調(diào)pH至7. 4，調(diào)滲透壓至300m0sm/kg ;將培養(yǎng)液A和B分別裝瓶；
打開全光譜光源，將角膜雙面培養(yǎng)裝置放入37°C、體積濃度為5%的CO2環(huán)境中(細(xì)胞培養(yǎng)箱)；向底盒中通入6ml培養(yǎng)液A ；向托盒中循環(huán)通入培養(yǎng)液B培養(yǎng)12h，每個(gè)循環(huán)過程為30s，即加500 μ I培養(yǎng)液B培養(yǎng)IOs (包括加液-培養(yǎng)-抽液的全過程)，(抽液后)暴露于空氣20s。步驟三、液下角膜結(jié)構(gòu)成熟培養(yǎng)分別更換步驟二中底盒的培養(yǎng)液A和托盒的培養(yǎng)液B (1ml)，進(jìn)行液下培養(yǎng)12h ;培養(yǎng)過程在細(xì)胞培養(yǎng)箱37°C、無光照條件下，體積濃度分別為93%的N2、5%的CO2和2%的O2的混合氣體環(huán)境(細(xì)胞培養(yǎng)箱)中進(jìn)行；將步驟二與步驟三交替進(jìn)行，每12小時(shí)交替一次，培養(yǎng)持續(xù)10天；得到結(jié)構(gòu)進(jìn)一步成熟的組織工程角膜。本實(shí)例以脫細(xì)胞牛角膜基質(zhì)為支架，以原代羊膜上皮細(xì)胞接種制備大直徑的組織工程角膜，適用于全角膜板層移植。采用所制備的組織工程角膜進(jìn)行兔角膜大面積堿燒傷的修復(fù)實(shí)驗(yàn)，由附圖5可以看出，在移植I周、4周及6月過程中組織工程角膜始終穩(wěn)定存在于植床，并保持著良好的透明度，與植床逐漸整合，無不良反應(yīng)。
權(quán)利要求
1.一種組織工程角膜的制備方法，其特征在于，包括以下步驟 步驟一、接種羊膜上皮細(xì)胞將哺乳動物源性的脫細(xì)胞角膜基質(zhì)置于細(xì)胞培養(yǎng)皿中，將羊膜上皮細(xì)胞按I X IO5 I X IO6個(gè)/cm2的密度接種于脫細(xì)胞角膜基質(zhì)的前彈力層表面；加入培養(yǎng)液A，于37°C條件下，在體積濃度分別為85 % 93 %的N2、5 %的CO2和2 % 10 %的O2環(huán)境中培養(yǎng)5 7天；每兩天換液，待羊膜上皮細(xì)胞于前彈力層表面生長匯合，得到復(fù)合羊膜上皮細(xì)胞的構(gòu)建體；所述培養(yǎng)液A是以濃度為17. 6g/L的MCDB153培養(yǎng)基水溶液為基液，內(nèi)含有表皮生長因子2 u g/L、人胰島素10mg/L、L-谷氨酰胺2mM、非必需氨基酸10ml/L、丙酮酸鈉I. 18g/L、花生四烯酸2mg/L、腺嘌呤10mg/L、三碘甲狀腺氨酸20ng/L、亞硒酸鈉5mg/L和轉(zhuǎn)鐵蛋白100mg/L ； 步驟二、氣液交替培養(yǎng)上皮細(xì)胞膜片將步驟一所得構(gòu)建體的基質(zhì)面與培養(yǎng)液A接觸培養(yǎng)；將羊膜上皮細(xì)胞面與培養(yǎng)液B間歇性接觸培養(yǎng)，即用培養(yǎng)液B培養(yǎng)IOs后再暴露于空氣20s，如此反復(fù)循環(huán)12h ;培養(yǎng)過程在光照條件下，37°C、體積濃度5%的CO2環(huán)境中進(jìn)行；其中培養(yǎng)液B的組成是在純水中含2 IOii g/L的EGF，100 300ng/L轉(zhuǎn)化生長因子a，2 13 ii g/L轉(zhuǎn)化生長因子P i，10 30 ii g/L維生素A，100 300mg/L維生素C，45 y M酪氨酸，100 200 ii M谷胱甘肽，20 100mg/L葡萄糖，I 2mM氯化鈣，10 25g/L硫酸軟骨素，I 10g/L透明質(zhì)酸，pH 7. 2 7. 4，滲透壓280 320m0sm/kg ； 步驟三、角膜結(jié)構(gòu)成熟培養(yǎng)分別更換步驟二中的培養(yǎng)液A和培養(yǎng)液B，將步驟二所得構(gòu)建體的基質(zhì)面與培養(yǎng)液A接觸，將羊膜上皮細(xì)胞面與培養(yǎng)液B接觸，液下培養(yǎng)12h ;培養(yǎng)過程在37 °C、無光照條件下，體積濃度分別為85 % 93 %的N2、5 %的CO2和2 % 10 %的O2的混合氣體環(huán)境中進(jìn)行； 將步驟二與步驟三交替進(jìn)行，每12小時(shí)交替一次，培養(yǎng)持續(xù)10 15天，最終得到結(jié)構(gòu)進(jìn)一步成熟的組織工程角膜。
2.一種制備權(quán)利要求I所述組織工程角膜的角膜雙面培養(yǎng)裝置，其特征在于，所述培養(yǎng)裝置由下至上依次為底盒、固定卡環(huán)、托盒、盒蓋；底盒呈圓形盒狀；托盒外底部有三個(gè)支腿，托盒高度小于底盒高度，能置于底盒內(nèi)，托盒中心開有通孔，通孔直徑與所培養(yǎng)角膜相適應(yīng)；固定卡環(huán)內(nèi)徑與托盒通孔直徑一致，固定卡環(huán)與托盒外底部能夠通過旋卡方式固定；盒蓋能與底盒匹配扣合，盒蓋上設(shè)置有一進(jìn)出液管直插底盒內(nèi)底，再設(shè)置一進(jìn)出液三通管，該三通管的一端在盒蓋外，另兩端通向托盒內(nèi)底兩側(cè)。
全文摘要
一種組織工程角膜的制備方法及其裝置，本發(fā)明是在脫細(xì)胞角膜基質(zhì)上接種羊膜上皮細(xì)胞，經(jīng)培養(yǎng)得到復(fù)合羊膜上皮細(xì)胞的構(gòu)建體；再以雙面培養(yǎng)方式，采用氣液交替光照培養(yǎng)與液下無光照培養(yǎng)進(jìn)行交替培養(yǎng)完成。所制備的組織工程角膜是一種優(yōu)良的角膜替代物，具有接近天然角膜的熱穩(wěn)定性和透明度，在680nm波長下，透光率為90％～95％；由于采用雙面培養(yǎng)裝置，能使構(gòu)建體表面充分接觸氣體，增加上皮細(xì)胞膜片的復(fù)層層數(shù)，達(dá)到5～7層細(xì)胞堆積，并使存活率大于90％，維持著良好的干細(xì)胞性；可用于角膜潰瘍、角膜白斑、角膜營養(yǎng)不良等各類型角膜板層移植，尤其在伴有持續(xù)性上皮缺損、角膜緣干細(xì)胞缺乏的高危移植中能顯現(xiàn)出很好的臨床療效。
文檔編號C12M3/00GK102807965SQ20121031020
公開日2012年12月5日 申請日期2012年8月28日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月28日
發(fā)明者盧永波 申請人:陜西瑞盛生物科技有限公司