專利名稱：一種新德里金屬β內(nèi)酰胺酶1核酸適體及其篩選方法和應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物技術領域，具體涉及一種能夠與新德里金屬β內(nèi)酰胺酶I高親和力和高特異性結合的核酸適體及其篩選方法和應用。
背景技術：
金屬β內(nèi)酰胺酶(metallo β-lactamases,簡稱MBLs)具有穩(wěn)定且高效的碳青霉烯類(絲氨酸酶不能將其水解)的水解活性，可以催化水解除了單環(huán)外幾乎所有的內(nèi)酰胺類抗生素，而且MBLs不能被臨床上的現(xiàn)有的MBLs抑制劑所抑制。目前，MBLs已經(jīng)在多種臨床革蘭陰性菌株中分離出，另外，在炭疽桿菌中也發(fā)現(xiàn)編碼MBLs的沉默基因。2010年，印度、巴基斯坦等南亞國家出現(xiàn)了一種新型細菌變種基因，擁用這種基因 的細菌對包括頭孢類、碳青霉烯類、氨基糖苷類等絕大部分抗生素都有耐藥性，科學家將這種超級耐藥基因命名為新德里金屬β內(nèi)酰胺酶I (New Delhi metallo-β -lactamase-1,簡稱NDM-1)基因，NDM-I是NDM-I基因所編碼的產(chǎn)物酶。擁有NDM-I基因的超級細菌對幾乎所有類型的抗生素都有耐藥性，其患者將面臨無藥可救的境地。這為我們?yōu)E用抗生素敲響警鐘的同時，也為耐藥性及相關新抗研究提出了挑戰(zhàn)。中國大陸已有從鮑曼不動桿菌中檢出NDM-I的報道。2010年10月26日，中國疾病預防控制中心通報，檢出2株產(chǎn)NDM-I的屎腸球菌，該菌株分離自寧夏某縣醫(yī)院的2例新生兒糞便標本。由于NDM-I多位于質粒、整合子等可移動元件上，易于廣泛轉移和傳播，因此，加強NDM-I細菌的監(jiān)測非常重要，對臨床治療亦十分有利，臨床醫(yī)師可以直接選擇較敏感的化療藥物如單環(huán)類抗生素治療，而且對患者而言，也可節(jié)約住院時間和費用。目前，對于金屬β內(nèi)酰胺酶的檢測，臨床上普遍采用基于細菌培養(yǎng)的方法進行檢測，然而，這種檢測方法不僅費時，而且容易出現(xiàn)假陽性或假陰性。為此，中國于2011年頒布《產(chǎn)NDM-I泛耐藥腸桿菌科細菌感染診療指南(試行版)》，指南中推薦NDM-I細菌的實驗室診斷包括表型篩查、表型確認和基因確證三個步驟。其中，表型篩查是以美羅培南或亞胺培南紙片法(K-B法)或最低抑菌濃度(MIC)測定法對腸桿菌科細菌產(chǎn)酶情況進行初步篩查，達標準者再用雙紙片協(xié)同試驗進行表型確認，最終采用NDM-I基因特異引物進行PCR擴增及產(chǎn)物測序，確定菌株是否攜帶NDM-I基因。然而，表型篩查和表型確認均采用傳統(tǒng)的藥物敏感性測定方法，耗時較長，容易導致病情的延誤。核酸適體是能夠特異結合蛋白質或其他小分子物質的單鏈寡聚核苷酸片段(單鏈DNA或單鏈RNA)，它具有高特異性和親和力識別其靶標分子，一些與疾病密切相關的生長因子、酶、受體等物質均能成為核酸適體的靶標。因此，亟需要研究和發(fā)展能夠與NDM-I特異性結合的核酸適體，為NDM-I基于核酸適體的臨床快速診斷技術打下基礎，從而能夠快速地檢測出NDM-I細菌，使病情得到及時、有效地治療
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一在于克服現(xiàn)有技術中的不足之處而提供一種易于制備、節(jié)約成本、能夠與NDM-I高親和力和高特異性結合的核酸適體，從而為NDM-I基于核酸適體的臨床快速診斷技術打下基礎。本發(fā)明的目的之二在于克服現(xiàn)有技術中的不足之處，提供一種易于制備、節(jié)約成本的、能夠與NDM-I高親和力和高特異性結合的核酸適體的篩選方法。本發(fā)明的目的之三在于提供一種上述核酸適體在NDM-I的檢測中的應用。本發(fā)明的目的之四在于提供一種上述核酸適體在制備NDM-I的檢測試劑中的應用。本發(fā)明的目的由以下技術措施實現(xiàn) 提供一種新德里金屬β內(nèi)酰胺酶I核酸適體，所述核酸適體為SEQ ID Ν0:1所示的DNA分子。本發(fā)明還提供一種上述核酸適體的篩選方法，包括以下步驟
1)NDM-I的預處理
將NDM-I用包被緩沖液稀釋至5 μ g/ml,向96孔酶標板的8個孔中分別加入120 μ INDM-I溶液，4°C包被過夜，然后用150 μ I選擇緩沖液37°C封閉Ih ；
2)隨機單鏈DNA文庫的預處理
將隨機單鏈DNA文庫于95°C變性5mi后立即置于冰中l(wèi)Omin，然后用選擇緩沖液稀釋至Iml,并于25°C溫育30min ；
3)隨機單鏈DNA文庫中單鏈DNA與NDM-I的結合
將步驟2)預處理后的隨機單鏈DNA文庫加入至包被有BSA-CL的酶標板中，37°C條件下在濕盒中靜置Ih后，棄孔中的液體，然后每孔加入I X選擇緩沖液200 μ I，連續(xù)震蕩洗滌lmin，用于去除未與靶分子結合及結合不牢固的單鏈DNA，如此重復5次；最后一次洗滌后，向每孔中加入100 μ I單鏈DNA洗滌緩沖液，80°C加熱lOmin，再用酚氯仿異戊醇的比例為25:24:1制成的混合溶劑抽提一次，取上清，加入3倍體積的無水乙醇進行沉淀，最后定容至80 μ I，獲得單鏈DNA溶液；
4)單鏈DNA的擴增
以步驟3)獲得的單鏈DNA溶液為模板進行PCR擴增，獲得雙鏈DNA ；
5)用于下一輪篩選的單鏈DNA的制備
將步驟4)獲得的雙鏈DNA用純化試劑盒純化，然后用鏈親和素磁珠從雙鏈DNA中分離單鏈DNA，投入到下一輪篩選；
6)反向篩選
由于使用了 BSA進行包被，為了除去隨機單鏈DNA文庫中可能存在的與BSA結合的核酸適體，在每兩輪正向篩選之間，進行一次反向篩選
將經(jīng)過某一輪篩選后獲得的單鏈DNA加入到用BSA包被和封閉的酶標板孔中，于37°C溫育45min，使BSA與核酸適體充分結合，然后，取上清，用于下一輪篩選；
7)克隆及測序
經(jīng)過10輪篩選后獲得目的寡核苷酸序列，克隆測序所述目的寡核苷酸序列，最終獲得核酸適體。其中，步驟I)中，所述包被緩沖液為pH9. 6的O. 05 mol/L碳酸鹽緩沖液。
其中，步驟2)和步驟3)中，所述選擇緩沖液為pH 7. 4的50 mmol/L Tris-HCl含1% BSA，O. 01% 鮭魚精 DNA、100 mmol/L NaClU mmol/L MgCl2,5 mmol/L KCl 和 O. 05%Tween 20配制而成的溶液。其中，所述步驟b中，所述洗滌緩沖液為pH 7. 4的50 mmol/L Tris-HCl含0. 05%(V/V) Tween 20配制而成的溶液。由于上述核酸適體能夠特異性結合NDM-I，因此，該核酸適體可用于NDM-I的檢測以及用于制備NDM-I的檢測試劑，從而可作為NDM-I基于核酸適體的臨床快速診斷的用途。本發(fā)明的優(yōu)點和有益效果
本發(fā)明采用體外篩選技術篩選到一種能夠與NDM-I高親和力和高特異性結合的核酸 適體，核酸適體僅需要通過簡單的PCR技術即可大量制備，其理化性質穩(wěn)定，與抗體相比，核酸適體的生產(chǎn)過程更加簡單，成本更低，無明顯的毒性及過敏源性；另一方面，單克隆抗體的分子量為160KD,而核酸適體的分子量介于4. 95KD-29KD之間，在相同質量的情況下，核酸適體捕獲的靶分子較抗體多，因此，本發(fā)明的核酸適體可用于NDM-I的檢測，并且可以大大縮短檢測時間，從而為NDM-I基于核酸適體的臨床快速診斷技術打下基礎。


圖I為本發(fā)明的新德里金屬β內(nèi)酰胺酶I的SDS-PAGE銀染結果圖。
圖2為本發(fā)明的核酸適體對新德里金屬β內(nèi)酰胺酶I親和力的SPR檢測結果圖。
具體實施例方式 以下通過實施例對本發(fā)明進行進一步描述。下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。實施例I :核酸適體 核酸適體的核苷酸序列為
GCAATGGTACGGTACTTCCTGTTTTATGTTGTGTGTCTTGTTTTGCTACTTTTCGCCGGCCGTTCAAAAGTGCACGCTACTTTGCTAA (SEQ ID NO:I)。實施例2核酸適體的篩選方法 一、主要試劑及緩沖液
(一)主要試劑
I.用于核酸適體篩選的NDM-I
本發(fā)明選用的NDM-I純度大于99%,由意大利Siena大學的Jean-Denis Docquier教授惠贈。NDM-I的SDS-PAGE銀染結果如圖I所示。
圖I中第一泳道為蛋白MARKER，第二至四泳道為NDM-I電泳結果，第二泳道10ng，第三泳道為20ng，第四泳道為40ng蛋白；箭頭所指為NDM-I蛋白電泳條帶。電泳結果表明，在蛋白質電泳條帶中未看見明顯的蛋白跳蛋，表明該酶純度較高，完全可以用于核酸適體的篩選。2.隨機單鏈DNA文庫本發(fā)明采用的隨機單鏈DNA文庫由Invitrogen廣州公司合成，中間45個堿基為隨機序列，兩端為固定的引物序列，庫容量大約為1015，其序列如下
5’ -GCAATGGTACGGTACTTCC-(N45)-CAAAGTGCACGCTACTTCGTAA -3’ ；
引物由Invitrogen廣州公司合成,用于核酸適體的擴增、擴增結果的檢測及從PCR產(chǎn)物中分離單鏈DNA的分離
第一引物5’ -GCAATGGTACGGTACTTCC-3’ ；
生物素標記的第二引物5’ -TTAGCAAAGTAGCGTGCACTTTTG-3’ ；
3.其他主要試劑
PCR產(chǎn)物純化試劑盒(購自德國Qaigen公司)、T_A克隆試劑盒及Taq DNA聚合酶(購自寶生物大連有限公司)、Oligreen單鏈DNA染料(購自美國Invitrogen公司)、鏈親和素磁珠(購自美國Invitrogen公司)。(二)主要緩沖液及溶液
1.Tris-HCl 緩沖液50 mmol/L Tris-HCl，pH 7. 4 ；
2.包被緩沖液pH9.6的O. 05 mol/L碳酸鹽緩沖液；
3.封閉緩沖液pH7. 4的50 mmol /T, Tris-HCl含1%牛血清辦蛋白(bovine serumalbum, BSA)和 150 mmol/L NaCl ；
4.洗滌緩沖液pH7. 4 的 50 mmol/L Tris-HCl 含 O. 05% (V/V) Tween 20 ；
5.選擇緩沖液pH7. 4 的 50 mmol/L Tris-HCl 含 1% BSA，O. 01% 鮭魚精 DNA、150mmol/L NaCl、I mmol/L MgCl2、5 mmol/L KCl 和 0· 05% Tween 20 ；
6.5XTris-硼酸貯存液分別加入54gTris堿、27. 5g硼酸以及20 ml O. 5mol/L EDTA，調ρΗ8· O,終體積為IL ；
7.40%丙烯酰胺溶液分別加入38g丙烯酰胺和2g亞甲雙丙烯酰胺，用蒸餾水定溶至 IOOml ；
8.DNA 上樣緩沖液尿素 4.8g、0.5M EDTA 0.4ml、lM Tris-HCl (pH 8. 5) 0. 05ml、溴酚藍0. 025g、超純水定容至10ml，4°C貯存。 二、核酸適體的篩選方法，包括以下步驟
1.NDM-I的預處理
將NDM-I用包被緩沖液稀釋至5 μ g/ml,向96孔酶標板的8個孔中分別加入120 μ INDM-I溶液，4°C包被過夜，然后用150 μ I選擇緩沖液37°C封閉Ih ；
2.隨機單鏈DNA文庫的預處理
將隨機單鏈DNA文庫于95°C變性5mi后立即置于冰中l(wèi)Omin，然后用選擇緩沖液稀釋至Iml,并于25°C溫育30min ；
3.隨機單鏈DNA文庫中單鏈DNA與NDM-I的結合
將預處理后的隨機單鏈DNA文庫加入至包被有BSA-CL的酶標板中，37°C條件下在濕盒中靜置Ih后，棄孔中的液體，然后每孔加入IX選擇緩沖液200 μ 1，連續(xù)震蕩洗滌lmin，用于去除未與靶分子結合及結合不牢固的單鏈DNA，如此重復5次；最后一次洗滌后，向每孔中加入100 μ I單鏈DNA洗滌緩沖液，80°C加熱lOmin，再用酚氯仿異戊醇的比例為25:24:1制成的混合溶劑抽提一次，取上清，加入3倍體積的無水乙醇進行沉淀，最后定容至80 μ 1，獲得單鏈DNA溶液；4.單鏈DNA的擴增
取1/8體積的單鏈DNA溶液為模板，按照下述方案進行PCR擴增
940C 5min 后，進行 3 個循環(huán)94°C lmin,37°C lmin 20sec，58 °C 40sec，然后 58°C2min ；
取Iy I上述PCR產(chǎn)物為模板，再次PCR擴增，每5個循環(huán)取樣進行凝膠電泳分析
1)制備聚丙烯酰胺凝膠將尿素3.78g、40%丙烯酰胺溶液2. 7ml、5 X Tris-硼酸O. 9ml、超純水3. 2ml、TEMED 90 μ I及10%過硫酸銨90 μ I進行混合制備凝膠；
2)將DNA樣品與DNA上樣緩沖液混合，80°C處理5min后，加樣，接上電極(正極接下槽)，在100V恒壓下進行電泳； 3)電泳至溴酚藍遷移至凝膠中下部時，切斷電源，取下PAGE膠，進行銀染，檢測DNA電泳的條帶；
根據(jù)電泳結果，選擇PCR產(chǎn)量大、無雜帶的循環(huán)數(shù)為最佳循環(huán)數(shù)，并按最佳循環(huán)次數(shù)將剩余PCR產(chǎn)物擴增成雙鏈DNA。5.用于下一輪篩選的單鏈DNA的制備
將步驟4獲得的雙鏈DNA用純化試劑盒純化，然后用鏈親和素磁珠從雙鏈DNA中分離單鏈DNA，并按照表I投入到下一輪篩選中
表I.核酸適體篩選過程中的NDM-I及單鏈DNA的用量_
權利要求
1.一種新德里金屬β內(nèi)酰胺酶I (NDM-I)核酸適體，其特征在于所述核酸適體為SEQID NO: I所示的DNA分子。
2.一種如權利要求I所述的核酸適體的篩選方法，其特征在于包括以下步驟 1)NDM-I的預處理 將NDM-I用包被緩沖液稀釋至5 μ g/ml,向96孔酶標板的8個孔中分別加入120 μ INDM-I溶液，4°C包被過夜，然后用150 μ I選擇緩沖液37°C封閉Ih ； 2)隨機單鏈DNA文庫的預處理 將隨機單鏈DNA文庫于95°C變性5mi后立即置于冰中l(wèi)Omin，然后用選擇緩沖液稀釋至Iml,并于25°C溫育30min ； 3)隨機單鏈DNA文庫中單鏈DNA與NDM-I的結合 將步驟2)預處理后的隨機單鏈DNA文庫加入至包被有BSA-CL的酶標板中，37°C條件下在濕盒中靜置Ih后，棄孔中的液體，然后每孔加入I X選擇緩沖液200 μ I，連續(xù)震蕩洗滌lmin，用于去除未與靶分子結合及結合不牢固的單鏈DNA，如此重復5次；最后一次洗滌后，向每孔中加入100 μ I單鏈DNA洗滌緩沖液，80°C加熱lOmin，再用酚氯仿異戊醇的比例為25:24:1制成的混合溶劑抽提一次，取上清，加入3倍體積的無水乙醇進行沉淀，最后定容至80 μ I，獲得單鏈DNA溶液； 4)單鏈DNA的擴增 以步驟3)獲得的單鏈DNA溶液為模板進行PCR擴增，獲得雙鏈DNA ； 5)用于下一輪篩選的單鏈DNA的制備 將步驟4)獲得的雙鏈DNA用純化試劑盒純化，然后用鏈親和素磁珠從雙鏈DNA中分離單鏈DNA，投入到下一輪篩選； 6)反向篩選 由于使用了 BSA進行包被，為了除去隨機單鏈DNA文庫中可能存在的與BSA結合的核酸適體，在每兩輪正向篩選之間，進行一次反向篩選 將經(jīng)過某一輪篩選后獲得的單鏈DNA加入到用BSA包被和封閉的酶標板孔中，于37°C溫育45min，使BSA與核酸適體充分結合，然后，取上清，用于下一輪篩選； 7)克隆及測序 經(jīng)過10輪篩選后獲得目的寡核苷酸序列，克隆測序所述目的寡核苷酸序列，最終獲得核酸適體。
3.根據(jù)權利要求2所述的核酸適體的篩選方法，其特征在于步驟I)中，所述包被緩沖液為PH9. 6的O. 05 mo I/L碳酸鹽緩沖液。
4.根據(jù)權利要求2所述的核酸適體的篩選方法，其特征在于步驟2)和步驟3)中，所述選擇緩沖液為 pH 7. 4 的 50 mmol/L Tris-HCl 含 1% BSA，O. 01% 鮭魚精 DNA、100 mmol/L NaCl> I mmol /T, MgCl2、5 mmol/L KCl 和 O. 05% Tween 20 配制而成的溶液。
5.根據(jù)權利要求2所述的核酸適體的篩選方法，其特征在于所述步驟b中，所述洗滌緩沖液為pH 7. 4的50 mmol/L Tris-HCl含0. 05% (V/V) Tween 20配制而成的溶液。
6.一種如權利要求I所述的核酸適體的應用，其特征在于用于NDM-I的檢測。
7.—種如權利要求I所述的核酸適體的應用，其特征在于用于制備NDM-I的檢測試劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物技術領域，具體涉及一種新德里金屬β內(nèi)酰胺酶1核酸適體及其篩選方法和應用，本發(fā)明的核酸適體能夠高親和力和高特異性結合NDM-1，可用于NDM-1細菌的檢測，并且可以大大縮短檢測時間，從而為NDM-1基于核酸適體的臨床快速診斷技術打下基礎；本發(fā)明的核酸適體抗體親和力與傳統(tǒng)的抗體相當，而且生產(chǎn)過程更加簡單，成本更低，因此能夠替代傳統(tǒng)抗體用于金屬β內(nèi)酰胺酶的快速診斷方法。
文檔編號C12N15/10GK102965377SQ201210314138
公開日2013年3月13日 申請日期2012年8月30日 優(yōu)先權日2012年8月30日
發(fā)明者趙祖國, 喻云梅, 劉仿, 李國明, 張臘喜, 米娜, 晏雙雙, 許壁榆 申請人:廣東醫(yī)學院