專利名稱：結(jié)晶樣先天性白內(nèi)障致病基因crygd檢測(cè)試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因檢測(cè)盒，具體涉及一種結(jié)晶樣先天性白內(nèi)障致病基因CRYGD檢測(cè)試劑盒。
背景技術(shù)：
先天性白內(nèi)障是胎兒發(fā)育過(guò)程中晶狀體代謝異常導(dǎo)致的不同程度、不同形式的晶狀體混濁，不僅使視網(wǎng)膜成像模糊，而且阻止視通路的發(fā)育，是目前兒童低視力和致盲的主要病因。該病的發(fā)病率約為O. 5%,占兒童致盲性眼病的第二位。先天性白內(nèi)障致病因素中有1/3與遺傳相關(guān)，遺傳方式包括常染色體顯性遺傳、常染色體隱性遺傳和X連鎖遺傳三種類型。致病基因篩查是探索疾病分子發(fā)病機(jī)制的重要步驟。目前研究發(fā)現(xiàn)39個(gè)位點(diǎn)、17個(gè)基因與先天性白內(nèi)障相關(guān)。包括晶狀體蛋白基因，膜蛋白基因即縫隙連接蛋白基因和主要內(nèi)源性膜蛋白基因，念珠狀纖絲蛋白基因，鐵蛋白輕鏈基因以及轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子基因。人晶狀體內(nèi)90%可溶性蛋白為晶狀體蛋白，分別為α晶狀體蛋白(40%)，β晶狀體蛋白(35%)和Y晶狀體蛋白(25%)，由三類晶狀體蛋白基因α、β、Υ編碼。CRYG編碼的Y晶狀體蛋白在人晶狀體中具有較高的濃度和屈光指數(shù)，Y晶狀體蛋白在晶狀體纖維細(xì)胞內(nèi)大量表達(dá)并且只表達(dá)于己分化的晶狀體纖維細(xì)胞，而在晶狀體上皮細(xì)胞內(nèi)無(wú)表達(dá)，因此，它對(duì)晶狀體發(fā)育與維持其透明性具有重要作用。Y晶狀體蛋白結(jié)構(gòu)較為穩(wěn)定，其中Y C、Y D、Y S晶狀體蛋白分別由CRYGC、CRYGD, CRYGS基因編碼。在己知先天性白內(nèi)障致病侯選基因研究中發(fā)現(xiàn)，晶狀體蛋白基因突變后不僅能造成晶狀體蛋白結(jié)構(gòu)的異常而影響其緊密排列，還會(huì)降低晶狀體蛋白溶解性而導(dǎo)致混濁的形成。目前已發(fā)現(xiàn)幾種基因突變，如CRYAB (D140N)與雙層板層白內(nèi)障相關(guān)，CRYBB2 (W151C)與中央核性白內(nèi)障相關(guān)，C RYGC (Τ5Ρ)與中央粉塵狀白內(nèi)障相關(guān)，CRYGD (R14C)與點(diǎn)狀進(jìn)行性白內(nèi)障相關(guān)，CRYGS (G18V)與多形態(tài)皮質(zhì)性白內(nèi)障相關(guān)。由于遺傳性先天性白內(nèi)障具有非常顯著的遺傳異質(zhì)性，不同的基因突變可導(dǎo)致相同表型的白內(nèi)障，不同表型的白內(nèi)障可由相同的基因突變?cè)斐伞?dǎo)致先天性白內(nèi)障的臨床癥狀及實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)指征具有多樣性，因此有必要對(duì)白內(nèi)障的各種臨床類型，尤其是尚未發(fā)現(xiàn)相關(guān)的分子生物學(xué)基礎(chǔ)的臨床類型進(jìn)行研究，并根據(jù)該變異建立起方便、快速和準(zhǔn)確的檢測(cè)方法，用于先天性白內(nèi)障的診斷。在已知的報(bào)道中，結(jié)晶樣先天性白內(nèi)障致病基因CRYGD基因第二個(gè)外顯子中第70位堿基發(fā)生C—>A置換改變，導(dǎo)致第23位的脯氨酸改變?yōu)樘K氨酸(P23T)，使Y晶狀體蛋白結(jié)構(gòu)的改變，引起白內(nèi)障的發(fā)生，但是目前還沒(méi)有較好的方法對(duì)其進(jìn)行定位和檢測(cè)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為了對(duì)結(jié)晶樣先天性白內(nèi)障致病基因CRYGD進(jìn)行檢測(cè)，從而提供了一種結(jié)晶樣先天性白內(nèi)障致病基因CRYGD檢測(cè)試劑盒。
一種結(jié)晶樣先天性白內(nèi)障致病基因CRYGD檢測(cè)試劑盒，由AS-PCR擴(kuò)增檢測(cè)試劑組成，所述的AS-PCR擴(kuò)增檢測(cè)試劑由10XPCR buffer 2ul ;dNTP混合物O. 5ul ；10 umol/L的AS-PCR特異性上下游引物和內(nèi)參的上下游引物各O. 5ul ；2 U/ul的Taq DNA聚合酶O. 5ul ；去離子水13ul組成。進(jìn)一步地，所述的正向特異性引物序列為5’ -GAATGCAGCAGCGACCACA-3’，反向特異性引物序列為:5，-GGGTCCTGACTTGAGGATGT-3’。上述結(jié)晶樣先天性白內(nèi)障致病基因CRYGD檢測(cè)試劑盒的使用方法，使用時(shí)，將目標(biāo)基因組DNA 150 ng加入所述的試劑盒中，95°C預(yù)變性5 min，95°C變性30 S，55°C退火30 S，72°C延伸10 min，共32個(gè)循環(huán)，然后將擴(kuò)增產(chǎn)物在I %瓊脂糖凝膠上120 V恒壓電泳lOmin，再按照常規(guī)方法檢測(cè)，即可對(duì)結(jié)晶樣先天性白內(nèi)障致病基因CRYGD第二個(gè)外顯子中第70位堿基發(fā)生C—>A (P23T)點(diǎn)突變進(jìn)行定位和檢測(cè)。進(jìn)一步地，將擴(kuò)增產(chǎn)物在2 %瓊脂糖凝膠上120 V恒壓電泳20min。本發(fā)明結(jié)晶樣先天性白內(nèi)障致病基因CRYGD檢測(cè)試劑盒的檢測(cè)對(duì)象為結(jié)晶樣先天性白內(nèi)障致病基因CRYGD，結(jié)晶樣先天性白內(nèi)障致病基因CRYGD的序列見(jiàn)序列表，經(jīng)過(guò)100例臨床試驗(yàn)，檢測(cè)準(zhǔn)確率高達(dá)99. 9%。與現(xiàn)有技術(shù)相比，利用本發(fā)明公開的結(jié)晶樣先天性白內(nèi)障致病基因CRYGD檢測(cè)試劑盒及其使用方法，對(duì)患者血液中提取的DNA組直接對(duì)CRYGD基因P23T點(diǎn)突變進(jìn)行檢測(cè)，能夠精確地診斷結(jié)晶樣先天性白內(nèi)障，從而降低漏檢率，并能與其他先天性白內(nèi)障進(jìn)行鑒別。


圖1 :患者眼部檢查 表型為晶狀體核性結(jié)晶樣混濁。圖2 :收集的家系圖，符合常染色體顯性遺傳；圖中方形圖標(biāo)表示男性，圓形圖標(biāo)表示女性，空白圖形表示正常人，黑色填充圖形表示患者，打斜線圖形表示去世。圖3 :D2S325連鎖分析圖；圖中方形圖標(biāo)表示男性，圓形圖標(biāo)表示女性，空白圖形表示正常人，黑色填充圖形表示患者，打斜線圖形表示去世。圖4 :CRYGC和CRYGD附近的微衛(wèi)星標(biāo)記D2S2358進(jìn)行的PAGE圖。圖5 :家系圖及單倍體構(gòu)建圖。圖6 =CRYGD基因C70A (P23T)突變序列測(cè)序圖；圖中箭頭為錯(cuò)義突變所在位置。圖7 =CRYGD基因正常序列測(cè)序圖；圖中箭頭為該位置正常序列。圖8 =AS-PCR產(chǎn)物凝膠電泳圖；M代表DNA分子量Marker，箭頭代表患者，其余為正常人，患者同時(shí)擴(kuò)增出227Kb和530bp兩個(gè)產(chǎn)物，而正常人只有參照產(chǎn)物530bp。
具體實(shí)施例方式經(jīng)過(guò)山西省眼科醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，在嚴(yán)格遵守赫爾辛基宣言的前提下，本研究收集山西省榆社縣一個(gè)四代先天性結(jié)晶樣混濁白內(nèi)障家系共22例成員，其中患者10例。對(duì)家系所有成員進(jìn)行全面檢查，美多麗滴眼液散瞳后經(jīng)裂隙燈和檢眼鏡檢查確定臨床表型，對(duì)患者眼部圖像進(jìn)行數(shù)碼采集?；颊哐鄄繖z查表型均為晶狀體核性結(jié)晶樣混濁，混濁程度相似，形態(tài)一致?；颊呔铙w內(nèi)可見(jiàn)點(diǎn)簇狀灰白色混濁，中央混濁較為密集，向周邊部放散。部分患者伴有繼發(fā)性外斜視，不合并其他眼部及全身疾病。經(jīng)受檢者知情同意，采集其中17例家系成員的外周靜脈血5ml。該家系共有22個(gè)家系成員，10名患者。每代都有患者，為垂直遺傳，男女皆可患病，符合單基因常染色體顯性遺傳特點(diǎn)。圖1為患者眼部檢查表型，為晶狀體核性結(jié)晶樣混濁；圖為所收集的家系圖，符合常染色體顯性遺傳，其中方形圖標(biāo)表示男性，圓形圖標(biāo)表示女性，空白圖形表示正常人，黑色填充圖形表示患者，打斜線圖形表示去世。實(shí)施I對(duì)致病基因進(jìn)行染色體定位1、基因組DNA的提取
采用標(biāo)準(zhǔn)飽和酚/氯仿抽提法提取全血基因組DNA。2、連鎖分析
(I)微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)的選擇分別選取與17個(gè)已知ADCC致病基因距離5Mb范圍內(nèi)的22對(duì)多態(tài)性微衛(wèi)星遺傳標(biāo)記，每個(gè)ADCC候選基因及其周圍微衛(wèi)星標(biāo)記的物理距離如表I所
/Jn ο表1:17個(gè)已知ADCC致病基因及其`附近微衛(wèi)星標(biāo)記的物理距離
權(quán)利要求
1.一種結(jié)晶樣先天性白內(nèi)障致病基因CRYGD檢測(cè)試劑盒，其特征是由AS-PCR擴(kuò)增檢測(cè)試劑組成，所述的AS-PCR擴(kuò)增檢測(cè)試劑由IOXPCR buffer 2ul ;dNTP混合物O. 5ul ；10umol/L的AS-PCR特異性上下游引物和內(nèi)參的上下游引物各O. 5ul ;2 U/ul的Taq DNA聚合酶O. 5ul ;去離子水13ul組成。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的結(jié)晶樣先天性白內(nèi)障致病基因CRYGD檢測(cè)試劑盒，其特征是所述的正向特異性弓I物序列為5’ -GAATGCAGCAGCGACCACA-3’，反向特異性引物序列為5’ -GGGTCCTGACTTGAGGATGT-3’。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種結(jié)晶樣先天性白內(nèi)障致病基因CRYGD檢測(cè)試劑盒，涉及基因檢測(cè)盒。一種結(jié)晶樣先天性白內(nèi)障致病基因CRYGD檢測(cè)試劑盒，由AS-PCR擴(kuò)增檢測(cè)試劑組成，所述的AS-PCR擴(kuò)增檢測(cè)試劑由10×PCRbuffer2μl；dNTP混合物0.5μl；10μmol/L的AS-PCR特異性上下游引物和內(nèi)參的上下游引物各0.5μl；2U/ul的TaqDNA聚合酶0.5μl；去離子水13μl組成。本發(fā)明對(duì)患者血液中提取的DNA組直接對(duì)CRYGD基因P23T點(diǎn)突變進(jìn)行檢測(cè)，能夠精確地診斷結(jié)晶樣先天性白內(nèi)障，從而降低漏檢率，并能與其他先天性白內(nèi)障進(jìn)行鑒別。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK103045722SQ201210314560
公開日2013年4月17日 申請(qǐng)日期2012年8月30日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月30日
發(fā)明者張素華, 張哲 , 賈亞丁, 張曉慧 申請(qǐng)人:山西省眼科醫(yī)院