專利名稱：一種檢測(cè)煙草煙堿轉(zhuǎn)化相對(duì)水平的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種檢測(cè)煙草煙堿轉(zhuǎn)化相對(duì)水平的方法。
背景技術(shù)：
生物堿是廣泛存在于植物體內(nèi)的一類由小分子含氮化合物組成的次生代謝產(chǎn)物，目前世界上已有超過12000種的生物堿類物質(zhì)被分離鑒定。生物堿在煙草及其制品中有特殊的地位，它不僅是煙草重要的品質(zhì)要素，而且規(guī)定了煙草作為一種商品的特質(zhì)。煙堿、降煙堿、假木賊堿和新煙草堿是煙草中的4中主要生物堿。人們吸食煙草主要是吸食其中的煙堿(nicotine)，又名尼古丁。普通煙草屬于煙堿積累型，煙堿含量占總生物堿含量的90 95%，另外3種僅占生物堿總含量的5% 10%，降煙堿含量一般不超過總生物堿含 量的3. 5 %。普通煙草是純合雙隱性基因型(ctctcscs)，不具有煙堿去甲基能力。但在栽培品種的煙株群體中，一些植株會(huì)因?yàn)榛蛲蛔兌哂袩焿A去甲基能力，導(dǎo)致煙堿含量顯著降低，降煙堿含量則相應(yīng)增加，甚至可以達(dá)到95 %以上。這種煙堿向降煙堿轉(zhuǎn)化的性狀稱為煙堿轉(zhuǎn)化，具有煙堿轉(zhuǎn)化能力的煙株稱為轉(zhuǎn)化株(converter)。降煙堿含量的升高會(huì)直接影響煙葉的香吃味品質(zhì)，導(dǎo)致烤煙調(diào)制后出現(xiàn)“櫻紅”現(xiàn)象且香味不佳。同時(shí)由于降煙堿易于在煙葉調(diào)制和調(diào)制后的陳化過程中發(fā)生氧化、亞硝化和?；壬磻?yīng)，形成許多有害成分，如麥斯明(myosmine)、?；禑焿A(acylnornicotines)和亞硝基降煙堿(NNN)等，因此降煙堿含量的升高對(duì)人體健康也存在不利影響?？刂戚^低水平的降煙堿不僅是因?yàn)樗鳛樵S多有害成分的前體物質(zhì)對(duì)人體具有潛在的致癌性，還因?yàn)榻禑焿A本身對(duì)人體的健康也具有負(fù)面影響。降煙堿可以導(dǎo)致蛋白質(zhì)的異常糖基化，而且還可同許多常用的類固醇藥物(如強(qiáng)的松)發(fā)生共價(jià)反應(yīng)，從而改變這類藥物的藥效和毒理。因此，及時(shí)剔除煙草群體中的轉(zhuǎn)化株從而控制較低水平的降煙堿含量成為國(guó)際煙草工業(yè)界和學(xué)術(shù)界關(guān)注的熱點(diǎn)問題之一。目前檢測(cè)煙草煙堿轉(zhuǎn)化水平的方法主要是通過氣相色譜法(GC)和氣質(zhì)聯(lián)用法(GC-MS)檢測(cè)其生物堿組分與含量，進(jìn)而計(jì)算煙堿轉(zhuǎn)化水平。雖然該方法穩(wěn)定性、可操作性都比較好，但該方法通常僅能分析采收后的成熟煙葉或調(diào)制后的煙葉，且采收后需要一定的處理，較為耗時(shí)，無法在整個(gè)生育期動(dòng)態(tài)了解不同品種煙葉及同一品種的不同群體內(nèi)的煙堿轉(zhuǎn)化水平，進(jìn)而無法及時(shí)地將不良轉(zhuǎn)化株淘汰。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種檢測(cè)煙草煙堿轉(zhuǎn)化相對(duì)水平的方法，利用該方法可以簡(jiǎn)便快速檢測(cè)同一品種煙草不同時(shí)期或不同部位或不同品種煙草的葉片之間煙堿轉(zhuǎn)化相對(duì)水平。
一種檢測(cè)煙草煙堿轉(zhuǎn)化相對(duì)水平的方法，包括如下步驟(I)收集同一品種煙草不同時(shí)期或不同部位或不同品種煙草的葉片；(2)分別提取所述葉片的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA ；(3)針對(duì)煙堿轉(zhuǎn)化相關(guān)基因設(shè)計(jì)特異性引物，以所述cDNA為模板，利用所述特異性引物進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，得到各自的Ct值；(4)根據(jù)所述Ct值，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到各cDNA中煙堿轉(zhuǎn)化相關(guān)基因的模板量，判斷同一品種煙草不同時(shí)期或不同部位或不同品種煙草的葉片之間的煙堿轉(zhuǎn)化相對(duì)水平；所述特異性引物為 上游引物5’-ACGTGATCCTAAACTCTGGTCTG-3’ ；下游引物5’-GCCTGCACCTTCCTTCATG-3’ ；所述煙堿轉(zhuǎn)化相關(guān)基因?yàn)闊焿A去甲基化酶基因CYP82E4，其全長(zhǎng)cDNA核苷酸序列如 SEQ ID NO. I 所示。在檢測(cè)同一煙草品種不同部位或不同煙草品種的葉片煙堿轉(zhuǎn)化相對(duì)水平時(shí)，一般選用成熟期葉片。煙堿去甲基化酶基因CYP82E4是CYP82E2基因家族的成員，介導(dǎo)煙堿向降煙堿的轉(zhuǎn)化。該基因家族尤其是煙堿去甲基化酶基因CYP82E4在煙草轉(zhuǎn)化株中的轉(zhuǎn)錄水平普遍高于非轉(zhuǎn)化株，使用RNAi干擾技術(shù)抑制該基因的表達(dá)，可以有效降低高降煙堿含量煙草在煙草轉(zhuǎn)化株的比例。因此，針對(duì)該基因設(shè)計(jì)方法，能準(zhǔn)確靈敏地檢測(cè)煙草煙堿轉(zhuǎn)化相對(duì)水平。本發(fā)明實(shí)時(shí)熒光定量PCR所擴(kuò)增的并不是煙堿轉(zhuǎn)化相關(guān)基因的全序列，而僅僅是其中的某一片段，其堿基序列如SEQ ID No.4所示。逆轉(zhuǎn)錄過程中，各組所取RNA的體積及濃度是相同的，通過計(jì)算煙堿轉(zhuǎn)化相關(guān)基因的模板量(濃度)，就可以得到該基因的表達(dá)水平。所述實(shí)時(shí)熒光定量PCR采用SYBR Green I熒光嵌合法。所述實(shí)時(shí)熒光定量PCR的擴(kuò)增體系為20 μ L，其中Takara 2X SYBR Premix EXTaq 10 μ L、10 μ M正反向引物各O. 5 μ L、cDNA模板2 μ L、滅菌蒸懼水7 μ L。所述實(shí)時(shí)熒光定量PCR的反應(yīng)程序?yàn)?4°C預(yù)變性3min ;94°C變性30s，55°C退火30s, 72°C延伸 50s, 35 個(gè)循環(huán)；72°C延伸 5min。所述標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備方法為(I)制備一組濃度呈梯度分布的標(biāo)準(zhǔn)品；(2)以所述標(biāo)準(zhǔn)品為模板，利用所述引物，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，記錄Ct值；(3)繪制得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。所述標(biāo)準(zhǔn)品為含有煙堿去甲基化酶基因CYP82E4全長(zhǎng)cDNA核苷酸序列的重組載體懸液，或是含有所述重組載體的轉(zhuǎn)基因宿主細(xì)胞懸液。所述標(biāo)準(zhǔn)品的制備方法為(I)提取煙葉總RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA ；(2)以所述cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得目的片段；(3)將所述目的片段連入T載體，獲得重組載體。所述PCR擴(kuò)增所使用的引物為
上游引物為5’-ATGCTTTCTCCCATAGAAGCC-3’ ；下游引物為5’ -TTAATAAAGCTCAGGTGCCAG-3 ’。所述總RNA的質(zhì)量至關(guān)重要,應(yīng)采用高品質(zhì)的試劑盒或試劑進(jìn)行提取,如QiagenRNeasy Plant Mini kit 試劑盒。由于RNA易降解且雜質(zhì)難以去除，因此要測(cè)定所提取RNA的純度。RNA純品的OD26tl/OD280比值為2. O，若該比值較低，說明有蛋白或酚污染；若該比值太高，說明RNA有不同程度的降解。一般0D26Q/0D28Q比值為I. 8-2. O的RNA可用。PCR擴(kuò)增煙堿去甲基化酶基因CYP82E4全長(zhǎng)cDNA，是用于構(gòu)建重組載體；而實(shí)時(shí)熒光定量PCR是為了檢測(cè)該基因的表達(dá)量，因此在擴(kuò)增時(shí)不需全序列擴(kuò)增，但選用引物應(yīng)具有更好的特異性。
本發(fā)明采用SYBR Green I熒光嵌合法進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，是基于該方法具有以下優(yōu)點(diǎn)對(duì)DNA模板無選擇性，適用于任何DNA ;不必設(shè)計(jì)復(fù)雜探針，使用方便；非常靈敏；價(jià)格低廉。但正是由于SYBR Green I對(duì)DNA模板無選擇性，使之易與非特異的雙鏈DNA結(jié)合，產(chǎn)生假陽性。因此，在實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)結(jié)束后要作熔解曲線分析，判斷擴(kuò)增產(chǎn)物是否為目標(biāo)片段。若曲線只有單峰，且出峰位置是退火溫度，則無非特異性熒光，定量準(zhǔn)確；若出現(xiàn)雜峰或出峰位置不是退火溫度，則有其他產(chǎn)物出現(xiàn)非特異性熒光，定量不準(zhǔn)確。實(shí)時(shí)熒光定量PCR中，log X。(模板量)與Ct值呈線性關(guān)系，通過已知模板量的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)各樣品的Ct值，就可計(jì)算出所對(duì)應(yīng)的模板量，進(jìn)而分析各樣品的煙堿轉(zhuǎn)化相對(duì)水平。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為(I)本發(fā)明所述檢測(cè)煙草煙堿轉(zhuǎn)化相對(duì)水平所采用的SYBR Green I熒光嵌合法精確度高、靈敏性強(qiáng)；而且相比于相對(duì)定量法，本發(fā)明采用標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行絕對(duì)定量，在分析同一品種煙草不同時(shí)期或不同部位或不同品種煙草的葉片的煙堿轉(zhuǎn)化相對(duì)水平方面具有更大的優(yōu)勢(shì)。(2)本發(fā)明所述的方法取樣量少，與現(xiàn)有的檢測(cè)方法(GC法和GC-MS法)相比，不會(huì)對(duì)取樣煙株造成明顯傷害，且操作簡(jiǎn)便、結(jié)果精確、重復(fù)性好。(3)現(xiàn)有檢測(cè)方法只能在煙葉采收后才能對(duì)其煙堿轉(zhuǎn)化水平進(jìn)行分析，而本發(fā)明可以在整個(gè)生育期對(duì)不同煙葉樣品的煙堿轉(zhuǎn)化相對(duì)水平進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控，避免了現(xiàn)有檢測(cè)方法的時(shí)間限制，為研究人員與種植戶及時(shí)剔除不良轉(zhuǎn)化株開辟了一條新的有效途徑。


圖I為煙堿去甲基化酶基因CYP82E4cDNA全長(zhǎng)常規(guī)PCR的凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果。其中，M為Takara DL2000DNAMarker, I為煙堿去甲基化酶基因CYP82E4cDNA全長(zhǎng)擴(kuò)增產(chǎn)物。圖2為重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品構(gòu)建常規(guī)PCR驗(yàn)證的凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果。其中，M為TakaraDL2000DNA Marker, 1-6為不同陽性克隆中的目的片段。圖3為不同稀釋梯度的重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品實(shí)時(shí)熒光定量PCR的擴(kuò)增曲線。圖4為不同稀釋梯度的重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品實(shí)時(shí)熒光定量PCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線。其中，橫坐標(biāo)代表模板數(shù)的對(duì)數(shù)值，縱坐標(biāo)代表Ct值。
圖5A為不同稀釋梯度的重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品實(shí)時(shí)熒光定量PCR的熔解曲線。圖5B為不同稀釋梯度的重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品實(shí)時(shí)熒光定量PCR的熔融峰。圖6為不同稀釋梯度的重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品常規(guī)PCR的凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果。其中，M為 Takara IOObp DNA Marker, 1-7 依次為 I X 105、I X 106、I X 107、I X 108、I X 109、I X 1010、I X IO11拷貝/mL的重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I檢測(cè)煙草煙堿轉(zhuǎn)化相對(duì)水平的標(biāo)準(zhǔn)品的制備下面僅以含有煙堿去甲基化酶基因CYP82E4全長(zhǎng)cDNA 的重組質(zhì)粒為例，闡明其檢測(cè)煙草煙堿轉(zhuǎn)化相對(duì)水平的效果，其它含有煙堿去甲基化酶基因CYP82E4全長(zhǎng)cDNA的全部或部分核苷酸序列的重組載體或含有該重組載體的轉(zhuǎn)基因宿主細(xì)胞檢測(cè)煙草煙堿轉(zhuǎn)化相對(duì)水平的效果都與該標(biāo)準(zhǔn)品相同。(I)煙葉取樣以白肋煙B37為材料，選取其成熟期中部葉片2g，取好的鮮葉樣品用錫箔紙包好并標(biāo)記，迅速放入裝有液氮的冰盒中保存，快速送往實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行下一步工作。(2)總RNA提取、含量測(cè)定及反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)總RNA提取取上述錫箔紙中的煙葉樣品200mg,采用Qiagen公司的RNeasy PlantMini kit提取其總RNA,具體步驟如下將煙葉加液氮磨細(xì)，液氮揮發(fā)前轉(zhuǎn)入Eppendorf管并加450 μ L RLT提取緩沖液，振蕩后56°C溫浴3min ;將提取液轉(zhuǎn)入紫色柱，IOOOOg離心2min,濾液轉(zhuǎn)入新的Eppendorf管，加225 μ L無水乙醇混勻；濾液再轉(zhuǎn)入粉紅色柱，8000g離心15s，棄濾液；加700 μ L Rffl于粉紅色柱，8000g離心15s，棄濾液；加500 μ L RPE于粉紅色柱，8000g離心15s，棄濾液，重復(fù)一次，空管離心2min ;將粉紅色柱插到新的Eppendorf管上，加30 μ L無RNase水，IOOOOg離心Imin ;提取好的RNA樣品置_80°C保存?？俁NA含量測(cè)定用核酸蛋白測(cè)定儀內(nèi)置的RNA測(cè)定程序讀取RNA含量為345. 8 μ g/mL、OD260/OD280值為I. 933，表明總RNA純度較好，備用。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)采用Takara公司的AMV反轉(zhuǎn)錄酶，將總RNA中的mRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，稀釋10倍后備用。具體步驟如下反應(yīng)體系為20 μ L，其中總 RNA 2 μ L、50pmol/μ L Oligo (dT) 18primerl μ L, IOmMdNTP Mixture 2· 5 μ L、RNase Inhibitor 20U、AMV 反轉(zhuǎn)錄酶 10U、5 XAMV Buffer 4μ L,DEPC H2O定容至20yL。室溫下放置lOmin，移入42°C恒溫槽中保溫I. 5h，在冰水中冷卻2min即可。將得到的cDNA稀釋10倍后備用。(3)標(biāo)準(zhǔn)品的制備以上述cDNA為模板，以下述引物對(duì)煙堿去甲基化酶基因CYP82E4全長(zhǎng)cDNA序列進(jìn)行常規(guī)PCR擴(kuò)增，所述引物為正向引物序列5’-ATGCTTTCTCCCATAGAAGCC-3’ ；反向引物序列5，-TTAATAAAGCTCAGGTGCCAG-3，。所述常規(guī)PCR擴(kuò)增的具體步驟為I)目的基因的克隆和純化
PCR 反應(yīng)體系為 50 μ L，其中5U/ μ L Takara LATaq O. 5 μ L、2. 5mMdNTP 8 μ L、LATaq Buffer (Mg2+Free) 5 μ L,25mM MgCl25 μ L、20 μ M 正反向引物各 I μ L、cDNA 模板 I μ L、滅菌蒸懼水28. 5 μ L0PCR 反應(yīng)程序?yàn)?4°C預(yù)變性 3min ;94°C變性 30s，55°C退火 30s，72°C延伸 90s，30個(gè)循環(huán)；72°C延伸7min。取5 μ L PCR產(chǎn)物進(jìn)行I %瓊脂糖凝膠電泳，電泳結(jié)果如圖I所示。結(jié)果表明該擴(kuò)增產(chǎn)物大小為1600bp左右，顯示該擴(kuò)增產(chǎn)物為目的片段。取剩余的45 μ L PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳回收，利用Promega膠回收試劑盒(編號(hào)Α9281)進(jìn)行目的片段的回收純化?；厥占兓笕?μ L進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果表明回收純化的效果較好，可用于T-A或其他雙酶切克隆。2) T-A克隆技術(shù)
a、反應(yīng)將回收純化的目的片段和Takara pMD18_T simple Vector載體連接，連接體系為IOyL,其中目的片段2yL、pMD18-T simple Vector載體I μ L、高效連接液Solution I 5 μ UdH2O 2yL;4°C過夜連接。b、感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化將10 μ L連接產(chǎn)物加入至IOOyL DH5 α感受態(tài)細(xì)胞中，冰上放置30min ;42°C加熱45s，再在冰中放置Imin ;加入890 μ L LB培養(yǎng)基，37°C振蕩培養(yǎng)60min ;在含有X-Gal、IPTG和Amp的LB培養(yǎng)基上過夜培養(yǎng)，形成單菌落。3)陽性克隆的鑒定a、陽性克隆驗(yàn)證在轉(zhuǎn)化后涂板的培養(yǎng)基上分別挑取16個(gè)白色單菌落至含有5mLLB (Amp+)液體培養(yǎng)基的試管中，37°C振蕩過夜培養(yǎng)。取I μ L菌液為模板，采用步驟I)中的PCR體系與程序進(jìn)行PCR擴(kuò)增，驗(yàn)證質(zhì)粒中是否轉(zhuǎn)入了 1600bp左右的目的條帶。驗(yàn)證結(jié)果如圖2所示。將經(jīng)PCR證明為陽性克隆的菌液送測(cè)序，測(cè)序結(jié)果為1554bp，blast比對(duì)結(jié)果證明其為陽性重組質(zhì)粒，且該重組質(zhì)粒和GenBank中煙堿去甲基化酶基因CYP82E4mRNA序列(GenBank 登錄號(hào)DQ205656. I ；DQ131885. I ；DQ131886. I)具有 99% 以上的同源性，表明質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品構(gòu)建成功。該重組質(zhì)粒中所承載的核苷酸序列如SEQ ID NO. I所示。b、提取質(zhì)粒選擇含有目的片段的菌液，采用Axygen公司改進(jìn)的SDS堿裂解法AxyPrep質(zhì)粒DNA試劑盒提取質(zhì)粒DNA。具體過程如下取3mL菌液,12000g離心Imin,盡棄上清；加入250 μ L SI緩沖液重懸浮細(xì)菌沉淀；加入250 μ L S2緩沖液，溫和并充分地混勻使菌體充分裂解；加入350 μ L S3緩沖液，溫和混勻，12000g離心IOmin ;吸取上清轉(zhuǎn)移到制備管中，12000g離心Imin,棄濾液；加入500 μ L Wl緩沖液，12000g離心Imin,棄濾液；加入700 μ L W2緩沖液，12000g離心Imin,棄濾液；在制備管中加入80 μ L去離子水，12000g離心Imin ;_20°C保存?zhèn)溆谩?4)重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品檢測(cè)I)重組質(zhì)粒的濃度測(cè)定和拷貝數(shù)計(jì)算取純化的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品2 μ L，利用核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)得其濃度為94.5 μ g/mL，且OD26tZOD28tl比值為I. 888，表明質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品純度較好。根據(jù)質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品濃度可計(jì)算其拷貝數(shù)，計(jì)算公式如下DNA的拷貝數(shù)=(DNA的質(zhì)量/DNA的摩爾質(zhì)量)X 6. 02 X IO23雙鏈DNA 中 Ibp = 660Da，則 DNA 的摩爾質(zhì)量=660DaX (2692+1554)bp。帶入上述公式，得出質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的拷貝數(shù)為2. 030X IO13拷貝/mL。2)實(shí)時(shí)突光定量PCR檢測(cè)重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的范圍將重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行10倍的倍比稀釋，各稀釋梯度為1X1011，
IXio10......I X IO1拷貝/mL。利用下述特異性引物進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，該引物
的核苷酸序列為正向引物序列為5’-ACGTGATCCTAAACTCTGGTCTG-3’ ；反向引物序列為5’-GCCTGCACCTTCCTTCATG-3’。采用SYBR Green I熒光嵌合法進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，反應(yīng)體系為20 μ Lj 中Takara 2 X SYBR Premix EX Taq 10 μ L、10 μ M正反向引物各O. 5 μ L、質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品 2 μ L、滅菌蒸餾水7 μ L。實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)程序?yàn)?4°C預(yù)變性3min;94°C變性30s，55°C退火30s，72°C延伸50s，35個(gè)循環(huán)；72°C延伸5min ;55_95°C緩慢升溫，產(chǎn)生熔解曲線。擴(kuò)增曲線如圖3所示，由圖可知實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的范圍為Ixio5-Ixio11 拷貝 /mL。3)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制取已知的7個(gè)倍比稀釋的重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品(I X IO11U X IO10U X IO9UX IO8,I X IO7,1 X 106、I X IO5拷貝/mL)，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。每個(gè)稀釋梯度做3次重復(fù)，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系和程序同實(shí)施例I步驟(4)-2)。標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖4所示，質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品在I X IO5-I X IOltl拷貝/mL的范圍內(nèi)R2 = O. 9937，說明該體系線性較好；斜率為-4. 4208，說明該體系擴(kuò)增效率較高。圖中結(jié)果為3次重復(fù)試驗(yàn)的平均結(jié)果。4)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線的熔解曲線重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的熔解曲線的測(cè)定方法同步驟(4)_2)。測(cè)定結(jié)果如圖5A和58所示，特異性反應(yīng)的Tm值為81. 5±0.5°C，且曲線為單峰，說明未出現(xiàn)非特異性熒光，定量準(zhǔn)確。5)常規(guī)PCR檢測(cè)重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的范圍將稀釋梯度為I X IO5-I X IO11拷貝/mL的重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行常規(guī)PCR檢測(cè)。常規(guī)PCR 反應(yīng)體系為 50 μ L，其中，5U/μ L Takara LA Taq O. 5μ L,2. 5mM dNTP8μ L.LA Taq Buffer (Mg2+ Free) 5 μ L、25mM MgCl2 5 μ L、20 μ M 正反向引物各 I μ L、重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品I μ L、滅菌蒸懼水28. 5 μ L0常規(guī)PCR反應(yīng)程序?yàn)?4°C預(yù)變性3min ;94°C變性30s，55°C退火30s，72°C延伸90s, 30 個(gè)循環(huán)；72°C延伸 7min。取5 μ L PCR產(chǎn)物進(jìn)行I %瓊脂糖凝膠電泳，電泳結(jié)果如圖6所示，擴(kuò)增產(chǎn)物大小在200-300bp之間，測(cè)序結(jié)果為238bp，通過blast比對(duì)后，證明其為重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品目的片段中的部分核苷酸片段，該核苷酸片段的序列如SEQ ID N0.4所示。實(shí)施例2檢測(cè)白肋煙野生型和突變型煙堿轉(zhuǎn)化相對(duì)水平以白肋煙B37和高煙堿轉(zhuǎn)化突變體HNC-I為材料，利用所述引物檢測(cè)其煙堿轉(zhuǎn)化相對(duì)水平，具體步驟如下(I)煙葉取樣
以白肋煙B37和高煙堿轉(zhuǎn)化突變體HNC-I為材料，分別選取其團(tuán)棵期、旺長(zhǎng)期和成熟期的中部葉片各2g，取好的鮮葉樣品用錫箔紙包好并標(biāo)記，迅速放入裝有液氮的冰盒中保存，快速送往實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行下一步工作。⑵總RNA提取、含量測(cè)定 及反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)總RNA提取取上述錫箔紙中的煙葉樣品200mg,采用Qiagen公司的RNeasy PlantMini kit提取其總RNA,具體步驟如下將煙葉加液氮磨細(xì)，液氮揮發(fā)前轉(zhuǎn)入Eppendorf管并加450 μ L RLT提取緩沖液，振蕩后56°C溫浴3min ;將提取液轉(zhuǎn)入紫色柱，IOOOOg離心2min,濾液轉(zhuǎn)入新Eppendorf管，加225 μ L無水乙醇混勻；濾液再轉(zhuǎn)入粉紅色柱，8000g離心15s，棄濾液；加700 μ L RWl于粉紅色柱，8000g離心15s，棄濾液；加500 μ L RPE于粉紅色柱，8000g離心15s，棄濾液，重復(fù)一次，空管離心2min ;將粉紅色柱插到新Eppendorf管上,加30 μ L無RNase水，IOOOOg離心Imin ;提取好的總RNA樣品置_80°C保存。總RNA含量測(cè)定 總RNA用RNase-free處理水稀釋60倍，用核酸蛋白測(cè)定儀內(nèi)置的RNA測(cè)定程序讀取RNA的含量(表2)。表2白肋煙樣品RNA含量
權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)煙草煙堿轉(zhuǎn)化相對(duì)水平的方法，其特征在于，包括如下步驟 (1)收集同一品種煙草不同時(shí)期或不同部位或不同品種煙草的葉片； (2)分別提取所述葉片的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA； (3)針對(duì)煙堿轉(zhuǎn)化相關(guān)基因設(shè)計(jì)特異性引物，以所述cDNA為模板，利用所述特異性引物進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，得到各自的Ct值； (4)根據(jù)所述Ct值，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到各cDNA中煙堿轉(zhuǎn)化相關(guān)基因的模板量，判斷同一品種煙草不同時(shí)期或不同部位或不同品種煙草的葉片之間的煙堿轉(zhuǎn)化相對(duì)水平； 所述特異性引物為上游引物5’ -ACGTGATCCTAAACTCTGGTCTG-3’ ；下游引物5’ -GCCTGCACCTTCCTTCATG-3’ ； 所述煙堿轉(zhuǎn)化相關(guān)基因?yàn)闊焿A去甲基化酶基因CYP82E4，其全長(zhǎng)cDNA核苷酸序列如SEQ ID NO. I 所示。
2.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述實(shí)時(shí)熒光定量PCR采用SYBRGreen I突光嵌合法。
3.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述實(shí)時(shí)熒光定量PCR的擴(kuò)增體系為20 ii L，其中Takara 2X SYBR Premix EX Taq 10 ii L、10 ii M 正反向引物各 0. 5 ii L、cDNA 模板2 ii L、滅菌蒸懼水7 ii L。
4.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述實(shí)時(shí)熒光定量PCR的反應(yīng)程序?yàn)?4°C預(yù)變性3min ;94°C變性30s，55。。退火30s，72。。延伸50s，35個(gè)循環(huán)；72°C延伸5min。
5.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備方法為 (1)制備一組濃度呈梯度分布的標(biāo)準(zhǔn)品； (2)以所述標(biāo)準(zhǔn)品為模板，利用權(quán)利要求I所述的引物，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，記錄Ct值； (3)繪制得到標(biāo)準(zhǔn)曲線； 所述標(biāo)準(zhǔn)品為含有煙堿去甲基化酶基因CYP82E4全長(zhǎng)cDNA核苷酸序列的重組載體懸液，或是含有所述重組載體的轉(zhuǎn)基因宿主細(xì)胞懸液。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述重組載體的制備方法為 (1)提取煙草葉片總RNA，并反轉(zhuǎn)錄為cDNA； (2)以所述cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得目的片段； (3)將所述目的片段連入T載體，獲得重組載體。
所述PCR擴(kuò)增所使用的引物為 上游引物為5’ -ATGCTITCTCCCATAGAAGCC-3’ ； 下游引物為5’ -TTAATAAAGCTCAGGTGCCAG-3’。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測(cè)煙草煙堿轉(zhuǎn)化相對(duì)水平的方法，包括(1)收集同一品種煙草不同時(shí)期或不同部位或不同品種煙草的葉片；(2)分別提取所述葉片的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA；(3)針對(duì)煙堿轉(zhuǎn)化相關(guān)基因設(shè)計(jì)特異性引物，以所述cDNA為模板，利用所述特異性引物進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，得到各自的Ct值；(4)根據(jù)所述Ct值，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到各cDNA中煙堿轉(zhuǎn)化相關(guān)基因的模板量，判斷同一品種煙草不同時(shí)期或不同部位或不同品種煙草的葉片之間的煙堿轉(zhuǎn)化相對(duì)水平。本發(fā)明公開的方法不僅能對(duì)煙草煙堿轉(zhuǎn)化相對(duì)水平進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控，且準(zhǔn)確度高，靈敏性強(qiáng)，能及時(shí)將不良煙草轉(zhuǎn)化株淘汰。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102796821SQ20121031505
公開日2012年11月28日 申請(qǐng)日期2012年8月30日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月30日
發(fā)明者儲(chǔ)國(guó)海, 周國(guó)俊, 孫勃, 黃芳芳, 林福呈, 楊軍, 張芬, 金立鋒 申請(qǐng)人:浙江中煙工業(yè)有限責(zé)任公司, 中國(guó)煙草總公司鄭州煙草研究院