專利名稱：同向串聯(lián)共表達(dá)雙色熒光蛋白報(bào)告基因載體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及同向串聯(lián)共表達(dá)雙色熒光蛋白報(bào)告基因載體，是用于鑒定外源目的DNA片段是否具有啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄或起始翻譯功能的載體質(zhì)粒。
背景技術(shù)：
含有篩選標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因載體在基因工程中具有廣泛的用途。常見(jiàn)轉(zhuǎn)基因載體包含有一個(gè)或多個(gè)篩選標(biāo)記或報(bào)告基因，以方便對(duì)插入外源核苷酸片段重組質(zhì)粒的篩選和鑒定。其中熒光蛋白基因在活細(xì)胞中的表達(dá)產(chǎn)物具有生物活性穩(wěn)定、信號(hào)特異性強(qiáng)、有效活性維持時(shí)間長(zhǎng)、方便檢測(cè)和對(duì)外源目的基因表達(dá)活性干擾小等特點(diǎn)，所以常利用熒光蛋白基因的表達(dá)來(lái)研究外源核苷酸片段的功能。通常情況下，同一報(bào)告基因載體中僅含有一個(gè)熒 光蛋白基因，將目的DNA片段克隆到熒光蛋白基因的N端或C端，構(gòu)建的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染相應(yīng)宿主細(xì)胞，通過(guò)檢測(cè)熒光蛋白的表達(dá)即可判定目的核酸片段是否具有相應(yīng)功能，但難以同步反映重組報(bào)告基因質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率和判定目的DNA的生物功能。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種同向串聯(lián)共表達(dá)雙色熒光蛋白報(bào)告基因載體pDsRed2-MCS-EGFP，2012年07月06日送藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址是北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，分類命名大腸埃希氏菌(Escherichiacoli)，保藏號(hào) CGMCC 6320。本發(fā)明構(gòu)建同向串聯(lián)共表達(dá)雙色熒光蛋白的報(bào)告基因載體所采用的技術(shù)方案是利用基因克隆技術(shù)，在親本載體PIRES2-EGFP啟動(dòng)子pCMV后的Bgl II位點(diǎn)與SV40polyA序列之間置換入如下DNA序列自5'至3'方向依次插入紅色熒光蛋白基因DsRed2、優(yōu)化組合的多克隆酶切位點(diǎn)MCS(包括Sal I,Spe I,Sca I,Pvu I、Nhe I,Mlu I,EcoR I,Xba I,BamH
I、Sac II, Sac I, Sma I和EcoR V，其中Nhe I為非單克隆位點(diǎn))、綠色熒光蛋白基因EGFP和Xho I位點(diǎn)序列(如SEQN0. I中的第609-2085nt)，獲得如SEQN0. I (第l_5408nt)所示核苷酸序列的同向串聯(lián)共表達(dá)雙色熒光蛋白的新型報(bào)告基因載體質(zhì)粒pDsRed2-MCS-EGFP。所述同向串聯(lián)共表達(dá)雙色熒光蛋白的報(bào)告基因載體的DNA分子也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。含有所述載體分子、所述重組報(bào)告基因載體的轉(zhuǎn)基因重組菌或細(xì)胞也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明的同向串聯(lián)共表達(dá)雙色熒光蛋白報(bào)告基因載體具備經(jīng)直接酶切、連接構(gòu)建插入目的DNA的重組報(bào)告基因質(zhì)粒及轉(zhuǎn)染細(xì)胞等簡(jiǎn)單操作，就可以用于分析和鑒定插入目的DNA序列生物活性的功用；由pCMV啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄的多順?lè)醋觤RNA中，上游紅色熒光蛋白的表達(dá)指示轉(zhuǎn)染效率，下游綠色熒光蛋白的表達(dá)與否及其產(chǎn)量反映目的DNA序列是否具有相應(yīng)生物活性及其活性高低。


圖I同向串聯(lián)共表達(dá)雙熒光蛋白報(bào)告基因載體pDsRed2-MCS-EGFP的構(gòu)建圖譜。圖2載體骨架P Λ SG的PCR擴(kuò)增與克隆鑒定電泳圖譜。圖3構(gòu)建同向串聯(lián)共表達(dá)雙熒光蛋白報(bào)告基因載體pDsRed2-MCS-EGFP的電泳圖
-i'TfeP曰。圖4重組報(bào)告基因質(zhì)粒PDsRed2-LTR-EGFP的酶切鑒定電泳圖譜。圖5各質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞的熒光檢測(cè)結(jié)果。
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中如無(wú)特殊說(shuō)明，所用方法均為常規(guī)基因克隆方法，所用試劑均可經(jīng)商業(yè)途徑購(gòu)得。實(shí)施例I.構(gòu)建同向串聯(lián)共表達(dá)雙色熒光蛋白報(bào)告基因載體pDsRed2-MCS_EGFP(I)載體骨架P Λ SG的PCR擴(kuò)增與克隆在載體pIRES2-EGFP(PT3267-5，Clontech)的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)含有l(wèi)inker序列的引物P Λ SG F、P Λ SG R擴(kuò)增缺失IRES和EGFP基因片段的載體骨架ρ Λ SG (包括pCMV、PUCori、Kan/Neo、SV40polyA 功能或基因序列)。P ASG F 5/ -CGCCTCGAGTCTAGATCATAATCAGCCATACC-3'，(含有 XhoI、XbaI 的識(shí)別位點(diǎn))；ρ ASG R 5/ -CCGGATATCGAATTCGAAGCTTGAGC-3'，(含有 EcoR I、EcoR V 的識(shí)別位點(diǎn))。25 μ I 反應(yīng)體系的組成是雙蒸水 15. O μ 1，Ex Taq IOXBuffer 2. 5 μ 1，dNTPs
2.O μ I,MgCl2L 5 μ l，pASG Fl. O μ l，pASG R I. O μ l，pIRES2_EGFPTE 溶液 I. O μ I,ExTaq
1.O μ I。PCR擴(kuò)增條件是 95°C 5min ；95°C 50sec,55°C 50sec,72°C 5min，共 32 個(gè)循環(huán)；最后經(jīng)72°C IOmin充分延伸后冷卻至4°C保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)O. 8 %瓊脂糖凝膠電泳分離大小為3975bp的ρ Λ SG PCR產(chǎn)物，切膠同收后與pMD 18-TSimple Vector連接構(gòu)建重組克隆psT- Δ SG。經(jīng)常規(guī)轉(zhuǎn)化經(jīng)CaCl2制備的DH5a感受態(tài)細(xì)胞，涂布含Ampicillin的LB固體平板，37°C過(guò)夜培養(yǎng)。到時(shí)選取平板上優(yōu)勢(shì)抗性生長(zhǎng)的單菌落，用引物ρ Λ SG F, ρ Δ SG R做菌落PCR檢測(cè)。初步檢測(cè)為陽(yáng)性的克隆菌落經(jīng)挑菌，在含Ampicillin的LB液體培養(yǎng)基中過(guò)夜擴(kuò)增后送商業(yè)公司測(cè)序。提取結(jié)果正確的克隆樣品的質(zhì)粒進(jìn)行EcoR I、XhoI雙酶切和Bgl II單酶切反應(yīng)，鑒定載體質(zhì)粒PsT- Δ SG。psT- Δ SG經(jīng)EcoRI和XhoI雙酶切出2710bp和3957bp兩條帶，經(jīng)Bgl II單酶切出6667bp的一條帶?？寺?、鑒定psT-Λ SG的電泳結(jié)果如圖2所示。圖2中，I.擴(kuò)增ρ Λ SG的PCR產(chǎn)物、
2.菌落PCR鑒定ρΛ SG的擴(kuò)增結(jié)果、3. psT-Λ SG經(jīng)EcoR I和XhoI雙酶切產(chǎn)物、4. psT-Λ SG經(jīng) Bgl II 單酶切產(chǎn)物、5. DNA MarkerDL15000.(2)構(gòu)建同向串聯(lián)共表達(dá)雙色熒光蛋白報(bào)告基因載體質(zhì)粒pDsRed2-MCS-EGFP在載體pDsRed2-Cl(PT3603_5，Clontech)的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)引物 DsRed2F、DsRed2R擴(kuò)增紅色熒光蛋白基因DsRed2(723nt)。DsRed2F :5'-CAGATCTACCATGGCCTCCTCCGAGAAC-3'，(含有 Bgl II 識(shí)別位點(diǎn));DsRed2R 5'-GAATTCACGCGTGCTAGCGATCGAGTACTAGTCGACTACAGGAACAGGTGGTGGCGGC-3'，(含有Sal I、Spe I、ScaI、PvuI、獨(dú)§1、MluI和EcoRI識(shí)別位點(diǎn)，其中NhsL不是單克降酶切位點(diǎn))。PCR 反應(yīng)體系是雙蒸水 15·0μ 1，ExTaq 10XBuffer2. 5 μ I, dNTPs 2. Ομ I,MgCl2L 5 μ I, DsRed2F I. O μ I, DsRed2R I. O μ 1，pDsRed2_ClTE 溶液 1.0 μ 1，Ex TaqI. O μ I。PCR 擴(kuò)增條件是 95°C 5min ；95°C 50sec, 55°C 50sec, 72V 50sec，共 32 個(gè)循環(huán)；最后經(jīng)72°C IOmin充分延伸后冷卻至4°C保存。

PCR產(chǎn)物經(jīng)O. 8%瓊脂糖凝膠電泳分離，切膠回收后與pMD 18-T Simple Vector連接。連接產(chǎn)物經(jīng)常規(guī)轉(zhuǎn)化經(jīng)CaCl2制備的DH5a感受態(tài)細(xì)胞，涂布含Ampicillin的LB固體平板，37 °C過(guò)夜培養(yǎng)。到時(shí)用引物DsRed2F、DsRed2R做菌落PCR檢測(cè)，陽(yáng)性克隆菌落經(jīng)含Ampicillin LB液體培養(yǎng)基擴(kuò)增后送商業(yè)公司測(cè)序。提取結(jié)果正確的克隆樣品的質(zhì)粒進(jìn)行Bgl II和EcoRI雙酶切，鑒定重組質(zhì)粒psT-DsRed2。在載體pIRES2-EGFP(PT3267-5，Clontech)的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)引物EGFPF、EGFP R擴(kuò)增綠色熒光蛋白基因EGFP(766nt)。EGFP F5'-GAATTCTAGAGGATCCGCGGAGCTCCCGGGATATCATGGTGAGCAAGGGCGAG-3，(含有 EcoR I、Xba I、BamHI、Sac II、Sac I、Sma I 和 EcoR V 識(shí)別位點(diǎn))；EGFPR 5' -CGCGGCTCGAGTTACTTGTACAGCTCGTCCATGC-3'，(含有 Xho I 識(shí)別位點(diǎn))。PCR 反應(yīng)體系是雙蒸水 15. O μ I，Ex Taq IOXBuffer 2· 5 μ I，dNTPs 2· O μ I，MgCl2L 5 μ 1，EGFP F I. O μ I, EGFP R I. O μ 1，plRES2_EGFP TE 溶液 1.0 μ 1，Ex Taq
I.O μ I。PCR 擴(kuò)增條件是 95°C 5min ；95°C 50sec, 55°C 50sec, 72V 50sec，共 32 個(gè)循環(huán)；最后經(jīng)72°C IOmin充分延伸后冷卻至4°C保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)O. 8%瓊脂糖凝膠電泳分離，切膠回收后與pMD 18-T Simple Vector連接。連接產(chǎn)物經(jīng)常規(guī)轉(zhuǎn)化經(jīng)CaCl2制備的DH5a感受態(tài)細(xì)胞，涂布含Ampicillin的LB固體平板，37 °C過(guò)夜培養(yǎng)。到時(shí)用引物EGFP F、EGFP R做菌落PCR檢測(cè)，陽(yáng)性克隆菌落經(jīng)在含Ampicillin LB液體培養(yǎng)基擴(kuò)增后送商業(yè)公司測(cè)序。提取結(jié)果正確的克隆樣品的質(zhì)粒進(jìn)行EcoR I、Xho I雙酶切反應(yīng)，鑒定重組質(zhì)粒psT-EGFP。取載體質(zhì)粒psT- Λ SG經(jīng)Bgl II、Xho I雙酶切后的載體片段ρ Λ SGBg_xh,psT-DsRed2 經(jīng)Bgl II,EcoR I 雙酶切目的片段 DsRed2Bg_Ei，以及 psT-EGFP 經(jīng)EcoR I、Xho I雙酶切目的片段EGFPEi_a，用T4連接酶進(jìn)行連接。10 μ I的反應(yīng)體系是ρ Δ SGBg_xh 2. O μ 1，DsRed2Bg_Ei 3. 0 μ l,EGFPEi_xh 3. 0 μ I, IOXT4Buffer I. 0 μ I,T4Iigase I. O μ I。連接反應(yīng)條件是16°C 4h，到時(shí)轉(zhuǎn)至4°C保存。連接產(chǎn)物常規(guī)轉(zhuǎn)化經(jīng)CaCl2制備的DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，涂布含Kanamycin的LB固體平板，37°C過(guò)夜培養(yǎng)。到時(shí)用引物EGFP F、EGFP R與DsRed2F、DsRed2R分別作菌落PCR篩選，兩次均呈陽(yáng)性的克隆菌落經(jīng)挑菌在含Kanamycin的LB液體培養(yǎng)基中過(guò)夜培養(yǎng)，提取質(zhì)粒分別進(jìn)行Bgl II和Sal I、Bgl II和EcoRI、EcoR I和Xho I及EcoR V和Xho I雙酶切反應(yīng)，鑒定重組同向串聯(lián)共表達(dá)雙色熒光蛋白報(bào)告基因載體質(zhì)粒pDsRed2-MCS-EGFP ;其載體圖譜如圖I所示。PDsRed2-MCS-EGFP經(jīng)Bgl II、Sal I雙酶切出4722bp和686bp兩條帶、經(jīng)Bgl II、EcoR I雙酶切出4692bp和716bp兩條帶、經(jīng)EcoR I、Xho I雙酶切出大小為4653bp和755bp兩條帶、經(jīng)EcoR V、Xho I雙酶切出大小為4682bp和726bp兩條帶；其酶切鑒定瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖3所示。圖3中，l:Bgl II,Sal I雙酶切結(jié)果、2 :Bgl
II、EcoRI雙酶切結(jié)果、3 :EcoR I,Xho I雙酶切結(jié)果、4 :EcoR V,Xho I雙酶切的結(jié)果、5 :DNAMarker DL15000。2.構(gòu)建插入REV LTR的重組雙色熒光報(bào)告基因質(zhì)粒pDsRed2_LTR-EGFP取攜帶REV LTR的重組質(zhì)粒psT-LTR與重組雙熒光蛋白報(bào)告基因載體質(zhì) 粒 pDsRed2-MCS-EGFP 同樣經(jīng) EcoR I、EcoR V 雙酶切后的目的片段 LTR1^v(SSOnt)、pDsRec^-MCS-EGFPh，用 T4 連接酶進(jìn)行連接。10 μ I 的反應(yīng)體系是=IOXT4Buffer I. O μ 1，pDsRed2-MCS-EGFPI_v I. Ομ I, LTR1^v 7· O μ 1，T4Iigase I. O μ I。連接反應(yīng)條件是 16 °C 4h,到時(shí)轉(zhuǎn)至4°C保存。連接產(chǎn)物常規(guī)轉(zhuǎn)化經(jīng)CaCl2制備的DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，涂布含Kanamycin的LB固體平板培養(yǎng)基，37°C過(guò)夜培養(yǎng)。到時(shí)挑取優(yōu)勢(shì)抗性單克隆菌落過(guò)夜培養(yǎng)，提取質(zhì)粒分別進(jìn)行Bgl II和Sal I、EcoR I和EcoR V、EcoR V和Xho I組合的雙酶切反應(yīng)，鑒定重組質(zhì)粒pDsRed2-LTR-EGFP。pDsRed2_LTR-EGFP 經(jīng) Bgl II、Sal I 切出 5272bp 和 686bp 兩條帶、經(jīng) EcoR I、EcoR V 切出 5402bp 和 556bp 兩條帶、經(jīng) EcoR V、Xho I 切出 5232bp 和 726bp兩條帶、經(jīng) Bgl II, EcoR I, EcoRV, Xho I 四酶切出 3937bp (載體片段)、716bp (DsRed2)、556bp (LTR)和726bp (EGFP)四條帶，但由于716bp和726bp的兩者大小相差太少，故電泳時(shí)短時(shí)間內(nèi)不可能被明顯分離開(kāi)，而重合成寬度擴(kuò)大、亮度幾乎加倍的一條帶，其瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖4所示。圖4中，I =BglII, SalI雙酶切的結(jié)果、2 =EcoRI, EcoRV雙酶切的結(jié)果、3 =EcoRV,Xho I雙酶切的結(jié)果、4和5 Bgl II,EcoR I.EcoR V,Xho I四酶切的結(jié)果、6 DNA Marker 15000。3.細(xì)胞轉(zhuǎn)染取親本載體質(zhì)粒pIRES2-EGFP、pDsRed2_Cl 和重組質(zhì)粒 pDsRed2-MCS_EGFP、pDsRed2-LTR-EGFP 各約 O. 8μ g，參照《分子克隆(第三版)》P1276_1281，用 Lipofectamine轉(zhuǎn)染已長(zhǎng)成單層的CHO細(xì)胞。24h后將轉(zhuǎn)染細(xì)胞置于熒光顯微鏡下檢測(cè)綠色和紅色熒光蛋白的表達(dá)。熒光檢測(cè)結(jié)果如圖5所示，親本載體質(zhì)粒pDsRed2-Cl轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中只有紅色熒光蛋白表達(dá)(圖5，B)，pIRES2-EGFP轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中只有綠色熒光蛋白表達(dá)(圖5，C)，同向串聯(lián)共表達(dá)雙色熒光蛋白報(bào)告基因載體質(zhì)粒pDsRed2-MCS-EGFP轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中只有紅色熒光蛋白表達(dá)(圖5，D)，在MCS區(qū)克隆入REV LTR的重組同向串聯(lián)共表達(dá)雙色熒光蛋白報(bào)告基因載體質(zhì)粒pDsRed2-LTR-EGFP轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中，綠色和紅色熒光蛋白都獲得了高效表達(dá)(圖5，E、F);同時(shí)以未轉(zhuǎn)染的空白CHO細(xì)胞作對(duì)照(圖5，A)。圖5中，A :未轉(zhuǎn)染的空白CHO細(xì)胞，B :pDsRed2_Cl轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞，C :pIRES2_EGFP轉(zhuǎn)染的 CHO 細(xì)胞，D pDsRed2-MCS-EGFP 轉(zhuǎn)染的 CHO 細(xì)胞，E 和 F pDsRed2-LTR-EGFP 轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞?！?10〉泰山醫(yī)學(xué)院〈120〉同向串聯(lián)共表達(dá)雙色熒光蛋白報(bào)告基因載體pDsRed2-MCS-EGFP<141)2012-08-18<160>1-5408<210>SEQ NO. I<211>5408<212>DNA 〈213〉人工序列〈220〉<400>1tagttattaa tagtaatcaa ttacggggtcattagttcat agcccatata tggagttccg60cgttacataa cttacggtaa atggcccgcctggctgaccg cccaacgacc cccgcccatt120gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagtaacgccaata gggactttcc attgacgtca180atgggtggag tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt atcatatgcc240aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt atgcccagta300catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca tcgctattac360catggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg actcacgggg420atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc aaaatcaacg480ggactttcca aaatgtcgta acaactccgccccattgacg caaatgggcg gtaggcgtgt540acggtgggag gtctatataa gcagagctgg tttagtgaac cgtcagatcc gctagcgcta600ccggactcag atctaccatg gcctcctccg agaacgtcat caccgagttc atgcgcttca660aggtgcgcat ggagggcacc gtgaacggccacgagttcga gatcgagggc gagggcgagg720gccgccccta cgagggccac aacaccgtga agctgaaggt gaccaagggc ggccccctgc780ccttcgcctg ggacatcctg tccccccagttccagtacgg ctccaaggtg tacgtgaagc840accccgccga catccccgac tacaagaagctgtccttccc cgagggcttc aagtgggagc900gcgtgatgaa cttcgaggac ggcggcgtgg cgaccgtgac ccaggactcc tccctgcagg960acggctgctt catctacaag gtgaagttca tcggcgtgaa cttcccctcc gacggccccg1020tgatgcagaa gaagaccatg ggctgggagg cctccaccga gcgcctgtac ccccgcgacg1080gcgtgctgaa gggcgagacc cacaaggccctgaagctgaa ggacggcggc cactacctgg1140tggagttcaa gtccatctac atggccaaga agcccgtgca gctgcccggc tactactacg1200tggacgccaa gctggacatc acctcccaca acgaggacta caccatcgtg gagcagtacg1260agcgcaccga gggccgccac cacctgttcctgtagtcgac tagtactcga tcgctagcac1320gcgtgaattc tagaggatcc gcggagctcccgggatatca tggtgagcaa gggcgaggag1380ctgttcaccg gggtggtgcc catcctggtcgagctggacg gcgacgtaaa cggccacaag1440ttcagcgtgt ccggcgaggg cgagggcgatgccacctacg gcaagctgac cctgaagttc1500atctgcacca ccggcaagct gcccgtgccctggcccaccc tcgtgaccac cctgacctac1560ggcgtgcagt gcttcagccg ctaccccgaccacatgaagc agcacgactt cttcaagtcc1620gccatgcccg aaggctacgt ccaggagcgcaccatcttct tcaaggacga cggcaactac1680
aagacccgcg ccgaggtgaa gttcgagggc gacaccctgg tgaaccgcatcgagctgaag1740ggcatcgact tcaaggagga cggcaacatc ctggggcaca agctggagtacaactacaac1800agccacaacg tctatatcat ggccgacaag cagaagaacg gcatcaaggtgaacttcaag1860atccgccaca acatcgagga cggcagcgtg cagctcgccg accactaccagcagaacacc1920cccatcggcg acggccccgt gctgctgccc gacaaccact acctgagcacccagtccgcc1980ctgagcaaag accccaacga gaagcgcgat cacatggtcc tgctggagttcgtgaccgcc2040gccgggatca ctctcggcat ggacgagctg tacaagtaac tcgagtctagatcataatca2100
gccataccac atttgtagag gttttacttg ctttaaaaaa cctcccacacctccccctga2160acctgaaaca taaaatgaat gcaattgttg ttgttaactt gtttattgcagcttataatg2220gttacaaata aagcaatagc atcacaaatt tcacaaataa agcatttttttcactgcatt2280ctagttgtgg tttgtccaaa ctcatcaatg tatcttaagg cgtaaattgtaagcgttaat2340attttgttaa aattcgcgtt aaatttttgt taaatcagct cattttttaaccaataggcc2400gaaatcggca aaatccctta taaatcaaaa gaatagaccg agatagggttgagtgttgtt2460ccagtttgga acaagagtcc actattaaag aacgtggact ccaacgtcaaagggcgaaaa2520accgtctatc agggcgatgg cccactacgt gaaccatcac cctaatcaagttttttgggg2580tcgaggtgcc gtaaagcact aaatcggaac cctaaaggga gcccccgatttagagcttga2640cggggaaagc cggcgaacgt ggcgagaaag gaagggaaga aagcgaaaggagcgggcgct2700agggcgctgg caagtgtagc ggtcacgctg cgcgtaacca ccacacccgccgcgcttaat2760gcgccgctac agggcgcgtc aggtggcact tttcggggaa atgtgcgcggaacccctatt2820tgtttatttt tctaaataca ttcaaatatg tatccgctca tgagacaataaccctgataa2880atgcttcaat aatattgaaa aaggaagagt cctgaggcgg aaagaaccagctgtggaatg2940tgtgtcagtt agggtgtgga aagtccccag gctccccagc aggcagaagtatgcaaagca3000tgcatctcaa ttagtcagca accaggtgtg gaaagtcccc aggctccccagcaggcagaa3060gtatgcaaag catgcatctc aattagtcag caaccatagt cccgcccctaactccgccca3120tcccgcccct aactccgccc agttccgccc attctccgcc ccatggctgactaatttttt3180ttatttatgc agaggccgag gccgcctcgg cctctgagct attccagaagtagtgaggag3240gcttttttgg aggcctaggc ttttgcaaag atcgatcaag agacaggatgaggatcgttt3300cgcatgattg aacaagatgg attgcacgca ggttctccgg ccgcttgggtggagaggcta3360ttcggctatg actgggcaca acagacaatc ggctgctctg atgccgccgtgttccggctg3420tcagcgcagg ggcgcccggt tctttttgtc aagaccgacc tgtccggtgccctgaatgaa3480ctgcaagacg aggcagcgcg gctatcgtgg ctggccacga cgggcgttccttgcgcagct3540gtgctcgacg ttgtcactga agcgggaagg gactggctgc tattgggcgaagtgccgggg3600caggatctcc tgtcatctca ccttgctcct gccgagaaag tatccatcatggctgatgca3660atgcggcggc tgcatacgct tgatccggct acctgcccat tcgaccaccaagcgaaacat3720cgcatcgagc gagcacgtac tcggatggaa gccggtcttg tcgatcaggatgatctggac3780gaagagcatc aggggctcgc gccagccgaa ctgttcgcca ggctcaaggcgagcatgccc3840gacggcgagg atctcgtcgt gacccatggc gatgcctgct tgccgaatatcatggtggaa3900aatggccgct tttctggatt catcgactgt ggccggctgg gtgtggcggaccgctatcag3960gacatagcgt tggctacccg tgatattgct gaagagcttg gcggcgaatgggctgaccgc4020
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權(quán)利要求
1.一種DNA分子，其特征是經(jīng)優(yōu)化MCS序列串聯(lián)的可同向串聯(lián)共表達(dá)雙色熒光蛋白報(bào)告基因載體質(zhì)粒pDsRed2-MCS-EGFP，具有SEQ NO. I中第609_2085nt的DNA序列。
2.含有權(quán)利要求I所述報(bào)告基因載體質(zhì)粒的構(gòu)建方法。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的報(bào)告基因載體質(zhì)粒，其特征在于pCMV下游連接有優(yōu)化MCS串聯(lián)表達(dá)的雙色熒光蛋白報(bào)告基因序列DsRed2-MCS-EGFP，所述報(bào)告基因載體的核苷酸序列為SEQ NO. I中的第l-5408nt的DNA序列。
4.含有權(quán)利要求I所述報(bào)告基因載體質(zhì)粒的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞。
5.含有權(quán)利要求2或3所述報(bào)告基因載體質(zhì)粒的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞。
6.含有權(quán)利要求I所述報(bào)告基因載體質(zhì)粒的重組菌。
7.含有權(quán)利要求2或3所述報(bào)告基因載體質(zhì)粒的重組菌。
8.權(quán)利要求2或3所述報(bào)告基因載體質(zhì)粒在檢測(cè)目的DNA序列功能中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及同向串聯(lián)共表達(dá)雙色熒光蛋白報(bào)告基因載體pDsRed2-MCS-EGFP。它是在載體pIRES2-EGFP的基礎(chǔ)上，經(jīng)PCR反應(yīng)獲得缺失IRES和EGFP序列的載體骨架pΔSG，構(gòu)建其T載體克隆psT-ΔSG，酶切后與同步酶切的、攜帶附加優(yōu)化MCS序列的熒光蛋白報(bào)告基因DsRed2、EGFP進(jìn)行連接、亞克隆而得。將待分析目的DNA序列定向克隆入pDsRed2-MCS-EGFP的MCS區(qū)，獲得的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染相應(yīng)宿主細(xì)胞，DsRed2的本底表達(dá)指示轉(zhuǎn)染效率，EGFP的表達(dá)有賴MCS區(qū)目的DNA序列的活性，其表達(dá)與否及表達(dá)量的多少，皆作為指征目的DNA序列是否具有相應(yīng)生物活性及其高低。優(yōu)化的MCS序列適合更廣泛的基因克隆操作；DsRed2和EGFP表達(dá)的檢測(cè)時(shí)效范圍寬，且相互獨(dú)立、互為表征，成像效果清晰、鮮明，使實(shí)驗(yàn)操作更簡(jiǎn)便，結(jié)果更具說(shuō)服力。
文檔編號(hào)C12N15/65GK102839188SQ20121031518
公開(kāi)日2012年12月26日 申請(qǐng)日期2012年10月14日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月14日
發(fā)明者王玉, 于愛(ài)蓮, 姜世金, 施魯?shù)?申請(qǐng)人:泰山醫(yī)學(xué)院