專利名稱：一種豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白基因及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于家畜基因工程疫苗技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白基因及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
豬圓環(huán)病毒2型(Porcine Circovirus type 2, PCV2)是斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(Postweaning multsystemic wasting syndrome, PMWS)的病原，該病毒可引起斷奶仔豬發(fā)生進(jìn)行性消瘦、咳嗽、呼吸困難、腹瀉、皮膚蒼白或者黃染、淋巴結(jié)腫大、腎臟灰白水腫等癥狀。同時(shí)該病毒還會(huì)造成一定程度上的的免疫抑制，容易造成其它疾病的繼發(fā)或并發(fā)感染。自1991年加拿大首次發(fā)現(xiàn)臨床豬圓環(huán)病毒以來(lái)，該病已給全世界養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。因此，對(duì)豬圓環(huán)病毒2型的研究一直是家禽養(yǎng)殖領(lǐng)域的重點(diǎn)之一。 豬圓環(huán)病毒2型的Cap蛋白是PCV2的主要結(jié)構(gòu)蛋白，可自我裝配成病毒性粒子，并含有可中和病毒的抗原表位，可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生較強(qiáng)的抗體反應(yīng)并獲得免疫保護(hù)，是設(shè)計(jì)PCV2新型疫苗的首選目標(biāo)基因。目前，國(guó)外已有昆蟲桿狀病毒表達(dá)豬圓環(huán)病毒2型的Cap蛋白制備的基因工程亞單位疫苗實(shí)現(xiàn)商業(yè)化應(yīng)用。但隨著豬圓環(huán)病毒2型毒株不斷變異，現(xiàn)有疫苗的免疫保護(hù)力不斷下降。因此，篩選當(dāng)前流行毒株的Cap蛋白進(jìn)行疫苗研發(fā)無(wú)疑具有重要的現(xiàn)實(shí)意義和市場(chǎng)開發(fā)價(jià)值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白基因及其應(yīng)用，即一種新的豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白基因，及其作為疫苗的應(yīng)用。本發(fā)明一個(gè)方面提供一種圓環(huán)病毒2型Cap蛋白，包括氨基酸序列為SEQ ID NO:I的蛋白。本發(fā)明另一個(gè)方面涉及編碼上述蛋白的核苷酸，其序列為SEQ ID NO :2。本發(fā)明再一個(gè)方面涉及圓環(huán)病毒2型Cap蛋白在制備豬圓環(huán)病毒2型基因工程亞單位疫苗中的應(yīng)用。本發(fā)明獲得的豬圓環(huán)病毒2型基因工程亞單位疫苗經(jīng)肌肉接種21日齡PCV2陰性斷奶仔豬，接種28日后取血測(cè)PCV2抗體，免疫組PCV2抗體全部為陽(yáng)性，有效率達(dá)到100%，而對(duì)照組未檢測(cè)到抗體。結(jié)果顯示制備的重組蛋白免疫原性良好，其進(jìn)一步制備的豬圓環(huán)病毒2型基因工程亞單位疫苗可以引起仔豬的免疫應(yīng)答。說(shuō)明書附I :本發(fā)明所用的載體構(gòu)建圖譜。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施方式
來(lái)進(jìn)一步描述本發(fā)明，但本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的技術(shù)方案的情況下可以對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明保護(hù)范圍內(nèi)。—、豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白基因的擴(kuò)增將臨床分離疑似PMWS的病料處理后接種無(wú)PCVl污染的PK-15細(xì)胞、盲傳三代后，PCR擴(kuò)增豬圓環(huán)病毒2型基因全長(zhǎng)，引物序列如下Pl: 5' --GCTGGCTGAACTTTTGAAAG—3'P2 5 ' --AAATTTCTGACAAACGTTAC—3'擴(kuò)增的條件如下94°C5min 變性，94°C 30S，65°C 30S，72°C I. 5min，30 個(gè)循環(huán)，72°C延伸 lOmin。擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序后將Cap蛋白基因序列部分在NCBI上Blast比對(duì)，同源性最高為97%，表明擴(kuò)增的樣品為發(fā)生變異的病毒株。其翻譯的氨基酸序列為SEQ ID NO 10對(duì) Cap蛋白基因進(jìn)行大腸桿菌稀有密碼子改造，改造后的核苷酸序列為SEQ ID NO :2。將改造后的Cap蛋白基因的核苷酸(SEQ ID NO :2)5'端和3'端分別加上BamH I和Hind III酶切位點(diǎn)，送基因公司進(jìn)行全基因合成。二、基因工程蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建與工程菌的獲得I、上述擴(kuò)增得到的Cap蛋白基因雙酶切后連入pET30a載體相應(yīng)的酶切位點(diǎn)，構(gòu)建pET30a/mCap表達(dá)載體(圖I)。2、用CaCl2法將pET30a/mCap表達(dá)載體轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21 (DE3)，涂布于含50 μ g/ml卡那霉素的瓊脂平板，37°C過(guò)夜培養(yǎng)。選取10個(gè)單菌落提取質(zhì)粒，BamH I和HindIII雙酶切驗(yàn)證陽(yáng)性的菌落進(jìn)一步測(cè)序鑒定。將測(cè)序驗(yàn)證后的陽(yáng)性克隆在LB培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)至O. 6 O. 8時(shí)加入O. 3mM IPTG誘導(dǎo)4 5小時(shí)，離心收集菌體跑SDS-PAGE電泳，同時(shí)設(shè)立未誘導(dǎo)菌體作為對(duì)照。結(jié)果誘導(dǎo)后陽(yáng)性克隆比對(duì)照菌在30KD處多出一條蛋白條帶，與重組蛋白理論分子量一致，表達(dá)量約為35%以上。經(jīng)PCV2抗體免疫印跡檢定，顯示陽(yáng)性反應(yīng)。證明獲得的陽(yáng)性克隆為高效表達(dá)基因工程蛋白(SEQ ID NO :1)的工程菌。三、發(fā)酵、純化與豬圓環(huán)病毒2型基因工程亞單位疫苗的制備I、發(fā)酵工藝I) LB培養(yǎng)基作為種子培養(yǎng)基，含5g/L葡萄糖和5g/L MgSO4 · 7H20的LB培養(yǎng)基作為發(fā)酵培養(yǎng)基，補(bǔ)料為葡萄糖400g/L、蛋白胨24g/L、酵母提取物10 g/L、NaCl 5 g/L、MgSO4 · 7H20 5 g/L ο2)發(fā)酵過(guò)程挑取鑒定過(guò)的工程菌接種于含卡那霉素的濃度為50 μ g/ml的LB培養(yǎng)基，37°C振蕩培養(yǎng)8小時(shí)，作為種子液。將種子液按2%接種量接種于發(fā)酵罐中，調(diào)節(jié)好各參數(shù)，37°C，200轉(zhuǎn)，溶氧控制在20%以上。發(fā)酵4小時(shí)后開始流加補(bǔ)料，發(fā)酵6小時(shí)后加入O. 3mmol/LIPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)后6小時(shí)發(fā)酵結(jié)束。3)鎳柱純化、脫鹽4)親和層析采用鎳離子金屬螯合層析柱，重組蛋白可以用含300mmol/L咪唑的洗脫液洗下來(lái)，純度達(dá)到90%以上5)脫鹽收集的重組蛋白洗脫液放入透析袋，PBS液作為透析外液，透析脫鹽即得重組蛋白液。2、豬圓環(huán)病毒2型基因工程亞單位疫苗的制備將制備的序列為SEQ ID NO 1的重組蛋白96份與滅菌的4份吐溫-80充分?jǐn)嚢杌旌献鳛樗?。同時(shí)注射用白油94份，加6份的司本80、硬脂酸鋁2份，混合均勻，高壓滅菌后作為油相。按水相和油相1:3比例混合乳化即可制備豬圓環(huán)病毒2型基因工程亞單位疫苗。按獸用生物制品規(guī)程的檢驗(yàn)方法進(jìn)行性狀、無(wú)菌檢驗(yàn)、安全檢驗(yàn)均合格。四、重組蛋白制備的豬圓環(huán)病毒2型基因工程亞單位疫苗的動(dòng)物試驗(yàn)將制備的豬圓環(huán)病毒2型基因工程亞單位疫苗經(jīng) 肌肉接種21日齡PCV2陰性斷奶仔豬5頭，另取5頭作為對(duì)照。接種28日后取血測(cè)PCV2抗體，免疫組PCV2抗體全部為陽(yáng)性，有效率達(dá)到100%，對(duì)照組未檢測(cè)到抗體。結(jié)果顯示制備的重組蛋白免疫原性良好，其進(jìn)一步制備的豬圓環(huán)病毒2型基因工程亞單位疫苗可以引起仔豬的免疫應(yīng)答。并且，由于本發(fā)明的豬圓環(huán)病毒2型基因?yàn)樾碌牡任换?，可以更有效的?duì)仔豬進(jìn)行免疫保護(hù)。
權(quán)利要求
1.一種圓環(huán)病毒2型Cap蛋白，其特征在于，所述的蛋白的氨基酸序列為SEQ ID NOIo
2.一種核苷酸，所述的核苷酸用于編碼權(quán)利要求I所述的圓環(huán)病毒2型Cap蛋白。
3.如權(quán)利要求2所述的核苷酸，其特征在于，所述的核苷酸的序列為SEQID N0:2。
4.權(quán)利要求I所述的圓環(huán)病毒2型Cap蛋白在制備豬圓環(huán)病毒2型基因工程亞單位疫苗中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白基因及其應(yīng)用，蛋白的氨基酸序列為SEQ ID NO1，核苷酸序列為SEQ ID NO2。本發(fā)明的圓環(huán)病毒2型Cap蛋白可用于制備豬圓環(huán)病毒2型基因工程亞單位疫苗。本發(fā)明獲得的豬圓環(huán)病毒2型基因工程亞單位疫苗經(jīng)肌肉接種21日齡PCV2陰性斷奶仔豬5頭，另取5頭作為對(duì)照。接種28日后取血測(cè)PCV2抗體，免疫組PCV2抗體全部為陽(yáng)性，有效率達(dá)到100%，對(duì)照組未檢測(cè)到抗體。結(jié)果顯示制備的重組蛋白免疫原性良好，其進(jìn)一步制備的豬圓環(huán)病毒2型基因工程亞單位疫苗可以引起仔豬的免疫應(yīng)答。
文檔編號(hào)C12N15/34GK102827259SQ20121031577
公開日2012年12月19日 申請(qǐng)日期2012年8月30日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月30日
發(fā)明者王宏華, 于春梅, 凌紅麗, 蔣皓靜, 張園園 申請(qǐng)人:青島康地恩藥業(yè)股份有限公司, 青島寶依特生物制藥有限公司