專利名稱：一種鑒定瓠瓜類型砧木品種真實(shí)性的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物領(lǐng)域，特別涉及甬砧系列瓠瓜類型砧木品種‘甬砧I號(hào)’、‘甬砧3號(hào)’、‘甬站4號(hào)’和‘甬站5號(hào)’真實(shí)性的一種鑒定方法。
背景技術(shù)：
西瓜枯萎病引發(fā)連作障礙，在瓜類種植區(qū)普遍發(fā)生，是瓜類生產(chǎn)的重大難題。據(jù)統(tǒng)計(jì)，每年西瓜枯萎病的發(fā)病率可達(dá)10-30%，嚴(yán)重地塊甚至絕產(chǎn)，造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。目前，由于土地資源限制和枯萎病病原菌的頑固性，輪作和化學(xué)防治效果不佳，且存在環(huán)境污染和食品安全等問(wèn)題，因此，嫁接是西瓜生產(chǎn)中用以克服連作障礙和枯萎病的有效手段。甬砧系列是寧波市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院重點(diǎn)針對(duì)西瓜嫁接栽培，自主育成的一系列瓠瓜類型砧木品種。它主要包括甬砧I號(hào)(早熟栽培西瓜嫁接專用砧木)、甬砧3號(hào)(長(zhǎng)季節(jié) 栽培西瓜嫁接專用砧木)、甬砧4號(hào)(耐溫度逆境西瓜嫁接專用砧木)，和甬砧5號(hào)(小果型西瓜嫁接專用砧木)。該系列抗性強(qiáng)、嫁接性能好、對(duì)西瓜品質(zhì)無(wú)不良影響、產(chǎn)量高，瓜農(nóng)增益明顯。隨著甬砧系列的推廣，鑒別品種真實(shí)性對(duì)維護(hù)生產(chǎn)者和育種者的利益日益重要。然而，目前砧木品種的鑒定多運(yùn)用種子或植株形態(tài)學(xué)鑒定等常規(guī)方法。這些方法耗時(shí)長(zhǎng)、易受環(huán)境影響、可靠性差，面對(duì)品種繁多、外觀表型相似、而遺傳基礎(chǔ)相對(duì)狹窄的砧木材料，鑒定真?zhèn)坞y以奏效。石占木新品種‘甬石占I號(hào)，、‘甬石占3號(hào)，、‘甬石占4號(hào)’和‘甬石占5號(hào)’至今只作了大田形態(tài)學(xué)純度鑒定，尚缺乏便捷有效的品種真實(shí)性鑒定方法，對(duì)于品種保護(hù)還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)上述問(wèn)題，本發(fā)明提供一種利用DNA指紋圖譜鑒定甬砧系列瓠瓜類型砧木品種‘甬站I號(hào)’、‘甬站3號(hào)’、‘甬站4號(hào)’和‘甬站5號(hào)’品種真實(shí)性的方法。為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，發(fā)明者提供以下技術(shù)方案采用CTAB法提取‘甬砧I號(hào)’、‘甬砧3號(hào)’、‘甬砧4號(hào)’和‘甬砧5號(hào)’及其對(duì)照品種的幼葉DNA ;利用4個(gè)RAPD引物和3對(duì)SSR引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增(引物名稱與序列表中序列號(hào)的對(duì)應(yīng)關(guān)系如表I所示，引物具體序列見本說(shuō)明書最后一頁(yè)所附序列表)；擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳分離、溴化乙錠染色后，在紫外透視儀上檢測(cè)多態(tài)性。擴(kuò)增產(chǎn)物的多態(tài)性反映了基因組的多態(tài)性。有差異的等位位點(diǎn)，擴(kuò)增出條帶的記為“1”，同一位置無(wú)帶記為“O” ；將這些差異擴(kuò)增片段轉(zhuǎn)換為由I和O組成的字符串，即構(gòu)成DNA指紋圖譜，用以區(qū)分4份瓠瓜類型砧木品種及其對(duì)照。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)與常規(guī)形態(tài)鑒定比較，本發(fā)明的鑒定結(jié)果準(zhǔn)確可靠、耗時(shí)短、不受環(huán)境影響、操作簡(jiǎn)單，可以同時(shí)鑒定多個(gè)品種，方便快捷。
四

圖I為本發(fā)明實(shí)施例中，RAPD引物s23、s24、sl48、s255 (左)和SSR引物S1001/1002、S1109/1110、S1127/1128(右)在‘甬砧 I 號(hào)’、‘甬砧 3 號(hào)’、‘甬砧 4 號(hào)’、‘甬石占5號(hào)’及其對(duì)照材料‘神通力’和‘京欣砧I號(hào)’中的擴(kuò)增。圖I中左側(cè)四幅圖片自上而下分別是RAro引物s23、s24、sl48、s255在‘甬砧I號(hào)’、‘甬砧3號(hào)’、‘甬站4號(hào)’、‘甬砧5號(hào)’及其對(duì)照材料‘神通力’和‘京欣砧I號(hào)’中的擴(kuò)增;右側(cè)三幅圖片自上而下分別是SSR引物S1001/1002、S1109/1110、S1127/1128在‘甬砧I號(hào)’、‘甬砧3號(hào)’、‘甬砧4號(hào)’、‘甬砧5號(hào)’及其對(duì)照材料‘神通力’和‘京欣砧I號(hào)’中的擴(kuò)增。兩組圖片樣品排列順序自左至右依次為DNA Marker、‘甬砧I號(hào)’、‘甬砧3號(hào)’、‘甬砧4號(hào)’、‘甬砧5號(hào)’、‘神通力’和‘京欣砧I號(hào)’。圖片左側(cè)標(biāo)注是DNA marker標(biāo)準(zhǔn)分子量，右側(cè)標(biāo)注是引物名稱及差異位點(diǎn)所在片段大小。
五具體實(shí)施例方式I、取樣播種‘甬砧I號(hào)’、‘甬砧3號(hào)’、‘甬砧4號(hào)’、‘甬砧5號(hào)’及其對(duì)照，待植株長(zhǎng)至5-6片真葉時(shí)，采集嫩葉lg，_80°C保存。 2、DNA 提取參照 CTAB 法(見Murray HG, Thompson WF. Rapid isolation ofhigher weight DNA. Nucleic Acids Res, 1980,8 :4321),提取新鮮葉片總基因組 DNA。3、PCR 擴(kuò)增RAPD 和 SSR 的混樣體系均為 15 μ I (Fazio G, Staub JE, StevensMR. Genetic mapping and QTL analysis of horticultural traits in cucumber(Cucumissativus L.)using recombinant inbred lines. Theor Appl Genet,2003,107 :864-874),包括 1·5μ1 dNTP(l. 25mM), I. 5ul 10 X buffer, I. 5ul MgCl2 (25mM)，2. Oul 引物(5mM ;SSR兩條引物分別添加 1.0ul)，5ul DNA(10ng/ul),0. 05ul Taq (IU)，3. 45ul 超純水。RAPD 的PCR擴(kuò)增程序?yàn)轭A(yù)變性94°C 4min ;變性93°C 15sec，退火37°C lmin30sec，延伸72°C2min(40個(gè)循環(huán));延伸72 °C 6min。SSR的PCR擴(kuò)增程序?yàn)轭A(yù)變性94°C Imin ;變性93 °Clmin，退火 40°C lmin，延伸 72°C 2min(40 個(gè)循環(huán));延伸 72°C Imin04,PCR產(chǎn)物檢測(cè)RAPD擴(kuò)增產(chǎn)物使用2%普通標(biāo)準(zhǔn)凝膠瓊脂糖(DNA片段分離范圍500-20Kbp)，SSR使用2. 5%高分辨率標(biāo)準(zhǔn)凝膠瓊脂糖(DNA片段分離范圍40_lKbp)。添加20 μ I EB (ethidium bromide,溴化乙淀)顯色。在 PCR產(chǎn)物中加入 2μ I Loading Dye,電泳2-3小時(shí)，電壓200-250V。電泳結(jié)束后，利用凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。5、數(shù)據(jù)收集與分析對(duì)4個(gè)RAPD引物s23、s24、sl48、s255和3對(duì)SSR引物S1001/1002、S1109/1110、S1127/1128 在‘甬砧 I 號(hào)’、‘甬砧 3 號(hào)’、‘甬砧 4 號(hào)’、‘甬砧 5號(hào)’及對(duì)照材料‘神通力’和‘京欣砧I號(hào)’的擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行賦值，某等位基因擴(kuò)增出條帶的記為“1”，同一位點(diǎn)無(wú)擴(kuò)增條帶的記為“O”。將這些差異擴(kuò)增片段轉(zhuǎn)換為由I和O組成的字符串，即構(gòu)成品種指紋圖譜(表I)。利用7個(gè)分子標(biāo)記產(chǎn)生的11個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，構(gòu)建‘甬砧I號(hào)’的指紋圖譜為o-i-i-i-o-o-i-o-i-i-o，‘甬砧3號(hào)’的指紋圖譜為1-0-0-0-0-0-1-1-0-0-0, ‘甬砧 4 號(hào)’的指紋圖譜為 1-1-1-0-1-0-1-0-1-1-0，‘甬砧 5 號(hào)’的指紋圖譜為 0-0-1-1-0-0-1-1-0-0-1，‘神通力’的指紋圖譜為 0-1-1-0-1-0-1-1-0-0-1，
‘京欣砧I號(hào)’的指紋圖譜為0-0-0-0-0-1-0-0-0-1-0。這些指紋圖譜不僅可以有效區(qū)分上述四個(gè)品種，還可以將它們從形態(tài)易混淆的相似品種中甄別出來(lái)，起到品種鑒定與保護(hù)的作用。表I供試瓠瓜類型砧木品種及對(duì)照編號(hào)、名稱和RAPD/SSR指紋圖譜
權(quán)利要求
1.本發(fā)明用以鑒定‘甬砧I號(hào)’、‘甬砧3號(hào)’、‘甬砧4號(hào)’和‘甬砧5號(hào)’所使用的方法。本發(fā)明利用4個(gè)RAro引物(SEQ ID NO. I-SEQ ID NO. 4)和3對(duì)SSR引物(SEQ IDNO. 5-SEQ ID NO. 10)，對(duì)瓠瓜類型砧木品種‘甬砧I號(hào)’、‘甬砧3號(hào)’、‘甬砧4號(hào)’和‘甬砧5號(hào)’及對(duì)照進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)生的11個(gè)差異位點(diǎn)經(jīng)過(guò)“I”和“O”的賦值，構(gòu)建品種DNA指紋圖譜用以真實(shí)性鑒定。發(fā)明者提供的技術(shù)方案與鑒定指標(biāo)模糊、鑒定結(jié)果易受環(huán)境影響的常規(guī)形態(tài)學(xué)鑒定相比，具有鑒定手段靈敏、時(shí)間人工成本低、結(jié)果準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，且對(duì)于批量材料的鑒定更方便。請(qǐng)求對(duì)以下權(quán)利進(jìn)行保護(hù)
2.本發(fā)明用以鑒定‘甬砧I號(hào)’、‘甬砧3號(hào)’、‘甬砧4號(hào)’和‘甬砧5號(hào)’所使用的4個(gè)RAPD 引物和 3 對(duì) SSR 引物的序列，包括 SEQ ID NO. I、SEQ ID NO. 2、SEQ ID NO. 3、SEQ IDNO. 4,SEQ ID NO. 5,SEQ ID NO. 6,SEQ ID NO. 7,SEQ ID NO. 8,SEQ ID NO. 9,SEQ ID NO. 10。
全文摘要
本發(fā)明題為《一種鑒定‘甬砧1號(hào)’、‘甬砧3號(hào)’、‘甬砧4號(hào)’和‘甬砧5號(hào)’品種真實(shí)性的方法》，屬于生物領(lǐng)域。鑒別品種真實(shí)性對(duì)維護(hù)生產(chǎn)者和育種者的利益日益重要。砧木品種繁多外觀相似，利用形態(tài)指標(biāo)甄別真?zhèn)危臅r(shí)長(zhǎng)可靠性差。為此，發(fā)明一種利用分子標(biāo)記鑒定砧木品種真實(shí)性的方法成為當(dāng)務(wù)之急。技術(shù)方案為利用4個(gè)RAPD引物(SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.4)和3對(duì)SSR引物(SEQ ID NO.5-SEQ ID NO.10)，對(duì)四個(gè)品種及對(duì)照進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)生的11個(gè)差異位點(diǎn)經(jīng)過(guò)“1”和“0”賦值，構(gòu)建品種指紋圖譜用以真實(shí)性鑒定。發(fā)明以更靈敏的鑒定手段、更低的時(shí)間人工成本，對(duì)瓠瓜類型砧木品種‘甬砧1號(hào)’、‘甬砧3號(hào)’、‘甬砧4號(hào)’和‘甬砧5號(hào)’進(jìn)行更準(zhǔn)確更有效的鑒定與保護(hù)。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102925551SQ20121031865
公開日2013年2月13日 申請(qǐng)日期2012年8月23日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月23日
發(fā)明者宋慧, 王毓洪, 張香琴, 應(yīng)泉盛, 王迎兒, 嚴(yán)蕾艷 申請(qǐng)人:寧波市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院