專利名稱：柯薩奇病毒a4核酸檢測用引物、探針及試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物檢測技術(shù)，具體地說涉及柯薩奇病毒A4核酸檢測用引物、探針及試劑盒。
背景技術(shù)：
柯薩奇病毒A4 (coxsackievirus A4,簡稱CVA4)為單股正鏈RNA病毒，屬小RNA病毒科(Picoranviridae),根據(jù)其分子遺傳特征，CVA4屬于人類腸道病毒A類(humanenterovirus A,簡稱HEV-A)。CVA4作為人類感染性疾病的一種病原,能引起多種疾病，如手足口病、皰疹性咽峽、類感冒發(fā)熱疾病、心肌心包炎及急性腸道感染性疾病等。近些年爆發(fā)的手足口病的病原學(xué)調(diào)查顯示，除主要病原體人類腸道病毒71 (human enterovirus 7LHEV71)外，還有多種HEV-A參與感染，其中CVA4就是常見的一種。并且，最近韓國爆發(fā)的心肌心包炎、俄羅斯的急性腸道感染性疾病病原學(xué)調(diào)查以及中國的手足口病的病原學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)都與CVA4有關(guān)。CVA 4的感染一年四季均可發(fā)生，其主要通過糞-口途徑在人群中傳播,帶毒的糞便可通過污染的手、餐具、食物經(jīng)口進(jìn)入人體，咳嗽、打噴嚏形成的飛沫可直接或間接進(jìn)行傳播，另外，接觸病人破潰的皰疹液等也受到感染。CVA 4作為一種潛在的威脅，為了更好地應(yīng)對CVA4的感染所引發(fā)的疾病流行，提供一種快速、準(zhǔn)確的檢測技術(shù)顯的尤為重要。本發(fā)明選擇柯薩奇病毒A4的VPl基因設(shè)計(jì)用于熒光RT-PCR檢測的引物及探針序列，建立了柯薩奇病毒A4熒光RT-PCR檢測技術(shù)，反應(yīng)結(jié)束即可根據(jù)擴(kuò)增曲線判定是否感染柯薩奇病毒A4。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供用于柯薩奇病毒A4實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測的引物、探針及試劑盒。本發(fā)明在分析已報(bào)道的柯薩奇病毒A4VP1基因序列基礎(chǔ)上，分別設(shè)計(jì)引物及熒光探針，所述的引物由正向引物和反向引物組成，其核苷酸序列分別如SEQ ID No:l和SEQIDNo: 2 所示。本發(fā)明設(shè)計(jì)的探針的核苷酸序列如SEQ ID No:3所示，該探針一端標(biāo)記有報(bào)告熒光基團(tuán)，另一端標(biāo)記有淬滅熒光基團(tuán)。其中，報(bào)告熒光基團(tuán)可以采用下列熒光基團(tuán)中的任意一種FAM、HEX、TET、J0E、R0X和 CY5，淬滅熒光基團(tuán)可以采用下列熒光基團(tuán)中的任意一種TAMRA、Eclipse、BHQ1、BHQ2 和 BHQ3。根據(jù)TaqMan技術(shù),在常規(guī)PCR的基礎(chǔ)上添加了一條標(biāo)記有兩個(gè)突光基團(tuán)的核苷酸探針，例如將報(bào)告熒光基團(tuán)標(biāo)記在探針的5’端，淬滅熒光基團(tuán)標(biāo)記在探針的3’端，兩者構(gòu)成能量轉(zhuǎn)移結(jié)構(gòu)，即報(bào)告熒光基團(tuán)所發(fā)射的熒光可被淬滅熒光基團(tuán)吸收，當(dāng)二者距離變遠(yuǎn)時(shí)，抑制作用減弱，報(bào)告熒光基團(tuán)信號(hào)增強(qiáng)。在擴(kuò)增反應(yīng)過程中，探針同模板上的目的擴(kuò)增片段雜交，由于Taq酶具有5’端到3’端的外切酶活性，在擴(kuò)增延伸階段將探針切斷，淬滅熒光基團(tuán)的抑制作用消失，報(bào)告熒光基團(tuán)信號(hào)增強(qiáng)，從而實(shí)現(xiàn)對柯薩奇病毒A4核酸的實(shí)時(shí)檢測。本發(fā)明提供的試劑盒，包括上述正向弓丨物和反向引物。優(yōu)選地,試劑盒還包括上述探針。優(yōu)選地，試劑盒還包括實(shí)時(shí)熒光RT-PCR反應(yīng)液，與所述正向引物、反向引物和探針共同構(gòu)成實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測體系，2 5 μ I所述實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測體系的配置為2X0neSt印RT-PCR Buffer 12. 5 μ 1，10 μ M所述正向引物2 μ 1，10 μ M所述反向引物2 μ 1,10 μ M 所述探針 I μ I, 5U/μ I Ex Taq HS O. 5 μ 1,40U/ μ I PrimeScript RT enzymeMix O. 5 μ I, RNA5 μ I, RNase Free dH20 I. 5 μ I。優(yōu)選地，試劑盒的檢測反應(yīng)條件為42°C反轉(zhuǎn)錄25min，95°C變性15s，以95°C 10s，53 °C Imin擴(kuò)增45個(gè)循環(huán)。 當(dāng)然，可以根據(jù)本發(fā)明給出的引物對或者其擴(kuò)增產(chǎn)物序列設(shè)計(jì)其他類型的探針，以適用不同方法的熒光PCR檢測。本發(fā)明根據(jù)柯薩奇病毒A4VP1基因序列設(shè)計(jì)引物及熒光探針，該引物特異性強(qiáng)，用于熒光PCR檢測的靈敏度高。用本發(fā)明引物及探針，通過RT-PCR檢測，能夠快速簡單地判斷樣品是否有柯薩奇病毒A4,而且檢測準(zhǔn)確性高、靈敏度高，因此能夠?yàn)榭滤_奇病毒A4感染的相關(guān)疾病診斷提供科學(xué)依據(jù)。


圖I是實(shí)時(shí)熒光RT-PCR技術(shù)柯薩奇病毒A4核酸檢測的特異性實(shí)驗(yàn)的檢測結(jié)果圖；圖2是本發(fā)明檢測方法的靈敏度實(shí)驗(yàn)的檢測結(jié)果圖。
具體實(shí)施例方式下面實(shí)施例用于對本發(fā)明的進(jìn)一步說明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例I :引物及探針的設(shè)計(jì)和合成比對并分析GenBank中分離自全球的柯薩奇病毒A4的同源VPl基因序列,利用生物軟件01igo7. O分別在其保守位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物和Taqman探針,利用在線的OligoAnalyzer3. I分析其Hairpin, Self-Dimer和Δ G值,并通過NCBI數(shù)據(jù)庫的Blast程序進(jìn)行特異性驗(yàn)證。所設(shè)計(jì)的引物及探針序列為CVA4-F325 (正向引物)5’ -TGGGATATTGACATCATGGCGTT-3，；即 SEQ ID No: ICVA4-R469 (反向引物)5’ -GCACATACATGTATTGGATCACACT-3’ ；即 SEQ IDNo: 2CVA4-P367(探針)5，-FAM-CTTGAGGCATTCACATACATGCG-TAMRA-3，；即 SEQ ID No:3,該探針的5’端標(biāo)記有報(bào)告熒光基團(tuán)FAM，3’端標(biāo)記有淬滅熒光基團(tuán)TAMRA。實(shí)施例2 =RNA的提取以糞便樣品為例在抽提前加O. OlM PBS,PH7. 5，其中，O. 5g糞便樣品(O. 5ml液態(tài)糞便)加5mL PBS，振蕩混勻后將懸液1500 Xg離心20min，取上清液進(jìn)行RNA抽提。病毒樣品RNA的抽提使用High Pure Viral RNA Kit (Roche, Germany),步驟按其操作說明書進(jìn)行，具體的操作步驟如下I)向200 μ I的上清液中加入400 μ I的Binging Buffer,混勻后將混合液轉(zhuǎn)入裝有過濾管的收集管，8000 Xg離心15s ；2)將過濾管置于新的收集管中，向?yàn)V管中加500 μ I Inhibitor Removal Buffer,8000 X g 離心 Imin ；3)將過濾管置于新的收集管中，向?yàn)V管中加450 μ I Wash Buffer，8000X g離心Imin ；4)將過濾管置于新的收集管中，再一次向?yàn)V管中加450 μ I Wash Buffer, 8000X g離心Imin ；5)將過濾管置于新的收集管中，9300 Xg離心15s ；·
6)將過濾管置于新的離心管中，向離心管中加入50μ I的Elution Buffer,8000 X g離心Imin從而得到純凈的病毒RNA，提取的RNA于_80°C保存。實(shí)施例3 :Real-timeRT-PCR擴(kuò)增方法的建立I、實(shí)時(shí)熒光RT-PCR反應(yīng)體系以RNA為摸板，進(jìn)行實(shí)時(shí)RT-PCR反應(yīng)(反應(yīng)用試劑購自TaKaRa)。熒光定量RT-PCR反應(yīng)體系如下表
_m>_25μ1體積終濃度
2><One Step RT-PCR Buffer12,5μ1
Η向弓I物和反財(cái)I物(IO μΜ)各2μ1各0.8μΜ
探針(10μΜ>Ιμ 0.4 μΜ
Ex Taq HS(5 U/μΙ)0.5μ12.5U
PrimeScript RT enzyme Mix(40U/pl)0.5μ120 U
RNA5μΙ
RNase Free dHaO1.5μ12、實(shí)時(shí)熒光RT-PCR反應(yīng)條件將樣品管放入ABI公司7500突光PCR儀后，設(shè)置如下條件進(jìn)行反應(yīng)42°C反轉(zhuǎn)錄25min，95°C變性15s (因不同廠家的Tap酶而不同)，以95°C 10s，53。。Imin (收集熒光信號(hào)FAM)擴(kuò)增45個(gè)循環(huán)。每個(gè)循環(huán)結(jié)束采集數(shù)據(jù)。反應(yīng)結(jié)束后根據(jù)擴(kuò)增曲線判定結(jié)果。實(shí)施例4 :柯薩奇病毒A4核酸Real-time RT-PCR方法的特異性確定選取3株已確定型別的CVA4毒株和9株其他腸道病毒血清型(HEV71、coxsackievirusA16> coxsackievirus A6、 coxsackievirus A10、 coxsackievirus A8、coxsackievirus A5> coxsackievirus A2> coxsackievirus BI 和 coxsackievirus B3),利用建立起的熒光RT-PCR反應(yīng)體系對這13株毒株進(jìn)行檢測，檢測結(jié)果如圖I所示，3株CVA4 病毒(編號(hào)為 CVA4-JB141110102，CVA4-JB141110149 和 CVA4-JB141230059)出現(xiàn)相應(yīng)的特異性熒光擴(kuò)增曲線，呈陽性反應(yīng)，而其他9株人類腸道病毒則均沒有熒光信號(hào)產(chǎn)生，在圖I中顯示為一平直的線，判為陰性。結(jié)果表明，所設(shè)計(jì)的引物探針只對目的病毒(即，CVA4)特異，與其它檢測對象無交叉反應(yīng)。試驗(yàn)結(jié)果以柯薩奇病毒A4的RNA為模板，通過實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測可觀察到明顯的熒光強(qiáng)度變化，而其他病毒的熒光強(qiáng)度沒有變化。實(shí)施例5 :靈敏度實(shí)驗(yàn)
將柯薩奇病毒A4體外轉(zhuǎn)錄RNA用DEPC處理的水分別稀釋，進(jìn)行相對靈敏度檢測，在25 μ I反應(yīng)體系中，1 應(yīng)分別被稀釋成5.0\104、5.0\103、5.0\102、5.0\101拷貝數(shù)，檢測結(jié)果如圖2所示，可以看出，檢測限度低至為50個(gè)模板拷貝數(shù)。
權(quán)利要求
1.一種柯薩奇病毒A4核酸檢測用引物，由正向引物和反向引物組成，其核苷酸序列分別如 SEQ ID No: I 和 SEQ ID No:2 所示。
2.一種與權(quán)利要求I所述引物配合使用的探針，其核苷酸序列如SEQ ID No:3所示，該探針一端標(biāo)記有報(bào)告熒光基團(tuán)，另一端標(biāo)記有淬滅熒光基團(tuán)。
3.如權(quán)利要求2所述的探針，其特征在于該探針5’端標(biāo)記有FAM熒光基團(tuán)，3’端標(biāo)記有TAMRA熒光基團(tuán)。
4.含有權(quán)利要求I所述正向引物和反向引物的試劑盒。
5.如權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于還包括權(quán)利要求2或3所述的探針。
6.如權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于，還包括實(shí)時(shí)熒光RT-PCR反應(yīng)液，與所述正向引物、反向引物和探針共同構(gòu)成實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測體系，25 所述實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測體系的配置為2 X One Step RT-PCR Buffer 12. 5 yl，10 y M所述正向引物 l，10iiM 所述反向引物 l，10iiM 所述探針 Iii l，5U/ii I Ex Taq HS 0. 5 U 1,40U/U IPrimeScript RT enzyme Mix 0. 5 u I, RNA 5 u I, RNase Free dH20 L I。
7.如權(quán)利要求6所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒的檢測反應(yīng)條件為42°C反轉(zhuǎn)錄 25min，95°C變性 15s，以 95°C 10s，53°C Imin 擴(kuò)增 45 個(gè)循環(huán)。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種柯薩奇病毒A4核酸檢測用引物、探針及試劑盒，所述引物包括正向引物和反向引物，其核苷酸序列分別如SEQ ID No:1和SEQ ID No:2所示，所述探針的核苷酸序列如SEQ ID No:3所示。所述試劑盒包括所述正向引物和反向引物。本發(fā)明所設(shè)計(jì)的引物特異性好，靈敏度高，用本發(fā)明引物及探針，通過RT-PCR檢測，能夠快速簡單地判斷樣品是否有柯薩奇病毒A4，而且檢測準(zhǔn)確性高、靈敏度高。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102816869SQ201210319288
公開日2012年12月12日 申請日期2012年8月31日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月31日
發(fā)明者何雅青, 陳龍 申請人:何雅青, 陳龍