專利名稱：一種高效雞基因工程雞干擾素α的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種高效雞基因工程雞干擾素α的制備方法，屬于疾病免疫領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
干擾素(Interferon，IFN)是在外源物質(zhì)(如病原微生物)和腫瘤細(xì)胞的作用下，由特定細(xì)胞(B細(xì)胞、成纖維細(xì)胞或上皮細(xì)胞)基因控制所分泌的一種糖蛋白。最先是由英國病毒學(xué)家Isaacs和瑞士研究人員Linden_mann于1957年在利用雞胚絨毛尿囊膜研究流感病毒的干擾現(xiàn)象時發(fā)現(xiàn)的。1963年Lampson等純化了這種因子，并證明該因子是一種蛋白質(zhì)，其分子量為20-34kd (雞干擾素研究進(jìn)展，家禽科學(xué)，2010，(5):46-48)。對干擾素基因序列研究結(jié)果表明，該序列早在5-10億年前就存在于生命細(xì)胞的基因序列中，是生物體內(nèi)一種古老的保護(hù)因子。近半個世紀(jì)，干擾素一直是病毒學(xué)、細(xì)胞學(xué)、分子生物學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)、免疫學(xué)、腫瘤學(xué)等相關(guān)領(lǐng)域的研究熱點，但主要是針對人類及哺乳動物干擾素作用機理及 臨床實驗的研究。國際細(xì)胞因子命名委員會根據(jù)干擾素結(jié)合受體類型和在染色體上的位置不同，將干擾素分為I型、II型和III型干擾素。其中I型干擾素主要具有抗病毒和抗腫瘤等作用，按其與抗體結(jié)合的抗原性不同可分為α、β、τ、ω等。其中IFN-α主要由感染病毒B細(xì)胞產(chǎn)生，又可分為13種以上亞型，如IFNa-I、IFNa-2、IFNa-3。亞型又可分為不同的亞亞型，如 IFNa -la、IFNa -lb、IFNa -lc、IFNa-Id 以及 IFNa -2a、IFNa -2b、IFNa -2c 等。IFN-β主要由成纖維細(xì)胞和上皮細(xì)胞產(chǎn)生，部分來源于巨噬細(xì)胞。I型干擾素具有耐酸性，在ρΗ2. (Γ10. O的條件下很穩(wěn)定。II型干擾素又被成為免疫干擾素，只包括IFN-Y，主要由T淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞產(chǎn)生，具有免疫調(diào)節(jié)作用，但也有一定的抗病毒活性，但不如I型干擾素強。II型干擾素既不耐酸，也不耐熱，在ΡΗ2. O時不穩(wěn)定，在56°C下30min會被破壞。III型干擾素，目前已知的主要包括 IFNA (IL-29)、IFNA2 (IL-28A)和 IFNλ 3 (IL-28B)。III型干擾素刺激不同的細(xì)胞系后導(dǎo)致的轉(zhuǎn)錄應(yīng)答均與I型和II型干擾素相似。I型干擾素的產(chǎn)生是天然免疫應(yīng)答的重要組成部分，是機體抵御外來病原感染的第一道防線。病毒感染后幾個小時內(nèi)，IFN就會出現(xiàn)自分泌和旁分泌效應(yīng)，從而來抵抗外來病原的感染。I型干擾素可以抑制病毒蛋白和DNA的合成，活化NK細(xì)胞，促進(jìn)MHC I類分子的抗原遞呈。干擾素的抗病毒活性主要通過PKR途徑、2 ’ -5 ’寡核苷酸合成酶途徑、Mx途徑和ADARl途徑等來發(fā)揮作用，以感染病毒的細(xì)胞為靶向，作用于病毒侵染的每個階段，包括侵入、轉(zhuǎn)錄、RNA的合成、翻譯起始、成熟、組裝和釋放，而不是直接作用于病毒本身。禽類IFN具有以下幾種作用(I)抗病毒作用IFN并不直接作用于病毒，而是通過誘導(dǎo)正常細(xì)胞產(chǎn)生抗病毒蛋白(Antiviral protein, AVP)間接地達(dá)到抗病毒的效果,是非特異的,但具有種屬特異性。家禽IFN I、II型均具有廣譜抗病毒作用，I型IFN的抗病毒作用最強。首先，IFN與周圍細(xì)胞膜上的受體結(jié)合，起著第一信使的作用，活化細(xì)胞膜腺苷酸環(huán)化酶，促使cAMP形成；然后cAMP作為第二信使，激活細(xì)胞內(nèi)抗病毒作用機制，產(chǎn)生AVP。AVP主要有3種蛋白激酶、磷酸二酯酶和2 - 5A合成酶。前2種能破壞細(xì)胞核糖體轉(zhuǎn)譯病毒蛋白質(zhì)，后一種酶能降解mRNA，有的能抑制轉(zhuǎn)錄酶，阻止mRNA的形成，還有的能抑制病毒DNA和RNA的合成。因此，可以說IFN是通過AVP間接地抑制病毒復(fù)制而達(dá)到抗病毒作用的。(2)抗腫瘤作用IFN I、II型都具有抗腫瘤作用，但I(xiàn)FN II型效果更為顯著。干擾素抗腫瘤機制有以下幾種方式①有些腫瘤的發(fā)生與病毒有關(guān)，IFN通過抑制了病毒的增殖而抑制腫瘤的發(fā)生與成長。②IFN作用于細(xì)胞膜，刺激腺苷酸環(huán)化酶，使cAMP增加，抑制了 DNA的合成及細(xì)胞分裂。③IFN能改變腫瘤細(xì)胞表面的性能，誘發(fā)新的抗原，從而易被免疫監(jiān)視細(xì)胞識別并加以排斥。④通過免疫調(diào)節(jié)，增強機體抗腫瘤能力，主要是增強巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞和細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的殺傷性。1999年，Plachy等進(jìn)行了雞重組IFN防治RSV腫瘤的研究，結(jié)果表明高劑量的重組IFN不僅可以抑制腫瘤，還可以使一些雞的RSV肉瘤完全消失(雞干擾素研究進(jìn)展，家禽科學(xué)，2010，(5) :46-48)。臨床上可用于治療雞馬立克氏疾病、雞白血病、網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增殖病、火雞淋巴細(xì)胞增殖病等。(3)抗寄生蟲作用經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，在宿主對寄生蟲感染的免疫應(yīng)答過程中，干擾素發(fā)揮著重要的免疫調(diào)節(jié)作用。其作用主要通過3種途徑①通過激活巨噬細(xì)胞，增強呼吸頻 率，釋放氧自由基，通過氧自由基攻擊脂質(zhì)膜，使寄生蟲體被破壞，從而達(dá)到殺蟲目的。②通過L 一精氨酸途徑發(fā)揮作用，由活化的巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的NO，從而抑制靶細(xì)胞的DNA合成和線粒體的呼吸作用，導(dǎo)致靶細(xì)胞代謝功能障礙。③干擾素可以誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞和巨噬細(xì)胞合成產(chǎn)生吲哚胺_2，3-雙氧酶，使色氨酸大量分解，導(dǎo)致蟲體色氨酸缺乏，從而抑制蟲體在宿主體內(nèi)的繁殖。禽類干擾素在抗寄生蟲的作用方面，不同類型干擾素作用的途徑是不相同的，I型干擾素主要是通過第3種途徑而發(fā)生作用，其中IFN-β抗弓形體的機制則更為復(fù)雜；II型干擾素主要是通過以上3種途徑發(fā)揮作用。雞INF-Y可激活感染艾美耳球蟲的動物的巨噬細(xì)胞，活化MHC II類分子，提高淋巴細(xì)胞水平，減少卵囊排出量，從而提高雞體重及對球蟲感染的抵抗力。(4)免疫調(diào)節(jié)作用IFN可增加IgG的Fe受體表達(dá)，從而有利于巨噬細(xì)胞對抗原的吞嗤，K細(xì)胞、NK細(xì)胞對靶細(xì)胞的殺傷以及T、B淋巴細(xì)胞的激活，增強機體免疫應(yīng)答能力。
I型IFN可增加MHC II類分子的表達(dá)，從而增強細(xì)胞毒性T細(xì)胞對這類靶細(xì)胞的殺傷效應(yīng)，同時增加NK細(xì)胞裂解潛能，使機體有效地發(fā)揮抗病毒感染和抗腫瘤免疫。禽類IFN- Y可增加細(xì)胞表面MHC II類分子的表達(dá)，調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞、B細(xì)胞之間的關(guān)系，增強免疫應(yīng)答能力。(5)免疫佐劑作用細(xì)胞因子作為佐劑始于20世紀(jì)80年代初。許多實驗證明，禽類IFN具有較強的佐劑活性并且對降低副作用也有一定功效。早在1991年，A. ff. Heath等就發(fā)現(xiàn)，重組IFN與疫苗混合免疫可以明顯提高疫苗對供試小鼠的免疫保護(hù)效果，而單純使用IFN-Y對病原菌無效。目前，IFN-Y已成為一種常規(guī)選用的免疫佐劑。研究還發(fā)現(xiàn)，IFN必須與抗原置于同一位置才能發(fā)揮效應(yīng)。徐守振等將雞柔嫩艾美耳球蟲3-1E抗原基因與雞IFN-Y基因進(jìn)行融合，構(gòu)建真核雙價融合表達(dá)質(zhì)粒，對肉雞進(jìn)行免疫，具有增強免疫保護(hù)作用，可顯著降低糞便中的卵囊排出量。隨著近年來全球畜禽養(yǎng)殖業(yè)的迅猛發(fā)展，我國養(yǎng)禽類已由農(nóng)村家庭副業(yè)發(fā)展成了社會一大產(chǎn)業(yè)，無論是禽類的品種還是數(shù)量都位于世界前列。然而，養(yǎng)禽業(yè)還存在很多問題，禽流感、傳染性法氏囊病、傳染性支氣管炎、馬立克氏病、新城疫等疾病，每年都會在不同的季節(jié)暴發(fā)，造成巨大的經(jīng)濟損失。目前禽類傳染性疾病的防治主要采用疫苗免疫和藥物治療，由于疫苗免疫的血清型單一，而病毒的血清型復(fù)雜，毒株變異快，常導(dǎo)致疫苗免疫失敗。一些病毒病目前常無疫苗可用，有些病毒也可能直接危害到人類的健康。藥物治療主要采用抗生素進(jìn)行治療，但是近年來由于抗生素的廣泛和大量使用，導(dǎo)致一些抗藥型細(xì)菌的產(chǎn)生，并通過食物鏈傳染給人，給人類健康帶來更大的威脅?，F(xiàn)在一些國家己明令禁止一些抗生素和抗菌劑在養(yǎng)殖業(yè)中的應(yīng)用。因此，人們迫切需要開發(fā)一種新的方法來控制畜禽疾病。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種高效雞基因工程雞干擾素α的制備方法。為了實現(xiàn)以上目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是提供一種高效雞基因工程雞干擾素α的制備方法，具體步驟如下I)重組表達(dá)工程菌 Ε. coli BL21 (DE3) /pET22b (+) /ChIFN α 種子制備； 將重組表達(dá)工程菌Ε. coli BL21 (DE3) /pET22b (+) /ChIFN α按1%的比例接種菌液于含Amp的LB液體培養(yǎng)基中,振蕩培養(yǎng)；將培養(yǎng)液接種至含Amp的LB平板,劃線培養(yǎng),挑取單菌LB中搖瓶培養(yǎng)，當(dāng)OD600nm = O. 5，按250ul/750ul的比例加入50%的甘油，保存；2)工程菌 E. coli BL21 (DE3) /pET22b (+) /ChIFN α 發(fā)酵種子液制備將保存的工程菌Ε. coli BL21 (DE3) /pET22b (+) /ChIFN α 種子按 O. 05-0. 1% 體積的量接種于2 X YT培養(yǎng)液中培養(yǎng)，作為發(fā)酵罐用種子液；3)工程菌 Ε. coli BL21 (DE3) /pET22b (+) /ChIFN α 發(fā)酵生產(chǎn)菌體培養(yǎng)階段發(fā)酵培養(yǎng)基高溫滅菌后，每升培養(yǎng)基加入IOOmg的Amp，按5_10%體積的量接入種子液，通氣攪拌培養(yǎng)，培養(yǎng)過程調(diào)節(jié)PH7. 2 ；碳源飼喂階段碳源耗完，流加補料培養(yǎng)基，溶氧量維持在30 %，培養(yǎng)過程調(diào)節(jié)ρΗ7· 2 ；誘導(dǎo)表達(dá)階段繼續(xù)連續(xù)流加補料培養(yǎng)基；加入IPTG，在IPTG終濃度O. 5mM條件下誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白，培養(yǎng)過程中調(diào)節(jié)PH7. 2，溶氧量維持在30 %，誘導(dǎo)4h停罐；4)重組雞α干擾素的純化取上述發(fā)酵液，5000rpm離心IOmin收集菌體，經(jīng)PBS緩沖液洗滌后PBS緩沖液重懸，超聲30min，IOOOOrpm, 4°C，離心IOmin收集沉淀，PBS緩沖液洗滌沉淀，然后用變性緩沖液溶解沉淀，IOOOOrpm, 4°C，離心lOmin，收集上清液，將上清液緩慢加入復(fù)性緩沖液中，4°C靜置48h，IOOOOrpm, 4°C，離心20min，收集上清液，即得到含有高效雞基因工程雞干擾素α的溶液。所述步驟I)中含Amp的LB培養(yǎng)基中Amp的量為100 μ g/ml。所述步驟I)中的振蕩培養(yǎng)條件為30°C，200rpm，培養(yǎng)8_10h。所述步驟I)中的保存條件為-20°C。所述步驟2)中2XYT培養(yǎng)液的組成為蛋白胨10. 0g、酵母膏5. 0g、葡萄糖I. 0g、恥(15.(^、瓊脂20.(^、蒸餾水 1000ml、pH 7. 0o所述步驟2)中2XYT培養(yǎng)液中培養(yǎng)條件為30°C，200rpm，培養(yǎng)5_12h。所述步驟3)中通氣攪拌培養(yǎng)條件為37°C，培養(yǎng)8-10h。
所述步驟3 )中發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為蛋白胨5g/L、酵母粉5g/L、KH2P042g/L、K2HP044g/L、Na2HPO4 · 12H20 7g/L、(NH4)2SO4 I. 2g/L、NH4Cl 0. 2g/L、MnSO4 · 5H20 0. 001g/UCoCl2 · 6H20 0. 004g/L、Na2MoO4 · 2H20 0. 002g/L、ZnCl2 0. 002g/L、CuSO4 · 5H20 0. 001g/UH3BO4 0. 005g/L、FeSO4 · 7H20 0. 02gL、CaCl · 2H20 0. 02g/L、MgSO4 · 7H20 0. 3g/L、消泡劑0.2g/L。所述步驟3)中補料培養(yǎng)基的組成為胰蛋白胨30g/L、酵母粉15g/L、MgSO4. 7H203g/L、NaCl 5g/L、甘油 150ml/L、ρΗ7· 2。所述步驟3)中流加補料培養(yǎng)基的速度由溶氧量控制，設(shè)定溶氧量30%，當(dāng)溶氧量大于30%流加泵打開流加補料培養(yǎng)基，溶氧量逐步下降，當(dāng)溶氧量下降到30%以下流加泵關(guān)閉。本發(fā)明的方法制備的雞基因工程雞干擾素α具有廣譜抗病毒性， 功能作用主要是通過與細(xì)胞表面的IFN受體結(jié)合，激發(fā)細(xì)胞合成新的mRNA，產(chǎn)生多種效應(yīng)蛋白，激活蛋白質(zhì)激酶(PKI)與病毒因子(eLF-2)結(jié)合，使其磷酸化，從而抑制病毒復(fù)制。同時可以調(diào)節(jié)B、T淋巴細(xì)胞的功能，激活機體免疫系統(tǒng)，提高機體免疫力，并可強化疫苗免疫效果，減少應(yīng)激反應(yīng)等生物學(xué)功能。
具體實施例方式材料I、工程菌 E. coli BL21 (DE3)/pET22b (+)/ChIFNα 購自中國獸藥監(jiān)察所。2、細(xì)胞系、病毒株雞成纖維細(xì)胞(DF-I )，水泡性口炎病毒(VSV)。3、LB 培養(yǎng)基胰蛋白胨10g/L、酵母提取物 5g/L、NaCl 10g/L、pH7.0。4、2 X YT 培養(yǎng)液蛋白胨10. 0g、酵母膏 5. 0g、葡萄糖 I. 0g、NaCl 5. O、瓊脂 20. 0g、蒸懼水 1000ml、pH 7. O。5、發(fā)酵培養(yǎng)基蛋白胨5g/L、酵母粉 5g/L、KH2P042g/L、K2HP044g/L、Na2HPO4 · 12H20 7g/L、(NH4)2SO4I. 2g/L、NH4Cl 0. 2g/L、MnSO4 · 5H20 0. 001g/L、CoCl2 · 6H20 0. 004g/L、Na2MoO4 · 2H20 0. 002g/L、ZnCl2 0. 002g/L、CuSO4 · 5H20 0. 001g/L、H3BO4 0. 005g/L、FeSO4 · 7H20 0. 02g/L、CaCl · 2H20 0. 02g/L、MgS04 · 7H20 0. 3g/L、消泡劑 0. 2g/L。6、補料培養(yǎng)基胰蛋白胨30g/L、酵母粉 15g/L、MgSO4 · 7H20 3g/L、NaCl 5g/L、甘油 150ml/L、pH7. 2。7、PBS 緩沖液NaCl 137mmol/L、KCl 2. 7mmol/L、Na2HP044. 3mmol/L、KH2PO4L 4mmol/L、pH 8. 0。8、變性緩沖液6mol/L 鹽酸狐，2mmo1 /L 乙二胺四乙酸(EDTA), SOmmoI /L Tris * Cl, IOmmol/L 二硫蘇糖醇(DTT)，pH 8.5。
9、復(fù)性緩沖液O. 5mol/L 精氛酸,2mmol/L EDTA, 20% 甘油,0. 9mmol/L 氧化型谷胱;甘妝,0. ImoI/LTris · Cl, pH 8. O。實施例I本實施例提供的高效雞基因工程雞干擾素α的制備方法，具體步驟如下I、重組表達(dá)工程菌 Ε. coli BL21 (DE3) /pET22b (+) /ChIFN α 種子制備將重組表達(dá)工程菌Ε. coli BL21 (DE3) /pET22b (+) /ChIFN α按1%的比例接種菌液于20mlAmp的量為100 μ g/ml的LB液體培養(yǎng)基中，30°C，200r mp振蕩培養(yǎng)8h ;將培養(yǎng)液接種至Amp的量為100 μ g/ml的LB平板，劃線培養(yǎng)，挑取10個單菌LB中搖瓶培養(yǎng)，當(dāng)OD6tltol=O. 5，按250ul/750ul的比例加入50%的甘油，保種數(shù)十支，_20°C保存?zhèn)溆谩?、工程菌 E. coli BL21 (DE3) /pET22b (+) /ChIFN α 發(fā)酵種子液制備將_20°C保存的工程菌Ε. coli BL21 (DE3)/pET22b (+) /ChIFNa 種子按 O. 05%體積的量接種于200ml 2 X YT培養(yǎng)液中30°C，200rpm培養(yǎng)12h，作為發(fā)酵罐用種子液。3、工程菌 E. coli BL21 (DE3) /pET22b (+) /ChIFN α 發(fā)酵生產(chǎn)菌體培養(yǎng)階段發(fā)酵培養(yǎng)基高溫滅菌后,每升培養(yǎng)基加入100mg/ml的Amp Iml,按10%體積的量接入種子液，37°C通氣攪拌培養(yǎng)10h，培養(yǎng)過程中用3M NaOH和10%磷酸調(diào)節(jié)ρΗ7· 2 ；碳源飼喂階段碳源耗完，流加補料培養(yǎng)基，流加速度由溶氧量控制；設(shè)定溶氧量30%,當(dāng)溶氧量大于30%流加泵打開流加培養(yǎng)基，溶氧量逐步下降，當(dāng)溶氧量下降到30%以下流加泵關(guān)閉，培養(yǎng)過程中用3Μ NaOH和10%磷酸調(diào)節(jié)ρΗ7. 2，溶氧量維持在30% ；誘導(dǎo)表達(dá)階段繼續(xù)連續(xù)流加補料培養(yǎng)基；加入IPTG，在IPTG終濃度0. 5mM條件下誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白，培養(yǎng)過程中用3M NaOH和10%磷酸調(diào)節(jié)pH7. 2。溶氧量維持在30%，誘導(dǎo)4h停罐。4、重組雞干擾素α的純化取5L上述發(fā)酵液，5000rpm離心IOmin收集菌體，經(jīng)PBS緩沖液洗滌后PBS緩沖液重懸，超聲30min使菌體破壁，超聲破碎條件為Φ10探頭，超聲7s間隔5s ；IOOOOrpm, 4°C,離心IOmin收集沉淀，PBS緩沖液洗滌沉淀，然后用變性緩沖液溶解沉淀，lOOOOrpm，4°C，離心lOmin，收集上清液，然后將上清液緩慢加入復(fù)性緩沖液中，4°C靜置48h，lOOOOrpm, 4°C,離心20min，收集上清液，即得到含有高效雞基因工程雞干擾素α的溶液。實施例2本實施例提供的高效雞基因工程雞干擾素α的制備方法，具體步驟如下I、重組表達(dá)工程菌 Ε. coli BL21 (DE3) /pET22b (+) /ChIFN α 種子制備將重組表達(dá)工程菌Ε. coli BL21 (DE3) /pET22b (+) /ChIFN α按1%的比例接種菌液于20mlAmp的量為100 μ g/ml的LB液體培養(yǎng)基中，30°C，200rmp振蕩培養(yǎng)IOh ;將培養(yǎng)液接種至Amp的量為100 μ g/ml的LB平板，劃線培養(yǎng)，挑取8個單菌LB中搖瓶培養(yǎng)，當(dāng)OD6tltol=0. 5，按250ul/750ul的比例加入50%的甘油，保種數(shù)十支，_20°C保存?zhèn)溆谩?、工程菌 E. coli BL21 (DE3) /pET22b (+) /ChIFN α 發(fā)酵種子液制備將_20°C保存的工程菌 E. coli BL21 (DE3) /pET22b (+) /ChIFN α 種子按 0. 1% 體積的量接種于200ml 2 X YT培養(yǎng)液中30°C，200rpm培養(yǎng)5h，作為發(fā)酵罐用種子液。
3、工程菌 E. coli BL21 (DE3) /pET22b (+) /ChIFN α 發(fā)酵生產(chǎn)菌體培養(yǎng)階段發(fā)酵培養(yǎng)基高溫滅菌后,每升培養(yǎng)基加入100mg/ml的Amp Iml,按5%體積的量接入種子液，37°C通氣攪拌培養(yǎng)8h，培養(yǎng)過程中用25%氨水和10%磷酸調(diào)節(jié)ρΗ7· 2 ；碳源飼喂階段碳源耗完，流加補料培養(yǎng)基，流加速度由溶氧量控制；設(shè)定溶氧量30%,當(dāng)溶氧量大于30%流加泵打開流加培養(yǎng)基，溶氧量逐步下降，當(dāng)溶氧量下降到30%以下流加泵關(guān)閉，培養(yǎng)過程中用25%氨水和10%磷酸調(diào)節(jié)ρΗ7. 2，溶氧量維持在30% ；誘導(dǎo)表達(dá)階段繼續(xù)連續(xù)流加補料培養(yǎng)基。加入IPTG，在IPTG終濃度O. 5mM條件下誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白，培養(yǎng)過程中用25%氨水和10%磷酸調(diào)節(jié)pH7. 2。溶氧量維持在30%，誘導(dǎo)4h停罐。4、重組雞干擾素α的純化
取5L上述發(fā)酵液，5000rpm離心IOmin收集菌體，經(jīng)PBS緩沖液洗滌后PBS緩沖液重懸，超聲30min使菌體破壁，超聲破碎條件為Φ10探頭，超聲7s間隔5s ；lOOOOrpm, 4°C,離心IOmin收集沉淀，PBS緩沖液洗滌沉淀，然后用變性緩沖液溶解沉淀，lOOOOrpm，4°C，離心lOmin，收集上清液，然后將上清液緩慢加入復(fù)性緩沖液中，4°C靜置48h，lOOOOrpm, 4°C,離心20min，收集上清液，即得到含有高效雞基因工程雞干擾素α的溶液。實施例3本實施例提供的高效雞基因工程雞干擾素α的制備方法，具體步驟如下I、重組表達(dá)工程菌 Ε. coli BL21 (DE3) /pET22b (+) /ChIFN α 種子制備將重組表達(dá)工程菌Ε. coli BL21 (DE3) /pET22b (+) /ChIFN α按1%的比例接種菌液于20mlAmp的量為100 μ g/ml的LB液體培養(yǎng)基中，30°C，200rmp振蕩培養(yǎng)9h ;將培養(yǎng)液接種至Amp的量為100 μ g/ml的LB平板，劃線培養(yǎng)，挑取5個單菌LB中搖瓶培養(yǎng)，當(dāng)OD6tltol=0. 5，按250ul/750ul的比例加入50%的甘油，保種數(shù)十支，_20°C保存?zhèn)溆谩?、工程菌 E. coli BL21 (DE3) /pET22b (+) /ChIFN α 發(fā)酵種子液制備將_20°C保存的工程菌Ε. coli BL21 (DE3)/pET22b (+) /ChIFNa 種子按 0. 08%體積的量接種于200ml 2 X YT培養(yǎng)液中30°C，200rpm培養(yǎng)10h，作為發(fā)酵罐用種子液。3、工程菌 E. coli BL21 (DE3) /pET22b (+) /ChIFN α 發(fā)酵生產(chǎn)菌體培養(yǎng)階段發(fā)酵培養(yǎng)基高溫滅菌后，每升培養(yǎng)基加入100mg/ml的Amp Iml,按8%體積的量接入種子液，37°C通氣攪拌培養(yǎng)9h，培養(yǎng)過程中用3M NaOH和10%磷酸調(diào)節(jié)ρΗ7· 2 ；碳源飼喂階段碳源耗完，流加補料培養(yǎng)基，流加速度由溶氧量控制；設(shè)定溶氧量30%,當(dāng)溶氧量大于30%流加泵打開流加培養(yǎng)基，溶氧量逐步下降，當(dāng)溶氧量下降到30%以下流加泵關(guān)閉，培養(yǎng)過程中用3Μ NaOH和10%磷酸調(diào)節(jié)ρΗ7. 2，溶氧量維持在30% ；誘導(dǎo)表達(dá)階段繼續(xù)連續(xù)流加補料培養(yǎng)基。加入IPTG，在IPTG終濃度0. 5mM條件下誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白，培養(yǎng)過程中用3M NaOH和10%磷酸調(diào)節(jié)pH7. 2。溶氧量維持在30%，誘導(dǎo)4h停罐。4、重組雞干擾素α的純化取5L上述發(fā)酵液，5000rpm離心IOmin收集菌體，經(jīng)PBS緩沖液洗滌后PBS緩沖液重懸，超聲30min使菌體破壁，超聲破碎條件為Φ10探頭，超聲7s間隔5s ；lOOOOrpm, 4°C,離心IOmin收集沉淀，PBS緩沖液洗滌沉淀，然后用變性緩沖液溶解沉淀，lOOOOrpm，4°C，離心lOmin，收集上清液，然后將上清液緩慢加入復(fù)性緩沖液中，4°C靜置48h，lOOOOrpm, 4°C,離心20min，收集上清液，即得到含有高效雞基因工程雞干擾素α的溶液。雞干擾素α的生物學(xué)活性測定如下生物學(xué)活性測定參照2005年《中華人民共和國藥典》三部附錄X C細(xì)胞活性抑制法，用 MDBK 細(xì)胞一水泡性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus, VSV) (ATCCNumber :VR-1238AF)系統(tǒng)，采用CPE (致細(xì)胞病變效應(yīng))抑制為基礎(chǔ)的抑制微量測定法，以每毫升干擾素檢品的最高稀釋度仍能保護(hù)半數(shù)細(xì)胞(50%)免受病毒攻擊的稀釋度的倒數(shù)為干擾素單位。檢測重組干擾素的抗病毒活性，所用細(xì)胞系是MDBK細(xì)胞，病毒用VSV。測定方法用以細(xì)胞病變(CPE)抑制為基礎(chǔ)的抑制微量測定法。用含有10%FBS的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基將細(xì)胞接種于96孔板中，于5%C02，37°C培養(yǎng)至單層。將干擾素樣品預(yù)稀釋1000倍，再按 培養(yǎng)基稀釋的103TCID5(l/ml病毒液，同時設(shè)置不加干擾素的病毒對照組和不加干擾素及病毒的細(xì)胞對照組。待病毒對照組出現(xiàn)90%以上細(xì)胞病變時，進(jìn)行結(jié)晶紫染色，用酶標(biāo)儀(Tekan, Grodig, Austria)在570nm波長讀值。結(jié)果根據(jù)Reed-Muench法計算。結(jié)果表明，重組雞干擾素α的抗病毒活性約為1.5X108U/mg。雞干擾素α的保存期試驗如下物理性狀觀察本發(fā)明制備的雞基因工程雞干擾素α在25°C和相對濕度60%土 10%條件下放置6個月和2 8°C放置24個月后，每次抽樣檢測外觀、澄明度和pH值均無變化。無菌檢查本發(fā)明方法制備的雞基因工程雞干擾素α在25°C和相對濕度60%土 10%條件下放置6個月和2 8°C放置24個月后，每次抽樣檢測無細(xì)菌污染。生物活性測定由表I實驗可知雞干擾素α注射液成品在2 8°C存放24個月，25°C存放3個月，生物活性無明顯變化。雞干擾素α注射液成品在25°C、相對濕度60%土 10%條件下保存3個月穩(wěn)定，6個月的效價略有降低，外觀色澤、PH值、澄明度、純度未受影響。本品注射液成品在2 8°C的長期穩(wěn)定性考查24個月后質(zhì)量穩(wěn)定。細(xì)胞病變抑制法測定干擾素效價標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程I、目的及適用范圍運用細(xì)胞病變抑制法測定干擾素效價，該標(biāo)準(zhǔn)操作適用于其他能抑制病毒復(fù)制的細(xì)胞因子的效價測定。2、主要儀器倒置顯微鏡、酶標(biāo)儀、細(xì)胞培養(yǎng)箱、微量移液器。3、試劑及配制方法DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液、小牛血清(FBS)、0. IM PBS、胰酶、染色液、脫色液。4、操作步驟
4. I細(xì)胞制備取生長良好的MDBK細(xì)胞，按常規(guī)方法消化，運用10%FBS DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液制備細(xì)胞懸液；對細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為I X 10個/ml的懸液，然后加入到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，100 μ I/孔。37°C，5%C02培養(yǎng)8 IOh使其成為單層細(xì)胞。4. 2加入干擾素處理細(xì)胞取待測干擾素樣本，運用10%FBS DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液預(yù)稀釋成終濃度為O. OOlmg/ml，然后運用10%FBS DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行4倍梯度稀釋，稀釋6 8個梯度；將培養(yǎng)8 10h的單層細(xì)胞中的培養(yǎng)液吸出，加入4倍倍比稀釋的干擾素稀釋液，每孔100μ 1，每個梯度三個重復(fù)，同時取6孔分別標(biāo)為病毒陽性對照和病毒毒陰性對照，并在各孔中加入等量細(xì)胞培養(yǎng)液；培養(yǎng)12 15h。4. 3病毒感染
取VSV病毒，運用無血清DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋成終濃度為103TCID5(l/ml ;在陽性對照和干擾素處理細(xì)胞各孔中加入100 μ I病毒稀釋液，在陰性對照孔中加入無血清DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液；培養(yǎng)24h。4. 4結(jié)晶紫染色棄細(xì)胞培養(yǎng)液，于每孔中加入結(jié)晶紫染色液100 μ 1，室溫放置30min。4. 5 脫色棄染料，并用自來水或雙蒸水沖洗未著色染料，然后在每孔中加入脫色液100 μ 1，室溫放置IOmin。4. 6運用酶標(biāo)儀測定OD57tlnm值并記錄。4. 7數(shù)據(jù)處理，以能抑制50%細(xì)胞病變的干擾素含量定義為一個活性單位，運用Reed-Muench法計算干擾素效價，即能抑制50%細(xì)胞病變的稀釋倍數(shù)，方法見表I。表I運用Reed-Muench法計算干擾素效價分別計算陰性對照(無病毒對照)Χ與陽性對照平均值(病毒對照值)Y
權(quán)利要求
1.ー種高效雞基因工程雞干擾素α的制備方法，其特征在于，具體步驟如下 1)重組表達(dá)工程菌Ε. coli BL21 (DE3) /pET22b (+) /ChIFN α 種子制備 將重組表達(dá)工程菌Ε. coli BL21 (DE3) /pET22b (+) /ChIFN α按1%的比例接種菌液于含Amp的LB液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)；將培養(yǎng)液接種至含Amp的LB平板，劃線培養(yǎng)，挑取單菌LB中搖瓶培養(yǎng)，當(dāng)OD600nm = O. 5，按250ul/750ul的比例加入50%的甘油，保存； 2)工程菌E. coli BL21 (DE3) /pET22b (+) /ChIFN α 發(fā)酵種子液制備 將保存的工程菌Ε. coli BL21 (DE3) /pET22b (+) /ChIFN α種子按O. 05-0. 1%體積的量接種于2XYT培養(yǎng)液中培養(yǎng)，作為發(fā)酵罐用種子液；3)工程菌Ε. coli BL21 (DE3) /pET22b (+) /ChIFN α 發(fā)酵生產(chǎn) 菌體培養(yǎng)階段發(fā)酵培養(yǎng)基高溫滅菌后，每升培養(yǎng)基加入IOOmg的Amp，按5-10%體積的量接入種子液，通氣攪拌培養(yǎng)，培養(yǎng)過程調(diào)節(jié)PH7. 2 ； 碳源飼喂階段碳源耗完，流加補料培養(yǎng)基，溶氧量維持在30%，培養(yǎng)過程調(diào)節(jié)pH7. 2 ； 誘導(dǎo)表達(dá)階段繼續(xù)連續(xù)流加補料培養(yǎng)基；加入IPTG，在IPTG終濃度O. 5mM條件下誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白，培養(yǎng)過程中調(diào)節(jié)PH7. 2，溶氧量維持在30 %，誘導(dǎo)4h停罐； 4)重組雞α干擾素的純化 取上述發(fā)酵液，5000rpm離心IOmin收集菌體，經(jīng)PBS緩沖液洗滌后PBS緩沖液重懸，超聲30min，10000rpm，4°C，離心IOmin收集沉淀，PBS緩沖液洗滌沉淀，然后用變性緩沖液溶解沉淀，IOOOOrpm, 4°C，離心lOmin，收集上清液，將上清液緩慢加入復(fù)性緩沖液中，4°C靜置48h，IOOOOrpm, 4°C，離心20min，收集上清液，即得到含有高效雞基因工程雞干擾素α的溶液。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的ー種高效雞基因工程雞干擾素α的制備方法，其特征在干，所述步驟I)中含Amp的LB培養(yǎng)基中Amp的量為100 μ g/ml。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的ー種高效雞基因工程雞干擾素α的制備方法，其特征在干，所述步驟I)中的振蕩培養(yǎng)條件為30°C，200rpm，培養(yǎng)8_10h。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的ー種高效雞基因工程雞干擾素α的制備方法，其特征在干，所述步驟I)中的保存條件為-20°C。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的ー種高效雞基因工程雞干擾素α的制備方法，其特征在干，所述步驟2)中2ΧΥΤ培養(yǎng)液的組成為蛋白胨10. 0g、酵母膏5. 0g、葡萄糖I. 0g、NaCl 5. 0g、瓊脂 20. 0g、蒸餾水 1000ml、pH 7. O。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的ー種高效雞基因工程雞干擾素α的制備方法，其特征在干，所述步驟2)中2ΧΥΤ培養(yǎng)液中培養(yǎng)條件為30°C，200rpm，培養(yǎng)5_12h。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的ー種高效雞基因工程雞干擾素α的制備方法，其特征在干，所述步驟3)中通氣攪拌培養(yǎng)條件為37°C，培養(yǎng)8-10h。
8.根據(jù)權(quán)利要求I所述的ー種高效雞基因工程雞干擾素α的制備方法，其特征在干，所述步驟3)中發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為蛋白胨5g/L、酵母粉5g/L、KH2P042g/L、K2HP044g/L、Na2HPO4 · 12H20 7g/L、(NH4)2SO4L 2g/L、NH4Cl 0. 2g/L、MnSO4 · 5H20 0. 001g/L、CoCl2 · 6H20.0. 004g/L、Na2MoO4 · 2H20 0. 002g/L、ZnC120. 002g/L、CuSO4 · 5H20 0. 001g/L、H3BO4O. 005g/L、FeSO4 · 7H20 0. 02gL、CaCl · 2H20 0. 02g/L、MgSO4 · 7H20 0. 3g/L、消泡劑 0. 2g/L。
9.根據(jù)權(quán)利要求I所述的ー種高效雞基因工程雞干擾素α的制備方法，其特征在干，所述步驟3)中補料培養(yǎng)基的組成為胰蛋白胨30g/L、酵母粉15g/L、MgS04. 7H20 3g/L、NaCl5g/L、甘油 150ml/L、pH7. 2。
10.根據(jù)權(quán)利要求I所述的ー種高效雞基因工程雞干擾素α的制備方法，其特征在干，所述步驟3)中流加補料培養(yǎng)基的速度由溶氧量控制，設(shè)定溶氧量30%，當(dāng)溶氧量大于30%流加泵打開流加補料培養(yǎng)基，溶氧量逐步下降，當(dāng)溶氧量下降到30%以下流加泵關(guān)閉。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種高效雞基因工程雞干擾素α的制備方法，具體步驟如下1、制備重組表達(dá)工程菌E.coli BL21(DE3)/pET22b(+)/ChIFNα種子；2、將該工程菌種子培養(yǎng)，制備發(fā)酵罐用種子液；3、將種子液接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，通氣攪拌培養(yǎng)；4、碳源消耗完補加補料培養(yǎng)基，加入IPTG，誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白；5、取發(fā)酵液，離心，收集菌體，PBS洗滌后PBS重懸，超聲破碎，離心，收集沉淀，變性緩沖液溶解沉淀，離心，收集上清液，加入復(fù)性緩沖液，靜置后再離心，取上清液，即得含有雞基因工程雞干擾素α的溶液。本品具有廣譜抗病毒性，可以調(diào)節(jié)B、T淋巴細(xì)胞的功能，激活機體免疫系統(tǒng)，提高機體免疫力，并可強化疫苗免疫效果，減少應(yīng)激反應(yīng)等生物學(xué)功能。
文檔編號C12R1/19GK102851340SQ201210320070
公開日2013年1月2日 申請日期2012年8月30日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月30日
發(fā)明者吳紅云, 李建正, 范超杰 申請人:鄭州后羿制藥有限公司