專利名稱：一種測定殺菌劑對大白菜霜霉病菌毒力的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及植物保護領域，具體涉及一種測定殺菌劑對病原菌毒力的方法，特別涉及一種測定殺菌劑對大白菜霜霉病菌毒力的方法。
背景技術：
大白菜(Brassica rapa pekinensis)是常見的十字花科蔬菜。大白菜霜霉病是由寄生霜霉(Peronospora parasitica)引起的一種重要卵菌病害,凡栽培大白菜的地區(qū)均有發(fā)生，在我國尤以北方地區(qū)受害最重，在病害流行年份可造成生產上20%-60%的損失。我國在20世紀60年代發(fā)生過大白菜霜霉病的大流行，對農業(yè)生產造成了嚴重的損失。寄生霜霉為大白菜霜霉病菌的中文學名。 由于大白菜霜霉病嚴重影響大白菜的產量和品質，生產上通常采用加強栽培管理、選用抗病品種、化學藥劑防治等不同措施來減輕其危害。在諸多防治措施中，化學藥劑防治仍然是控制大白菜霜霉病危害的主要手段之一。目前，市場上的一系列卵菌殺菌劑，均可以用來防治大白菜霜霉病，但隨著使用年份和施用次數的增加，大白菜霜霉病菌對各種卵菌藥劑均產生不同程度的抗藥性，其防治效果也逐漸降低。國際殺菌劑抗性行動委員會(FRAC)認為寄生霜霉對殺菌劑具有潛在的高抗藥性風險。因此，新型殺菌劑投入使用后必須采取嚴格的抗性監(jiān)測和治理措施來避免和延緩抗藥性的產生，延長殺菌劑的使用壽命。評估殺菌劑對病原菌的毒力，評價病原菌對殺菌劑的敏感性變化是殺菌劑活性測定和抗藥性研究及治理的前提。研究穩(wěn)定可靠、重復性好的毒力測定方法，用來篩選對病原菌具有優(yōu)異防效的殺菌劑及建立病原菌對藥劑的敏感基線，監(jiān)測田間病原菌對藥劑的敏感性變化，是殺菌劑活性篩選和抗藥性研究及治理的前提，是實現植物病害化學防治可持續(xù)發(fā)展的基礎。針對非專性寄生菌，一般采用離體毒力測定法篩選藥劑和監(jiān)測病原菌敏感性，即在實驗室條件下進行的不依附于病原寄主的農藥本身(原藥)對靶標菌抑菌作用的測定法，如傳統(tǒng)毒力測定方法中的孢子萌發(fā)法和生長速率測定法等。但大白菜霜霉病菌為專性寄生菌，不能在人工培養(yǎng)基上生長；同時病原菌菌株難于在離體條件下進行長期保存，且生產中用于霜霉病防治的幾種殺菌劑對病原菌不同發(fā)育階段的影響有所區(qū)別如甲霜靈對卵菌的游動孢子的釋放、萌發(fā)和侵入的抑制作用不是很明顯，但是能抑制病菌侵入植物后病害發(fā)展的各個主要階段(如菌絲在植物體內的生長，吸器及孢子囊的形成)；霜霉威的作用機理是抑制病菌細胞膜成分的磷酸和脂肪酸的生化合成，抑制菌絲生長蔓延和孢子囊的形成及萌發(fā)；嘧菌酯既能抑制病原菌的菌絲生長又能抑制孢子囊萌發(fā)，并且對真菌分生孢子的產生也有顯著的抑制作用，具有鏟除、保護、內吸及橫向輸導等特性。因此傳統(tǒng)的毒力測定方法(如孢子萌發(fā)法和生長速率測定法)難于全面檢測這些藥劑的真實抑菌作用。目前，一般采用活體植株法和葉盤漂浮法測定殺菌劑對專性寄生菌的毒力。
活體植株法中，一般是在田間或溫室自然發(fā)病的植株上進行，采用噴霧法進行不同梯度濃度的殺菌劑試驗，一般7-10d噴藥一次，共噴三次，調查噴藥前后植株葉片的病斑面積，換算為病情指數，計算試驗接種條件下各藥劑處理的防病效果，并以防病效果數據轉換成機率值為縱坐標，以藥劑濃度對數為橫坐標，作圖并求其毒力回歸式，計算出各藥劑對病原菌的EC5tl，用來比較不同藥劑的毒力及抑菌活性。該方法存在著測定周期長(需要大于40d時間)，測定過程中影響因素較多(除藥劑本身的毒力起作用外，其他各種條件均對藥劑毒力的發(fā)揮產生影響，包括具體劑型、施藥質量、植物及防治對象的情況等)，試驗可重復性較差(采用人工多點調查方法不可避免產生一定的誤差，影響了方法的準確度和精密度)，試驗中涉及到溫室盆栽或田間試驗，存在工作量大、所需耗材較多等缺點。活體植株法用于監(jiān)測田間病原菌對藥劑的敏感性變化，一般需要將采自田間的病原菌人工接種至植株上，待植株葉片發(fā)病后按照上述方法進行測定。葉盤漂浮法是針對活體植株法中的弊端，而采用的一種改良的方法。即用打孔器將生長健康完好的植株葉片制成直徑為I. 5cm的葉盤，在含系列濃度殺菌劑和清水對照的··保持懸浮狀態(tài)，置于16-20°C條件下光照黑暗交替培養(yǎng)6-8d，檢查每個葉盤的病情指數，計算防效，求其毒力回歸式和EC5(i。殺菌劑對黃瓜霜霉病菌的毒力測定采用了這種方法。但該方法存在植株葉齡不統(tǒng)一，病原菌接種體濃度不一致，漂浮液以水為溶劑，展著性和滲透性差，漂浮時間過長(達6-8d)，影響葉片正常的生理代謝，漂浮液易揮發(fā)導致處理濃度的改變等影響因素，而最終導致試驗重復性和準確性較差，因此不同人員、不同批次的測定結果缺少可比性和引用價值。目前還無固定的方法測定殺菌劑對大白菜霜霉病的毒力。國家農藥檢定部門及藥劑研發(fā)部門迫切需要建立一種準確和有效的檢測殺菌劑活性的方法，以確定和比較不同藥劑對大白菜霜霉病菌的抑菌效果和毒力，并為新型殺菌劑的篩選和田間抗性菌株的監(jiān)測提供理論方法。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種測定殺菌劑對大白菜霜霉病菌毒力的方法。本發(fā)明提供的測定殺菌劑對大白菜霜霉病菌毒力的方法，依次包括如下步驟(I)將大白菜葉片在殺菌劑溶液中浸泡2_3h ；(2)取完成步驟(I)的大白菜葉片，接種大白菜霜霉病菌，保濕培養(yǎng)，然后根據葉片的發(fā)病情況判斷殺菌劑對大白菜霜霉病菌的毒力。所述大白菜葉片具體為大白菜子葉(即大白菜植株子葉期的子葉)。所述殺菌劑溶液具體由所述殺菌劑、Tween20、丙酮和水組成。所述Tween20的濃度優(yōu)選為O. 005% (質量比)以下。所述丙酮的濃度優(yōu)選為0.1% (質量比)。所述大白菜霜霉病菌的接種方式為采用孢子囊懸浮液接種。所述孢子囊懸浮液的接種濃度優(yōu)選為I. O X IO3-L O X IO5個孢子囊/mL，更優(yōu)選為1.0X IO4個孢子囊/mL。所述孢子囊懸浮液的接種量具體可為10 μ L/片大白菜葉片。所述步驟(2)中，保濕培養(yǎng)的條件具體可為15°C，12h光暗交替、5_7d (如6d)。所述步驟(I)中，所述大白菜葉片背面向下。
所述步驟(2)中，所述大白菜葉片背面向上。所述步驟(I)中，可設置含有不同濃度殺菌劑的殺菌劑溶液，從而所述步驟(2)中根據EC5tl值判斷殺菌劑對大白菜霜霉病菌的毒力。以上任一所述方法均可用于鑒定大白菜霜霉病菌對殺菌劑的抗性。即在實際應用中，對發(fā)生大白菜霜霉病的大白菜種植地采樣并分離大白菜霜霉病菌菌株，然后采用本發(fā)明提供的方法檢測各種殺菌劑對各個大白菜霜霉病菌菌株的毒力，從而篩選出最適合使用的殺菌劑或殺菌劑組合物。以上任一所述的殺菌劑具體可為甲霜靈、嘧菌酯、霜霉威或霜脲氰。大白菜霜霉病菌是專性寄生菌，沒有寄主存在的情況下無法生存。孢子囊萌發(fā)法 只是通過測定藥劑對病原菌孢子囊萌發(fā)的影響來進行評估藥劑的毒力，未考慮到寄主在殺菌劑對大白菜霜霉病菌毒力測定中的重要作用，具有很大的局限性，試驗結果也只能說明殺菌劑對大白菜霜霉病菌孢子囊萌發(fā)這一特定生長階段的抑制作用，并且孢子囊萌發(fā)法測定殺菌劑對大白菜霜霉病菌的毒力作用過程中存在影響因素多、工作量大等弊端。葉盤漂浮法測定過程中，葉盤接種病原菌孢子囊懸浮液后極容易流失，漂浮液以水為溶劑，展著性和滲透性差，最重要的是葉盤在液體溶液中漂浮時間過長(達6-8d)，影響葉盤正常的生理代謝，葉盤易腐爛(見圖4)，導致病斑面積調查中出現誤差，漂浮液易揮發(fā)導致處理濃度的改變等影響試驗重復性和準確性的問題。本發(fā)明建立了穩(wěn)定可靠、重復性好、精密度高的檢測殺菌劑對大白菜霜霉病菌毒力的方法，將其命名為子葉浸泡法。本發(fā)明的方法具有如下優(yōu)點(1)檢測周期約為6d;
(2)檢測過程中原藥借助表面展著劑及有機溶劑的定量添加增強了藥液在子葉上的展著和滲透，子葉在藥液中浸泡的時間為2-3h，杜絕了因長時間在藥液中漂浮造成的子葉腐爛現象；(3)測定過程在離體子葉上進行，是不依附于活體植株進行的農藥本身(原藥)對于靶標菌的抑菌作用的測定，不受植物生長情況和環(huán)境條件的影響，準確度和精密度高，平行性好；(4)在檢測過程中耗費的試材量少。采用本發(fā)明提供的方法可以準確、可靠地測定殺菌劑對大白菜霜霉病菌的毒力和監(jiān)測田間大白菜霜霉病菌對殺菌劑敏感性的變化，為進一步的殺菌劑作用機制和抗藥性研究及治理提供了技術支撐，具有重大的社會經濟意義。


圖I為嘧菌酯與霜霉威和霜脲氰的交互抗性。圖2為32株大白菜霜霉病菌對嘧菌酯的敏感性分布圖；橫坐標數字1-32所代表的菌株依次為1:JB8 ；2JB5 ；3:YS7 ；4:ZB1 ；5:QD4 ；6:JB13 ；7:CY16 ；8:BJ2 ；9:JB4 ；10:WF2 ；11:CY17 ；12:JB12 ； 13:LCl ；14:JB16 ；15:CY13 ；16:JN ；17:CY24 ；18:CY26 ； 19:TAl ；20:JB9 ；21:JB1 ；22:CY12 ；23:CY11 ；24:HNl ；25:CY5 ；26:JB11 ；27:JB3 ；28:CY19 ；29:CY6 ；30:JB2 ；31:GD1 ;32:JB6。圖3為32株大白菜霜霉病菌對嘧菌酯的敏感性聚類分析圖。圖4為子葉漂浮法中子葉在藥液中浸泡6d后腐爛的照片'K'無菌水對照；B:嘧菌酯I μ g/mL ；C: B密菌酯5 μ g/mL ；D:卩密菌酯10 μ g/mL ；Ε:卩密菌酯25 μ g/mL ；F:卩密菌酯50 μ g/mL。
具體實施例方式以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。以下實施例中的定量試驗，均設置三次重復實驗，結果取平均值。大白菜霜霉病菌孢子囊懸浮液是收集大白菜霜霉病菌孢子囊并用無菌水稀釋懸浮得到的。用于實施例的大白菜品種為魯白七號(青島城陽科達蔬菜研究所，品種審定號為魯種審字第0103號，種子經營許可證編號為(魯)農種經許字(2001)第172號)。大白菜的子葉期即播種后7-10d，白菜苗生長至具有兩片子葉并有真葉開始露出 的時期(俗稱破心期)。大白菜的幼苗期是指播種后30d左右，白菜苗生長至第一葉序環(huán)形成(5-8片葉)的時期。大白菜的蓮座期是指播種后50-60d，白菜苗生長至第二至第三葉序環(huán)形成(10-16片葉片)的時期。上述定義來源于中國農業(yè)科學研究所主編.中國蔬菜栽培學[M],農業(yè)出版社，1987:389-408。大白菜霜霉病菌，其中文學名為寄生霜霉(Peronospora parasitica),公眾可從青島農業(yè)大學獲得，參考文獻章一華，石銀鹿，裘維蕃.京津大白菜及其他十字花科作物霜霉病菌生理分化的初步研究.植物病理學報，1964，7(1) :33-44.。98%甲霜靈(metalaxyl)原藥成都貝斯特試劑有限公司，貨號為BRS010151。95%嘧菌酯(82( 78廿01^11)原藥成都貝斯特試劑有限公司，貨號為BRS009538。99%霜霉威原藥成都貝斯特試劑有限公司，貨號為24579-73-5。99%霜脲氰原藥成都貝斯特試劑有限公司，貨號為57966-95-7。實施例I、子葉浸泡法測定殺菌劑對大白菜霜霉病菌的毒力中各處理條件的選擇一、大白菜生長階段的選擇取大白菜植株不同發(fā)育期的葉片(子葉期、幼苗期和蓮座期)，分別進行如下操作子葉期葉片用無菌水沖洗子葉3次，然后背面朝上整齊地放置于用吸水紙保濕的Φ 150mm培養(yǎng)皿中，每皿10片子葉,每片子葉背面接種10 μ L大白菜霜霉病菌孢子囊懸浮液(I X IO4個孢子囊/mL)，置于15°C，12h光暗交替的光照培養(yǎng)箱中保濕培養(yǎng)。幼苗期葉片用無菌水沖洗葉片3次，然后背面朝上整齊地放置于用吸水紙保濕的透明食品容器中，每皿10片葉片，每片葉片背面接種10 μ L大白菜霜霉病菌孢子囊懸浮液(I X IO4個孢子囊/mL)，置于15°C，12h光暗交替的光照培養(yǎng)箱中保濕培養(yǎng)。蓮座期葉片用無菌水沖洗葉片3次，然后背面朝上整齊地放置于用吸水紙保濕的透明食品容器中，每皿10片葉片，每片葉片背面接種10 μ L大白菜霜霉病菌孢子囊懸浮液(I X IO4個孢子囊/mL)，置于15°C，12h光暗交替的光照培養(yǎng)箱中保濕培養(yǎng)。每天調查各個葉片上的霉層面積，比較大白菜不同生長階段霜霉病發(fā)病的嚴重度(試驗重復3次)。接種6d后的結果見表I (平均值)。表I大白菜不同生長階段感病性比較
權利要求
1.一種測定殺菌劑對大白菜霜霉病菌毒力的方法，依次包括如下步驟 (1)將大白菜葉片在殺菌劑溶液中浸泡2-3h； (2)取完成步驟(I)的大白菜葉片，接種大白菜霜霉病菌，保濕培養(yǎng)，然后根據葉片的發(fā)病情況判斷殺菌劑對大白菜霜霉病菌的毒力。
2.如權利要求I所述的方法，其特征在于所述大白菜葉片為大白菜子葉。
3.如權利要求I或2所述的方法，其特征在于所述殺菌劑溶液由所述殺菌劑、Tween20、丙酮和水組成。
4.如權利要求I至3中任一所述的方法，其特征在于所述大白菜霜霉病菌的接種方式為采用孢子囊懸浮液接種。
5.如權利要求4所述的方法，其特征在于所述孢子囊懸浮液的接種濃度優(yōu)選為1.0X IO3-L OX IO5 個孢子囊 /mLo
6.如權利要求5所述的方法，其特征在于所述孢子囊懸浮液的接種量為10μ L/片大白菜葉片。
7.如權利要求I至6中任一所述的方法，其特征在于所述步驟(2)中，保濕培養(yǎng)的條件為15°C，12h光暗交替、5-7d。
8.如權利要求I至7中任一所述的方法，其特征在于所述步驟(I)中，所述大白菜葉片背面向下；所述步驟(2)中，所述大白菜葉片背面向上。
9.如權利要求I至8中任一所述的方法，其特征在于所述步驟(I)中，設置具有不同殺菌劑濃度的殺菌劑溶液；所述步驟(2)中根據EC5tl值判斷殺菌劑對大白菜霜霉病菌的毒力。
10.權利要求I至9中任一所述方法在鑒定大白菜霜霉病菌對殺菌劑的抗性中的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種測定殺菌劑對大白菜霜霉病菌毒力的方法。本發(fā)明提供的方法依次包括如下步驟(1)將大白菜子葉在殺菌劑溶液中浸泡2-3h；(2)取完成步驟(1)的大白菜子葉，接種大白菜霜霉病菌，保濕培養(yǎng)，然后根據子葉的發(fā)病情況判斷殺菌劑對大白菜霜霉病菌的毒力。采用本發(fā)明提供的方法可以準確、可靠地測定殺菌劑對大白菜霜霉病菌的毒力和監(jiān)測田間大白菜霜霉病菌對殺菌劑敏感性的變化，為進一步的殺菌劑作用機制和抗藥性研究及治理提供了技術支撐，具有重大的社會經濟意義。
文檔編號C12Q1/18GK102827917SQ201210323168
公開日2012年12月19日 申請日期2012年9月4日 優(yōu)先權日2012年9月4日
發(fā)明者梁晨, 趙洪海, 楊麗娟, 黃金光, 李寶篤 申請人:青島農業(yè)大學