專利名稱：c-Jun的N端缺失誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞的方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域的干細(xì)胞研究,具體涉及AP-I家族蛋白C-Jun N端缺失誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞的方法及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
AP-I家族是一類細(xì)胞響應(yīng)外界信號(hào)包括生長因子、細(xì)胞因子和胞外壓力的轉(zhuǎn)錄激活蛋白。結(jié)構(gòu)上由不同的亞基組成同源或異源二聚體。這些亞基包括Jun、Fos和ATF。每個(gè)亞基上均有一個(gè)亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)，兩兩形成與DNA結(jié)合的鋅指模塊。ES細(xì)胞及胚胎干細(xì)胞是一中在囊胚的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)中分離出的具有體外無限增殖、自我更新和多向分化的特性的細(xì)胞。無論在體外還是體內(nèi)環(huán)境，ES細(xì)胞都能被誘導(dǎo)分化為機(jī)體幾乎所有的細(xì)胞類型。鑒于ES細(xì)胞的體外無限增殖和多分化潛能，其在再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具 有廣闊的應(yīng)用前景。2006年，日本科學(xué)家Yamanaka及其同事用四個(gè)轉(zhuǎn)錄因子(0ct4, KLF4, Sox2,c-Myc)成功的將小鼠的成纖維細(xì)胞重編程為胚胎干細(xì)胞，這一技術(shù)被稱為誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞(iPS)技術(shù)。其后，人及其他物種如大鼠，猴，豬的成纖維細(xì)胞也被成功的重編程，這項(xiàng)技術(shù)被認(rèn)為是再生醫(yī)學(xué)中最為重要的突破。近年來，iPS技術(shù)發(fā)展迅速，首先是四個(gè)轉(zhuǎn)率因子中c-Myc被證明是非必須的，盡管去除c-Myc后，重編程效率變得極低；其次，一系列促進(jìn)重編程的小分子化合物被發(fā)現(xiàn)，如組蛋白去乙?；敢种苿￢PA、TSA，丁酸鈉，DNA甲基化酶抑制劑5-AZA ；TGF-^抑制劑A83-01及SB431542，組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑BIX01294，維生素C (抗壞血酸)等。這些小分子化合物的發(fā)現(xiàn)，極大的加速了 iPS進(jìn)程，將重編程效率從起初的約O. 01%提高到接近1%的水平。此外，無血清以及化學(xué)成分限定培養(yǎng)條件的采用，將三因子的重編程效率提高到10%左右，同時(shí)也解決了血清培養(yǎng)體系中血清批次差異導(dǎo)致的實(shí)驗(yàn)重復(fù)性差的問題，為重編程研究提供了非常好的平臺(tái)。然而，對(duì)轉(zhuǎn)錄因子誘導(dǎo)重編程過程機(jī)理的揭示進(jìn)展依舊緩慢。尋找能替代核心重編程因子的小分子或基因，將對(duì)揭示核心重編程因子在重編中的功能起到推動(dòng)作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種AP-I家族蛋白的c-Jun基因的截短型誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞的方法及應(yīng)用。本發(fā)明的技術(shù)方案為提供一種c-Jun的N端缺失與多能干細(xì)胞誘導(dǎo)因子聯(lián)合使用在誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞過程中的應(yīng)用，所述c-Jun的N端缺失為AP-I家族蛋白c-Jun的170到274位氨基酸到末端334位氨基酸的截短或其對(duì)應(yīng)的核酸序列。優(yōu)選的，上述多能干細(xì)胞誘導(dǎo)因子為Klf4、Sox2、0ct4。優(yōu)選的，上述多能干細(xì)胞誘導(dǎo)因子為Klf4、Sox2、c-Myc。優(yōu)選的，上述多能干細(xì)胞誘導(dǎo)因子為Klf4、0ct4、c-Myc。
優(yōu)選的，上述多能干細(xì)胞誘導(dǎo)因子為Klf4、Sox2。本發(fā)明的另ー個(gè)技術(shù)方案為提供ー種C-Jun的N端缺失誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞的方法a、將含有供體C-Jun蛋白氨基酸序列的170到274位氨基酸到末端334位氨基酸對(duì)應(yīng)的核酸序列克隆到表達(dá)載體上；b、用步驟a所得表達(dá)載體與多能干細(xì)胞誘導(dǎo)因子感染供 體體細(xì)胞使其重編程為多能干細(xì)胞。優(yōu)選的，所述步驟a具體為將含有供體C-Jun蛋白氨基酸序列的254-334，274-334，170-334位氨基酸片段對(duì)應(yīng)的核酸序列克隆到表達(dá)載體上。優(yōu)選的，上述方法的多能干細(xì)胞誘導(dǎo)因子為Klf4、SoX2、0ct4。優(yōu)選的，上述方法的多能干細(xì)胞誘導(dǎo)因子為Klf4、Sox2。優(yōu)選的，上述方法的供體體細(xì)胞為小鼠成纖維細(xì)胞。本發(fā)明在誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞的過程中使用了 AP-I家族蛋白的C-Jun蛋白的N端截短型，提供了一種高效率的重編程誘導(dǎo)體系，替代核心重編程因子的小分子或基因，將對(duì)掲示核心重編程因子在重編中的功能起到推動(dòng)作用。c-Jun蛋白的N端截短型包括170位氨基酸至334位氨基酸等一系列截短，尤其包括170到274位到末端334位氨基酸的一系列截短型。如圖2所示170-334，250-334、274-334片段對(duì)OKS誘導(dǎo)的重編程具有促進(jìn)作用，其中170-334,250-334片段則對(duì)OKS誘導(dǎo)的重編程具有明顯的促進(jìn)作用。


圖I是小鼠c-Jun蛋白全長和不同截短型的結(jié)構(gòu)圖。根據(jù)NCBI上小鼠c-Jun的蛋白序列全長和結(jié)構(gòu)域信息，設(shè)計(jì)不同的引物，采用常規(guī)分子克隆的方法，克隆出圖示中不同氨基酸的序列的多妝片段用于實(shí)驗(yàn)。其中1-334多妝片段命名為c-Jun-FL ； 1-256多妝片段命名為c-Jun(-bZIP)，170-334片段命名為c-Jun_DN。將克隆的片段用合適的限制性內(nèi)切酶克隆到逆轉(zhuǎn)錄病毒載體PMXS上，進(jìn)行目的片段的表達(dá)。圖2是在OKS三因子重編程模型下，c-Jun蛋白全長或不同截短型與空載相比的重編程效率比較圖。以O(shè)KS和空載病毒感染0G2胚胎成纖維細(xì)胞為對(duì)照，分別用OKS及所示c-Jun基因全長或不同截短型病毒感染0G2胚胎成纖維細(xì)胞。感染后在含血清的mES培養(yǎng)基中進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，在合適的天數(shù)在熒光顯微鏡下計(jì)算GFP陽性的熒光克隆數(shù)。將各片段得到的重編程克隆數(shù)除以空載狀態(tài)下的重編程克隆數(shù)，得到全長或各截短片段對(duì)重編程效率的影響。圖3是c-Jun (-ZIP)和C-Jun-DN對(duì)三因子重編程效率的影響圖。三因子SKO和所示病毒感染0G2小鼠胚胎成纖維細(xì)胞后，在血清或無血清培養(yǎng)體系iSFl中連續(xù)培養(yǎng)，每天更換培養(yǎng)基。在合適的天數(shù)，通過熒光顯微鏡計(jì)算綠色熒光克隆數(shù)，以三因子感染組熒光克隆數(shù)為參照，計(jì)算各實(shí)驗(yàn)組的相對(duì)重編程效率。圖4是C-JunDN對(duì)不同重編程因子的取代效果圖。分別用所示病毒感染0G2小鼠胚胎成纖維細(xì)胞，感染后在無血清培養(yǎng)體系iSFl中連續(xù)培養(yǎng)，每天更換培養(yǎng)基。在合適的天數(shù)，通過熒光顯微鏡計(jì)算綠色熒光克隆數(shù)。分析C-JunDN對(duì)Sox2，Klf4和0ct4的取代作用。K Klf4 ；S Sox2, M c-Myc, 0 :0ct4。
圖5是C-JunDN替代0ct4與klf4及Sox2 —起將小鼠成纖維細(xì)胞重編程效果圖。分別用所示病毒感染0G2小鼠胚胎成纖維細(xì)胞，感染后在無血清培養(yǎng)體系iSFl中連續(xù)培養(yǎng)，每天更換培養(yǎng)基。在合適的天數(shù)，通過熒光顯微鏡計(jì)算綠色熒光克隆數(shù)。K:Klf4;S:Sox2。圖6是挑取的SKMJunDN誘導(dǎo)重編程克隆圖。所述KSMJunDN為KSM和c-Jun-DN感染的細(xì)胞。由SKMJunDN誘導(dǎo)的重編程克隆在顯微鏡下呈現(xiàn)致密的球體，邊緣光澤，形態(tài)均一，具有典型的干細(xì)胞形態(tài)；熒光顯微鏡下顯示出很強(qiáng)的綠色熒光，表明其內(nèi)源多能性基因0ct4已經(jīng)激活。AP染色呈陽性，表明克隆表達(dá)堿性磷酸酶。圖7是SKMJunDN誘導(dǎo)重編程克隆0ct4和Nanog啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化狀態(tài)圖。將挑取的SKMJunDN誘導(dǎo)重編程克隆培養(yǎng)物提取基因組DNA，采用PCR，用特異性引物將克隆基因組0ct4和Nanog啟動(dòng)子區(qū)目的片段分離。采用亞硫酸鹽法分析 目的區(qū)域CpG島的甲基化狀態(tài)。結(jié)果表明，挑取的克隆0ct4和Nanog的啟動(dòng)子區(qū)均呈現(xiàn)去甲基化狀態(tài)，與胚胎干細(xì)胞類似。黑圈表示CpG島為甲基化狀態(tài)，白圈表示CpG島為去甲基化狀態(tài)。圖8是SKMJunDN誘導(dǎo)重編程克隆表達(dá)Sox2，Nanog, Rexl，SSEA-I等多能性分子標(biāo)記物圖。將挑取的克隆種植到飼養(yǎng)層細(xì)胞上，用胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)兩天。采用免疫熒光的方法，分別用Sox2，Nanog, Rexl, SSEA-I抗體和對(duì)應(yīng)的熒光二抗檢測這些多能型基因的表達(dá)狀況。圖9是SKMJunDN誘導(dǎo)重編程克隆具有正確的核型圖。將挑去的克隆用秋水仙素處理后，采用常規(guī)方法進(jìn)行核型分析，觀察分裂像。圖10是SKMJunDN誘導(dǎo)重編程克隆注射囊胚可形成嵌合鼠圖。將挑取的SKMJunDN克隆消化為單細(xì)胞后注射到囊胚中(10-20個(gè)細(xì)胞/囊胚)，再將囊胚移植到ICR品系的假孕母鼠子宮中(10-15個(gè)囊胚/母鼠)，縫合傷口后繼續(xù)飼養(yǎng)。待出生小鼠后通過檢查虹膜及毛色來判斷嵌合與否。使用0G2來源的細(xì)胞制備出iPSCs與ICR品系胚胎形成的嵌合鼠會(huì)呈現(xiàn)黑色虹膜和雜色毛發(fā)。圖11是胚胎干細(xì)胞和胚胎成纖維細(xì)胞中c-Jun表達(dá)含量比較圖。采用常規(guī)分子生物學(xué)方法分別提取胚胎干細(xì)胞和胚胎成纖維細(xì)胞的總RNAJf 2ug總RNA反轉(zhuǎn)為cDNA后采用熒光定量PCR進(jìn)行檢測。比較胚胎干細(xì)胞和胚胎成纖維細(xì)胞中c-jun基因的表達(dá)量。圖12是胚胎干細(xì)胞向擬胚體分化過程中c-jun表達(dá)量變化圖。將胚胎干細(xì)胞按照常規(guī)方法向擬胚體進(jìn)行分化，分別收取不同天數(shù)的分化培養(yǎng)物提取總RNAJf 2ug總RNA反轉(zhuǎn)為cDNA后采用熒光定量PCR進(jìn)行檢測。比較向擬胚體分化不同天數(shù)過程中c-jun基因的表達(dá)量變化。圖13是胚胎干細(xì)胞在分化過程中c-jun表達(dá)量變化圖。將胚胎干細(xì)胞在撤去白細(xì)胞抑制因子(LIF)的條件下培養(yǎng)，細(xì)胞將逐步分化。收取不同天數(shù)的培養(yǎng)物提取總RNA，將2ug總RNA反轉(zhuǎn)為cDNA后采用熒光定量PCR進(jìn)行檢測。比較分化不同天數(shù)過程中c-jun基因的表達(dá)量變化。圖14是c-Jun、c-Jun (-bZIP)和C-JunDN對(duì)干細(xì)胞分化影響效果圖。分別構(gòu)建c-Jun.c-Jun(-bZIP)和C-JunDN穩(wěn)定表達(dá)干細(xì)胞株，并在胚胎干細(xì)胞的培養(yǎng)條件下進(jìn)行連續(xù)傳代培養(yǎng)。圖15是c-Jun (_bZIP)和C-JunDN對(duì)干細(xì)胞多能性維持效果圖。分別構(gòu)建c-Jun (-bZIP)和c-JunDN的穩(wěn)定表達(dá)干細(xì)胞株，在撤去LIF后的胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)。觀察觀察干細(xì)胞的多能性狀態(tài)，并用AP染色檢測多能性分子標(biāo)記物堿性磷酸酶的活性。c-Jun (-bZIP)和C-JunDN的過表達(dá)均會(huì)在沒有LIF的狀態(tài)下維持干細(xì)胞的多能性，延遲分化。圖中黑色為堿性磷酸酶染色。
具體實(shí)施例方式為詳細(xì)說明本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容、構(gòu)造特征、所實(shí)現(xiàn)目的及效果，以下結(jié)合實(shí)施方式并配合附圖詳予說明。本發(fā)明的實(shí)踐將使用分子生物學(xué)、微生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、免疫學(xué)和重組DNA的傳統(tǒng)技術(shù)，其屬于本領(lǐng)域技術(shù)范圍。參見例如分子克隆實(shí)驗(yàn)指南，第3版(2002)，Sambrook，F(xiàn)ritsch 和 Maniatis 等人編著；CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (F.M. Ausubel 等人編著(1987));叢書 METHODS IN ENZYM0L0GY (Academic Press, Inc.) PCR2 A PRACTICAL APPROACH(1995)，M. J. MacPherson, B. D. Hames 和 G. R. Taylor 等人編著，ANTIBODIES (1988)，Harlow 和 Lane 等人編著，A LABORATORY MANUAL and ANIMAL CELL CULTURE (1987)，R. I. Freshney 等人編著！HANDBOOK OFSTEM CELLS，卷 2，W. FrenchAnderson等人編著。除非另外說明，本文中所用的術(shù)語均具有本領(lǐng)域技術(shù)人員常規(guī)理解的含義，為了便于理解本發(fā)明，將本文中使用的ー些術(shù)語進(jìn)行了下述定義。本文所述的“胚胎干細(xì)胞”是這樣的細(xì)胞。其來源于小鼠囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)分離培養(yǎng)而來，可在體外無限増殖、自我更新并具有多項(xiàng)分化潛能，和分化成三個(gè)胚層的任何ー種細(xì)胞類型。具有特異的分子標(biāo)記物，可以形成畸胎瘤，注射到3. 5天囊胚再置于代孕母鼠子宮類可形成嵌合鼠。本文所述的Rl細(xì)胞來源于129品系小鼠3. 5天囊胚分離出的胚胎干細(xì)胞系，為實(shí)驗(yàn)室常用的胚胎干細(xì)胞系，具有胚胎干細(xì)胞的基本特征，可以血清培養(yǎng)條件下，在無飼養(yǎng)層細(xì)胞上傳代培養(yǎng)。本文所述的“誘導(dǎo)式多能性干細(xì)胞(iPS細(xì)胞)”是這樣的細(xì)胞，其來源是體細(xì)胞通過誘導(dǎo)體細(xì)胞重編程變化而成，其在胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)條件下，與胚胎干細(xì)胞在細(xì)胞形態(tài)、生長特性、表面標(biāo)志物表達(dá)、移植到皮下可形成包含3個(gè)胚層組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)的畸胎瘤等方面與小鼠胚胎干細(xì)胞非常相似，而且在DNA甲基化方式、基因表達(dá)譜、染色質(zhì)狀態(tài)、形成嵌合體動(dòng)物等方面也與小鼠胚胎干細(xì)胞幾乎完全相似。本文中所用的術(shù)語“體細(xì)胞”是相對(duì)干“生殖細(xì)胞”以及“胚胎干細(xì)胞”而言的概念，其是由“胚胎干細(xì)胞”分化產(chǎn)生的不再具有多能性，而是具有某一具體功能的細(xì)胞，其是由“胚胎干細(xì)胞”分化或內(nèi)細(xì)胞團(tuán)繼續(xù)發(fā)育產(chǎn)生的不再具備多能性，一般具有具體功能的細(xì)胞，其一般從發(fā)育階段位于囊胚期(在小鼠中具體為受精后3. 5天)之后的胎鼠或成鼠取材，取材時(shí)一般避免取到可能具有多能性的生殖細(xì)胞及其來源(如精原干細(xì)胞、生殖嵴干細(xì)胞
坐、
ノ O本文中所用的體細(xì)胞優(yōu)選來源于哺乳動(dòng)物，更優(yōu)選來源于人、猴、狗、貓、大鼠或小鼠，最優(yōu)選地，來源于小鼠。本文中的體細(xì)胞可以是機(jī)體內(nèi)任何類型的體細(xì)胞，優(yōu)選為成纖維細(xì)胞。
本文所述的術(shù)語“誘導(dǎo)”(也稱“誘導(dǎo)重編程”)是指將體細(xì)胞去分化為多能性干細(xì)胞的過程。優(yōu)選地，通過將維持干細(xì)胞多能性所需的多能性因子cDNA導(dǎo)入體細(xì)胞可以誘導(dǎo)體細(xì)胞去分化成為多能性干細(xì)胞(Takahashi K，Yamanaka S. Cell. 2006 ； 126:663 - 676 ；Wernig M, Meissner A,Foreman R,等人，Nature. 2007 ；448:318-324 ；Yu J, Vodyanik MA,Smuga-Otto K 等人 Science. 2007 ;318:1917-1920)。本文所述的術(shù)語“重編程”:指將已分化的細(xì)胞去分化，重新回復(fù)到多能性細(xì)胞的狀態(tài)。本發(fā)明中的重編程指將成體細(xì)胞逆分化為胚胎干細(xì)胞的狀態(tài)。將所述干細(xì)胞多能性因子cDNA導(dǎo)入體細(xì)胞的方法可以是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的多種技術(shù)，包括病毒感染、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的插入表達(dá)、穿膜蛋白、藥物誘導(dǎo)、電穿孔、粒子轟擊等各種將DNA轉(zhuǎn)入細(xì)胞的方法。優(yōu)選地，使用包含cDNA的病毒載體進(jìn)行轉(zhuǎn)染，所述病毒載體包括慢病毒載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體等多種病毒載體。優(yōu)選地逆轉(zhuǎn)錄病毒載體 (例如pMX載體)。本文中所述的“病毒感染”即指的是上述將干細(xì)胞多能性因子cDNA導(dǎo)入體細(xì)胞的方法。本文中的“SOX2/KLF4/0Ct4/C-MyC”即指的是上述干細(xì)胞多能性因子cDNA或帶有這些cDNA的病毒載體，干細(xì)胞多能性因子cDNA可由“病毒感染”導(dǎo)入體細(xì)胞中，其在體細(xì)胞等表達(dá)體系中，可以翻譯合成基因產(chǎn)物。本文中OKSM表示的是0ct4、Klf4、Sox2、c_Myc病毒感染的細(xì)胞；“KSM”表示的是Klf4、Sox2、c-Myc病毒感染的細(xì)胞；“0SM”表示的是0ct4、Sox2、c-Myc病毒感染的細(xì)胞?！?F”表示的是0ct4、Klf4、Sox2、c-Myc四個(gè)因子，“3F”表示的是0ct4、Klf4、Sox2三個(gè)因子。本文中細(xì)胞的培養(yǎng)方法是常規(guī)的細(xì)胞培養(yǎng)方法及條件，包括ー些適宜各個(gè)具體細(xì)胞系，但是不影響細(xì)胞基本性質(zhì)的修飾，各種細(xì)胞類型的培養(yǎng)方法以及培養(yǎng)條件，可參見ff. French Anderson 等人，HANDBOOK OF STEM CELLS，卷 2，或申請(qǐng)?zhí)枮?200910038883. 4 的中國授權(quán)發(fā)明。本文所述的“無血清培養(yǎng)基SF1”為申請(qǐng)?zhí)枮?00910038883.4的中國授權(quán)發(fā)明中的iPS-SFl培養(yǎng)基。本發(fā)明不限于使用與高效培養(yǎng)基相同的培養(yǎng)基，其他含有基礎(chǔ)培養(yǎng)基以及血清或代血清添加劑的培養(yǎng)基都能夠添加c-Jun截短型誘導(dǎo)誘導(dǎo)式多能性干細(xì)胞。本文中iPS細(xì)胞的鑒別采用了報(bào)告基因的方法，所述的報(bào)告基因是指能夠指示細(xì)胞通過外加誘導(dǎo)已經(jīng)轉(zhuǎn)變?yōu)轭愃婆咛ジ杉?xì)胞的階段，包括利用轉(zhuǎn)基因或同源重組手段加入一段表達(dá)熒光蛋白(如本文中的GFP)或者抗性的序列，這段序列處在胚胎干細(xì)胞特異表達(dá)的ー些基因的啟動(dòng)子的控制下，故而可以在細(xì)胞到達(dá)胚胎干細(xì)胞狀態(tài)時(shí)激活這段熒光蛋白或抗性基因的表達(dá)，從而使這個(gè)細(xì)胞具有某些可以被檢測的性狀特征(如發(fā)出綠光)而區(qū)別于其他未重編程至該狀態(tài)的細(xì)胞。本領(lǐng)域技術(shù)常用的報(bào)告基因包括綠色熒光蛋白，抗性基因例如氨芐青霉素抗性基因等。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以根據(jù)細(xì)胞的培養(yǎng)條件和用途選擇適合于各種實(shí)施方案的報(bào)告基因。參考例如Young II Yeom等人，Germlineregulatory element of Oct-4 specmc ior the totipotent cycle 01 embryonalcells，Development 122，000-000 (1996)，Printed in Great Britain, The company ofBiologists Limited 1996，881_894頁；Shin-yaHatano等人，Pluripotential competenceof cells associated with Nanog activation,Mechanisms of Development 122(2005)，67-79。本文所 述的檢測細(xì)胞多能性的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的，參見例如 Yamanaka，S. Strategies and new developments in the generation ofpatient-specific pluripotent stem cells. Cell Stem Cell 1，39-49 (2007)等。所述方法包括鑒定多能性分子標(biāo)記的表達(dá)、細(xì)胞的甲基化狀態(tài)檢測、胚胎小體EB的形成、畸胎瘤的形成以及施用經(jīng)誘導(dǎo)的多能性干細(xì)胞形成嵌合鼠等等。本文所述的“嵌合鼠”是通過本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知的“嵌合鼠”技術(shù)實(shí)施的。是指將胚胎干細(xì)胞或通過本文技術(shù)獲得的iPS細(xì)胞注射入小鼠囊胚中，使得其與所注射入小鼠的囊胚中的胚胎細(xì)胞混合，共同在代孕母鼠中的子宮內(nèi)生長發(fā)育，小鼠出生后全身上下的各個(gè)組織即由兩種胚胎細(xì)胞共同混合組成，如馬賽克拼圖樣，這樣的小鼠被稱為嵌合鼠(Evans M J，等人；The ability of EK cell to form chimeras after selection ofclones in G418 and some observation on the intergration of retroviral vectorproviral DNA into EK cells[M] ；Cold Spring Harbor Symposia on QuantitativeBiology ；1985 年；Xian MW，Wu BY，Hu XL，Shang KG, Wu HL, 1996. Construction ofchimeric mice of ES cells by microinjection method. Hereditas 18(1):7_10)。使用iPS能否形成嵌合鼠是檢驗(yàn)iPS是否與胚胎干細(xì)胞具有類似性質(zhì)的最直接和最關(guān)鍵的證據(jù)。本文所述的“基礎(chǔ)培養(yǎng)基”為人工制備的含有糖類、氨基酸、無機(jī)鹽、維生素、脂質(zhì)等細(xì)胞生長所需營養(yǎng)物質(zhì)的培養(yǎng)品。本發(fā)明所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基包括Dulbecco’ s ModifiedEagle，s Medium(DMEM)，Minimal Essential Medium (MEM)，Basal Medium Eagle(BME)，F(xiàn)-10，F(xiàn)-12，RPMI 1640，Glasgow’ s Minimal Essential Medium (GMEM)，a MinimalEssential Medium( a MEM), Iscove，s Modified Dulbecco，s Medium 和 M199 等，但不僅限于上述基礎(chǔ)培養(yǎng)基，其中優(yōu)選的基礎(chǔ)培養(yǎng)基為高糖DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基。本文所述c-Jun全長的氨基酸序列(SEQ ID NO 1) :(1-334)I mtakmettfyddalnasfIqsesgaygysnpkilkqsmtlnladpvgslkphlraknsdl61 Itspdvgllkl aspelerlii qssnghittt ptptqfIcpk nvtdeqegfa egfvralae121 lhsqntlpsv tsaaqpvsga gmvapavasv agagggggys aslhseppvy anlsnfnpga181 lssgggapsygaaglafpsqpqqqqqppqpphhlpqqipvqhprlqalkeepqtvpempg241 etpplspidmesqerikaerkrmrnriaaskcrkrkleriarleekvktlkaqnselast301 anmlreqvaq lkqkvmnhvn sgcqlmltqq Iqtf本文所述c-JunDN 截短型(170-334)序列(SEQ ID NO :2)yanlsnfnpgalssgggapsygaaglafpsqpqqqqqppqpphhlpqqipvqhprlqalkeepqtvpempgetpplspidmesqerikaerkrmrnriaaskcrkrkleriarleekvktlkaqnselastanmlreqvaqlkqkvmnhvnsgcqlmltqqlqtf本文所述c-Jun-Bzip (1-256)序列(SEQ ID NO :3):I mtakmettfyddalnasflqsesgaygysnpkilkqsmtlnladpvgslkphlraknsdl61 tspdvgllklaspelerliiqssnghitttptptqflcpknvtdeqegfaegfvralae121 lhsqntlpsvtsaaqpvsgagmvapavasvagagggggysaslhseppvyanlsnfnpga181 lssgggapsygaaglafpsqpqqqqqppqpphhlpqqipvqhprlqalkeepqtvpempg
241 etpplspidmesqeri本文所述c-Jun全長的cDNA序列(SEQ ID NO 4)ATGACTGCAAAGATGGAAACGACCTTCTACGACGATGCCCTCAACGCCTCGTTCCTCCAGTCCGAGAGCGGTGCCTACGGCTACAGTAACCCTAAGATCCTAAAACAGAGCATGACCTTGAACCTGGCCGACCCGGTGGGCAGTCTGAAGCCGCACCTCCGCGCCAAGAACTCGGACCTTCTCACGTCGCCCGACGTCGGGCTGCTCAAGCTGGCGTCGCCGGAGCTGGAGCGCCTGATCATCCAGTCCAGCAATGGGCACATCACCACTACACCGACCCCCACCCAGTTCTTGTGCCCCAAGAACGTGACCGACGAGCAGGAGGGCTTCGCCGAGGGCTTCGTGCGCGCCCTGGCTGAACTGCATAGCCAGAACACGCTTCCCAGTGTCACCTCCGCGGCACAGCCGGTCAGCGGGGCGGGCATGGTGGCTCCCGCGGTGGCCTCAGTAGCAGGCGCTGGCGGCGGTGGTGGCTACAGCGCCAGCCTGCACAGTGAGCCTCCGGTCTACGCCAACCTCAGCAACTTCAACCCGGGTGCGCTGAGCAGCGGCGGTGGGGCGCCCTCCTATGGCGCGGCCGGGCTGGCCTTTCCCTCGCAGCCGCAGCAGCAGCAGCAGCCGCCTCAGCCGCCGCACCACTTGCCCCAACAGATCCCGGTGCAGCACCCGCGGCTGCAAGCCCTGAAGGAAGAGCCGCAGACCGTGCCGGAGATGCCGGGAGAGACGCCGCCCCTGTCCCCTATCGACATGGAGTCTCAGGAG CGGATCAAGGCAGAGAGGAAGCGCATGAGGAACCGCATTGCCGCCTCCAAGTGCCGGAAAAGGAAGCTGGAGCGGATCGCTCGGCTAGAGGAAAAAGTGAAAACCTTGAAAGCGCAAAACTCCGAGCTGGCATCCACGGCCAACATGCTCAGGGAACAGGTGGCACAGCTTAAGCAGAAAGTCATGAACCACGTTAACAGTGGGTGCCAACTCATGCTAACGCAGCAGTTGCAAACGTTTTGA實(shí)驗(yàn)例I :C-Jun及其不同的缺失型的構(gòu)建，c-jun截短促進(jìn)SKO誘導(dǎo)的重編程效率。采用常規(guī)分子克隆方法分別將含有c-jun蛋白全長(324個(gè)氨基酸)，及1_256，75-324，170-334，254-334，274-334，170-334等6種不同氨基酸片段的核酸序列克隆到PMXs逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體上。最終克隆片段如圖I所示。將小鼠成纖維細(xì)胞消化后，以每孔2萬細(xì)胞種植到12孔板內(nèi)，分別用OKS或OKSM
及實(shí)施例I中構(gòu)建的表達(dá)載體進(jìn)行感染。感染后用通用的重編程培養(yǎng)基培養(yǎng)，每天更換培養(yǎng)基，并在合適的天數(shù)在熒光顯微鏡下計(jì)算熒光克隆數(shù)。如圖2所示，與空載相比，C-Jun蛋白全長，1-256片段，75_324片段均對(duì)OKS誘導(dǎo)重編程有抑制作用，其中C-Jun蛋白全長抑制最為顯著。而170-334，250-334片段則對(duì)OKS誘導(dǎo)的重編程具有明顯的促進(jìn)作用，其中170—334促進(jìn)作用尤其顯著。170-282和274-334片段對(duì)OKS誘導(dǎo)的重編程有影響但不明顯。在接下來的的實(shí)施例中，我們將c-Jun全長命名為 c-Jun FLJf c-JUN 170-334 片段命名為 c-jun-DN.實(shí)驗(yàn)例2 :c-Jun-DN促進(jìn)SKO誘導(dǎo)的重編程效率，并能替代重編程因子Oct或Sox20c-JunDN分別和三因子SKO或不同因子組合感染MEF細(xì)胞，并在血清或無血清誘導(dǎo)培養(yǎng)體系中進(jìn)行培養(yǎng)，每天更換培養(yǎng)基并在合適的天數(shù)計(jì)算重編程效率。觀察c-JunDN對(duì)重編程效率的影響及對(duì)重編程因子的替代作用。本文所述的“無血清培養(yǎng)基SF1”為申請(qǐng)?zhí)枮?00910038883.4的中國授權(quán)發(fā)明中的iPS-SFl培養(yǎng)基。本文所述的血清培養(yǎng)基為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的小鼠胚胎干細(xì)胞細(xì)胞培養(yǎng)基，主要成分為基礎(chǔ)培養(yǎng)基添加胎牛血清，并添加白細(xì)胞抑制因子LIF。本實(shí)施例的“血清培養(yǎng)基”為申請(qǐng)?zhí)枮?00910038883. 4的中國授權(quán)發(fā)明中的mES培養(yǎng)基。如圖3所示，在無血清或有血清的培養(yǎng)體系下，c-Jun-DN均能提高SKO誘導(dǎo)的重編程效率。如圖4所示，在無血清培養(yǎng)基iPS-SFl條件下，C-JunDN可在沒有Sox2或0ct4的條件下實(shí)現(xiàn)有效重編程。如圖5所示，在無血清培養(yǎng)基iPS-SFl條件下，c-JunDN可與Sox2，Klf4 一起將小鼠成纖維細(xì)胞重編程。如圖6所示，c-Jun-DN替代0ct4產(chǎn)生的KSMJunDN克隆表達(dá)綠色熒光，并具有典型的干細(xì)胞形態(tài)，AP染色也成陽性。所述KSMJunDN為KSM和c-Jun-DN感染的細(xì)胞。如圖7所示，c-Jun-DN替代0ct4產(chǎn)生的KSMJunDN克隆0ct4和Nanog啟動(dòng)子區(qū)均為去甲基化狀態(tài)，與胚胎干細(xì)胞類似。如圖8 所示，c-Jun-DN 替代 0ct4 產(chǎn)生的 KSMJunDN 克隆表達(dá) Sox2, Nanog, Rexl, SSEA-I等多能性分子標(biāo)記物。如圖9所示，c-Jun-DN替代0ct4產(chǎn)生的KSMJunDN克隆具有正確的核型。如圖10所示，c-Jun替代0ct4產(chǎn)生的KSMJunDN克隆能夠產(chǎn)生嵌合體小鼠。上述結(jié)果表明C-JunDN-DN可有效替代0ct4或Sox2將胚胎成纖維細(xì)胞重編程。實(shí)施例3 :c-Jun-DN可以維持干細(xì)胞的多能性。為了研究C-Jun基因在胚胎干細(xì)胞多能性維持中的作用，我們研究了該基因在胚胎干細(xì)胞和成體細(xì)胞及胚胎干細(xì)胞分化過程中的表達(dá)狀況，同時(shí)分析了不同的截短型在胚胎干細(xì)胞多能性維持和分化的影響。分別將小鼠的胚胎成纖維細(xì)胞(MEF)和胚胎干細(xì)胞(ES)提取RNA，再用RT-PCR的方法分析兩種細(xì)胞中c-Jun的表達(dá)量。如圖11顯示，MEF細(xì)胞中c-Jun的表達(dá)量遠(yuǎn)高于胚胎干細(xì)胞中的表達(dá)量。表明c-Jun因子可能不利于多能性的維持。將ES細(xì)胞采用標(biāo)準(zhǔn)的方式分化為擬胚體(EB)，在不同的天數(shù)收取樣品，提取RNA，采用RT-PCR的方法分析兩種細(xì)胞中c-Jun的表達(dá)量。如圖12所示，ES細(xì)胞向EB分化的過程中c-Jun的表達(dá)量不斷上調(diào)。將ES細(xì)胞在沒有LIF的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，在不同天數(shù)收取細(xì)胞樣品，提取RNA，采用RT-PCR的方法分析兩種細(xì)胞中c-Jun的表達(dá)量.如圖13所示，ES細(xì)胞分化過稱中，c-Jun的表達(dá)量不斷上調(diào)。分別將c-Jun全長,c-Jun (_bZIP), c-JunDN轉(zhuǎn)入Rl中，采用抗性篩選能穩(wěn)定表達(dá)目的基因片段的細(xì)胞系。如圖14所示,c-Jun全長在Rl中過表達(dá),能引起干細(xì)胞的分化,而c_Jun (_bZIP),c-JunDN則不會(huì)引起干細(xì)胞分化。如圖15所示，在撤去LIF的ES培養(yǎng)基里，c-Jun (-bZIP)，c-JunDN能維持細(xì)胞的多能性狀態(tài)，延緩干細(xì)胞分化。以上所述僅為本發(fā)明的實(shí)施例，并非因此限制本發(fā)明的專利范圍，凡是利用本發(fā)明說明書及附圖內(nèi)容所作的等效結(jié)構(gòu)或等效流程變換，或直接或間接運(yùn)用在其他相關(guān)的技術(shù)領(lǐng)域，均同理包括在本發(fā)明的專利保護(hù)范圍內(nèi)。序列表<110>中國科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院
<120>C-Jun的N端缺失誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞的方法和應(yīng)用<160>4<170>PatentIn version 3. 3<210>1<211>333<212>PRT〈213〉小鼠c-jun氨基酸序列〈400〉IMet Thr Ala Lys Met Glu Thr Thr Phe Tyr Asp Asp Ala Leu Asn Ala151015Ser Phe Leu Gln Ser Glu Ser Gly Ala Tyr Gly Tyr Ser Asn Pro Lys202530He Leu Lys Gln Ser Met Thr Leu Asn Leu Ala Asp Pro Val Gly Ser354045Leu Lys Pro His Leu Arg Ala Lys Asn Ser Asp Leu Thr Ser Pro Asp505560Val Gly Leu Leu Lys Leu Ala Ser Pro Glu Leu Glu Arg Leu He Ile65707580Gln Ser Ser Asn Gly His He Thr Thr Thr Pro Thr Pro Thr Gln Phe859095Leu Cys Pro Lys Asn Val Thr Asp Glu Gln Glu Gly Phe Ala Glu Gly100105110Phe Val Arg Ala Leu Ala Glu Leu His Ser Gln Asn Thr Leu Pro Ser115120125Val Thr Ser Ala Ala Gln Pro Val Ser Gly Ala Gly Met Val Ala Pro130135140Ala Val Ala Ser Val Ala Gly Ala Gly Gly Gly Gly Gly Tyr Ser Ala145150155160Ser Leu His Ser Glu Pro Pro Val Tyr Ala Asn Leu Ser Asn Phe Asn165170175Pro Gly Ala Leu Ser Ser Gly Gly Gly Ala Pro Ser Tyr Gly Ala Ala180185190Gly Leu Ala Phe Pro Ser Gln Pro Gln Gln Gln Gln Gln Pro Pro Gln195200205Pro Pro His His Leu Pro Gln Gln He Pro Val Gln His Pro Arg Leu210215220Gln Ala Leu Lys Glu Glu Pro Gln Thr Val Pro Glu Met Pro Gly Glu225230235240Thr Pro Pro Leu Ser Pro He Asp Met Glu Ser Gln Glu Arg He Lys
245250255Ala Glu Arg Lys Arg Met Arg Asn Arg He Ala Ala Ser Lys Cys Arg260265270Lys Arg Lys Leu Glu Arg He Ala Arg Leu Glu Glu Lys Val Lys Thr275280285Leu Lys Ala Gln Asn Ser Glu Leu Ala Ser Thr Ala Asn Met Leu Arg290295300Glu Gln Val Ala Gln Leu Lys Gln Lys Val Met Asn His Val Asn Ser 305310315320Gly Cys Gln Leu Met Leu Thr Gln Gln Leu Gln Thr Phe325330<210>2<211>165<212>PRT〈213〉小鼠c-Jun截短型(170-334)位氨基酸序列<400>2Tyr Ala Asn Leu Ser Asn Phe Asn Pro Gly Ala Leu Ser Ser Gly Gly151015Gly Ala Pro Ser Tyr Gly Ala Ala Gly Leu Ala Phe Pro Ser Gln Pro202530Gln Gln Gln Gln Gln Pro Pro Gln Pro Pro His His Leu Pro Gln Gln354045He Pro Val Gln His Pro Arg Leu Gln Ala Leu Lys Glu Glu Pro Gln505560Thr Val Pro Glu Met Pro Gly Glu Thr Pro Pro Leu Ser Pro He Asp65707580Met Glu Ser Gln Glu Arg He Lys Ala Glu Arg Lys Arg Met Arg Asn859095Arg He Ala Ala Ser Lys Cys Arg Lys Arg Lys Leu Glu Arg He Ala100105110Arg Leu Glu Glu Lys Val Lys Thr Leu Lys Ala Gln Asn Ser Glu Leu115120125Ala Ser Thr Ala Asn Met Leu Arg Glu Gln Val Ala Gln Leu Lys Gln130135140Lys Val Met Asn His Val Asn Ser Gly Cys Gln Leu Met Leu Thr Gln145150155160Gln Leu Gln Thr Phe165<210>3
<211>255<212>PRT〈213〉小鼠c-Jun截短型(1-256)位氨基酸序列<400>3Met Thr Ala Lys Met Glu Thr Thr Phe Tyr Asp Asp Ala Leu Asn Ala151015Ser Phe Leu Gln Ser Glu Ser Gly Ala Tyr Gly Tyr Ser Asn Pro Lys202530
He Leu Lys Gln Ser Met Thr Leu Asn Leu Ala Asp Pro Val Gly Ser354045Leu Lys Pro His Leu Arg Ala Lys Asn Ser Asp Leu Thr Ser Pro Asp505560Val Gly Leu Leu Lys Leu Ala Ser Pro Glu Leu Glu Arg Leu He Ile65707580Gln Ser Ser Asn Gly His He Thr Thr Thr Pro Thr Pro Thr Gln Phe859095Leu Cys Pro Lys Asn Val Thr Asp Glu Gln Glu Gly Phe Ala Glu Gly100105110Phe Val Arg Ala Leu Ala Glu Leu His Ser Gln Asn Thr Leu Pro Ser115120125Val Thr Ser Ala Ala Gln Pro Val Ser Gly Ala Gly Met Val Ala Pro130135140Ala Val Ala Ser Val Ala Gly Ala Gly Gly Gly Gly Gly Tyr Ser Ala145150155160Ser Leu His Ser Glu Pro Pro Val Tyr Ala Asn Leu Ser Asn Phe Asn165170175Pro Gly Ala Leu Ser Ser Gly Gly Gly Ala Pro Ser Tyr Gly Ala Ala180185190Gly Leu Ala Phe Pro Ser Gln Pro Gln Gln Gln Gln Gln Pro Pro Gln195200205Pro Pro His His Leu Pro Gln Gln He Pro Val Gln His Pro Arg Leu210215220Gln Ala Leu Lys Glu Glu Pro Gln Thr Val Pro Glu Met Pro Gly Glu225230235240Thr Pro Pro Leu Ser Pro He Asp Met Glu Ser Gln Glu Arg Ile245250255<210>4〈211>1005<212>DNA
〈213〉人工序列<400>4atgactgcaa agatggaaac gaccttctac gacgatgccc tcaacgcctc gttcctccag60tccgagagcg gtgcctacgg ctacagtaac cctaagatcc taaaacagag catgaccttg120aacctggccg acccggtggg cagtctgaag ccgcacctcc gcgccaagaa ctcggacctt180
ctcacgtcgc ccgacgtcgg gctgctcaag ctggcgtcgc cggagctgga gcgcctgatc240atccagtcca gcaatgggca catcaccact acaccgaccc ccacccagtt cttgtgcccc300aagaacgtga ccgacgagca ggagggcttc gccgagggct tcgtgcgcgc cctggctgaa360ctgcatagcc agaacacgct tcccagtgtc acctccgcgg cacagccggt cagcggggcg420ggcatggtgg ctcccgcggt ggcctcagta gcaggcgctg gcggcggtgg tggctacagc480gccagcctgc acagtgagcc tccggtctac gccaacctca gcaacttcaa cccgggtgcg540ctgagcagcg gcggtggggc gccctcctat ggcgcggccg ggctggcctt tccctcgcag600ccgcagcagc agcagcagcc gcctcagccg ccgcaccact tgccccaaca gatcccggtg660cagcacccgc ggctgcaagc cctgaaggaa gagccgcaga ccgtgccgga gatgccggga720gagacgccgc ccctgtcccc tatcgacatg gagtctcagg agcggatcaa ggcagagagg780aagcgcatga ggaaccgcat tgccgcctcc aagtgccgga aaaggaagct ggagcggatc840gctcggctag aggaaaaagt gaaaaccttg aaagcgcaaa actccgagct ggcatccacg900gccaacatgc tcagggaaca ggtggcacag cttaagcaga aagtcatgaa ccacgttaac960agtgggtgcc aactcatgct aacgcagcag ttgcaaacgt tttga100權(quán)利要求
1.C-Jun的N端缺失與多能干細(xì)胞誘導(dǎo)因子聯(lián)合使用在誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞過程中的應(yīng)用，所述c-Jun的N端缺失為AP-I家族蛋白c-Jun的170到274位氨基酸到末端334位氨基酸的截短或其對(duì)應(yīng)的核酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的應(yīng)用，其特征在于，所述多能干細(xì)胞誘導(dǎo)因子為Klf4、Sox2、0ct4o
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的應(yīng)用，其特征在于，所述多能干細(xì)胞誘導(dǎo)因子為Klf4、Sox2、C-MyCo
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的應(yīng)用，其特征在于，所述多能干細(xì)胞誘導(dǎo)因子為Klf4、0ct4、C-MyCo
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的應(yīng)用，其特征在于，所述多能干細(xì)胞誘導(dǎo)因子為Klf4、Sox2。
6.使用AP-I家族的c-Jun的N端缺失誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞的方法，其特征在于， a、將含有供體c-Jun蛋白氨基酸序列的170到274位氨基酸到末端334位氨基酸對(duì)應(yīng)的核酸序列克隆到表達(dá)載體上； b、用步驟a所得表達(dá)載體與多能干細(xì)胞誘導(dǎo)因子感染供體體細(xì)胞使其重編程為多能干細(xì)胞。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的使用AP-I家族的c-Jun的N端缺失誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞的方法，其特征在于，所述步驟a具體為將含有供體c-Jun蛋白氨基酸序列的254-334，274-334，170-334位氨基酸片段對(duì)應(yīng)的核酸序列克隆到表達(dá)載體上。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的使用AP-I家族的c-Jun的N端缺失誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞的方法，其特征在于，所述多能干細(xì)胞誘導(dǎo)因子為Klf4、Sox2、0ct4。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的使用AP-I家族的c-Jun的N端缺失誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞的方法，其特征在于，所述多能干細(xì)胞誘導(dǎo)因子為Klf4、Sox2。
10.根據(jù)權(quán)利要求6所述的使用AP-I家族的c-Jun的N端缺失誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞的方法，其特征在于，所述供體體細(xì)胞為小鼠成纖維細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域的干細(xì)胞研究，具體涉及AP-1家族蛋白c-Jun截?cái)嘈驼T導(dǎo)多能性干細(xì)胞的方法及其應(yīng)用。本發(fā)明的技術(shù)方案為提供一種c-Jun的N端缺失與多能干細(xì)胞誘導(dǎo)因子聯(lián)合使用在誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞過程中的應(yīng)用，所述c-Jun的N端缺失為AP-1家族蛋白c-Jun的170位氨基酸至334位氨基酸的一系列截短的氨基酸序列或其對(duì)應(yīng)的核酸序列。本發(fā)明在誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞的過程中使用了AP-1家族蛋白的c-Jun蛋白的N端截短型，提供了一種高效率的重編程誘導(dǎo)體系，替代核心重編程因子的小分子或基因，將對(duì)揭示核心重編程因子在重編中的功能起到推動(dòng)作用。
文檔編號(hào)C12N5/10GK102816796SQ20121032457
公開日2012年12月12日 申請(qǐng)日期2012年9月4日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月4日
發(fā)明者裴端卿, 韓慶凱, 劉晶, 陳捷凱, 韋備, 彭梅秀 申請(qǐng)人:中國科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院