專利名稱：一株放射形根瘤菌及其胞外多糖與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一株新的放射形根瘤菌菌株和由該菌株發(fā)酵產(chǎn)生的胞外多糖，以及該多糖的制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
眾所周知，某些特定的微生物(如乳酸菌、土壤桿菌、根瘤菌)在生長(zhǎng)過程中，可以產(chǎn)生多種類型的多糖，根據(jù)這些多糖所處的位置，可以分為莢膜多糖和分泌到生長(zhǎng)環(huán)境中的多糖，又稱為胞外多糖。這些多糖對(duì)產(chǎn)生菌在自然環(huán)境中具有保護(hù)作用，可以使產(chǎn)生菌避免受到干燥、紫外輻射、滲透壓變化、抗生素、噬菌體侵染所引起的傷害以及在體內(nèi)抗吞噬作用。最近的研究發(fā)現(xiàn)，部分土壤桿菌所產(chǎn)生的胞外多糖具有作為增稠劑和/或膠凝劑的作用，如放射形土壤桿菌1-2001菌株(放射形根瘤菌舊稱為放射形土壤桿菌)所產(chǎn)生的胞外多糖在膳食制品中用于高端配料的制作。因此，這些微生物來(lái)源的多糖成為某些增稠劑和 /或膠凝劑的重要來(lái)源，開發(fā)和利用這些胞外多糖也日益成為食品添加劑研究領(lǐng)域的前沿。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一株新的放射形根瘤菌菌株和由該菌株所產(chǎn)生的胞外多糖，以及該胞外多糖的制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的。本發(fā)明提供的技術(shù)方案之一是一株新的放射形根瘤菌菌株，其是保藏號(hào)為CGMCCNO. 4524 的放射形根瘤菌(Rhizobium radiobacter) SlO 菌株。該菌株經(jīng)16S rRNA基因測(cè)序的結(jié)果如SEQ ID NO. I所示。本發(fā)明提供的技術(shù)方案之二是一種放射形根瘤菌的胞外多糖，所述的胞外多糖主要由半乳糖和葡萄糖組成，所述的半乳糖和葡萄糖的摩爾比為I. 00 4. 60 6. 40，該胞外多糖的平均重量分子量在3. 5 X IO3 3. 8 X IO6道爾頓之間。本發(fā)明中，所述的胞外多糖為一種純白色的絲狀物或粉末，在λ=195ηπι處有強(qiáng)烈的吸收；10. Omg/mL的所述多糖的水溶液澄清透明、無(wú)色、無(wú)味，pH值為6. O 7. I。本發(fā)明中，所述的胞外多糖可以由前述保藏號(hào)為CGMCC NO. 4524的放射形根瘤菌(Rhizobium radiobacter) SlO菌株產(chǎn)生,也可以由其它的可以產(chǎn)胞外多糖的放射形根瘤菌菌株產(chǎn)生。較佳地，所述的胞外多糖由前述保藏號(hào)為CGMCC NO. 4524的放射形根瘤菌(Rhizobium radiobacter) SlO 菌株所產(chǎn)生。本發(fā)明中，較佳地，所述的胞外多糖中平均重量分子量在2. OXlO6 3. 8 X IO6道爾頓之間的胞外多糖占80 85%，平均重量分子量在3. 5 X IO3 2. OX IO6道爾頓之間的胞外多糖占15 20%，以上百分比均指占總的胞外多糖的重量百分比。在本發(fā)明的一較佳實(shí)例中，本發(fā)明的放射形根瘤菌胞外多糖中的半乳糖和葡萄糖的摩爾比為I. 00 5. 19 ;平均重量分子量為3，377，709道爾頓的胞外多糖占83. 97%，平均重量分子量為6，596道爾頓的胞外多糖占16. 03%,以上百分比均指占總的胞外多糖的重量百分比。
在本發(fā)明的另一較佳實(shí)例中，本發(fā)明的放射形根瘤菌胞外多糖中的半乳糖和葡萄糖的摩爾比為I. 00 5. 23 ;平均重量分子量為2，948，419道爾頓的胞外多糖占87. 90%，平均重量分子量為3，578道爾頓的胞外多糖占12. 10%,以上百分比均指占總的胞外多糖的重
量百分比。本發(fā)明提供的技術(shù)方案之三是一種放射形根瘤菌胞外多糖的制備方法。本發(fā)明中，所述的制備方法可以是將所述的放射形根瘤菌按照現(xiàn)有技術(shù)內(nèi)常規(guī)的培養(yǎng)方法培養(yǎng)得到發(fā)酵液，然后將發(fā)酵液采用常規(guī)的多糖分離方法分離得到胞外多糖。較佳地，所述的制備方法包括如下步驟I)發(fā)酵，即將放射形根瘤菌于24 38°C下，在無(wú)菌培養(yǎng)基中發(fā)酵24 120小時(shí)得發(fā)酵液；其中，所述的無(wú)菌培養(yǎng)基為下列任一種①固形物含量為3 12%(w/w)的脫脂乳；②3 12%(w/w)脫鹽乳清和③常規(guī)的用于培養(yǎng)放射形根瘤菌的無(wú)菌合成培養(yǎng)基； 2)滅酶，即將步驟I)制得的發(fā)酵液在95 100°C加熱10 30分鐘，以滅活發(fā)酵液中使多糖發(fā)生降解的酶；3)收獲上清液，即在經(jīng)過步驟2)滅酶處理后的發(fā)酵液中加入三氯乙酸，使其終濃度達(dá)到4 10% (w/v)，靜置8 16小時(shí)，離心獲得發(fā)酵上清液；4)沉淀、透析和干燥，即在步驟3)獲得的上清液中加入2 4倍體積的體積百分?jǐn)?shù)為80 100%的乙醇，離心或過濾收集沉淀物并將沉淀物溶于蒸餾水，用截留分子量為10, 000D的透析袋在蒸餾水中透析48 72小時(shí)，每12 24小時(shí)換水一次，在溫度不超過105°C下干燥或者真空冷凍干燥得胞外多糖粗品。本發(fā)明中，所述的胞外多糖粗品包括85 95%的前述放射形根瘤菌胞外多糖和5 15%的游離蛋白，所述的百分比為質(zhì)量百分比。本發(fā)明中，步驟I)中所述常規(guī)的用于培養(yǎng)放射形根瘤菌的無(wú)菌合成培養(yǎng)基由碳水化合物、氮源和無(wú)機(jī)鹽組成；較佳地，所述的碳水化合物選自葡萄糖、蔗糖和乳糖中的任一種或多種，所述的氮源選自胰蛋白胨和/或酵母浸出物，所述的無(wú)機(jī)鹽選自MgCl2和磷酸鹽中的任一種或多種；更佳地，所述的限定化學(xué)組成的無(wú)菌合成培養(yǎng)基包括下列各組分10g/L蔗糖，3g/LKH2P04，5g/LNa2HP04，2. 5g/L蛋白胨和 O. 25g/L MgSO4 ·7Η20，其pH值為 7. O。本發(fā)明中，所述的步驟I)還可以為將用平板培養(yǎng)活化后的放射形根瘤菌接種于所述的無(wú)菌培養(yǎng)基中，用同樣的培養(yǎng)條件培養(yǎng)得到含有多糖的發(fā)酵液；或者，將所述的放射形根瘤菌接種于所述的無(wú)菌培養(yǎng)基中發(fā)酵6 48小時(shí)，獲得發(fā)酵種子液，再將發(fā)酵種子液接種于上述無(wú)菌培養(yǎng)基發(fā)酵,得到發(fā)酵液。在本發(fā)明的一較佳實(shí)例中，所述的步驟I)為將保藏號(hào)為CGMCC NO. 4524的放射形根瘤菌(Rhizobium radiobacter) SlO菌株于24 38°C下，在所述無(wú)菌培養(yǎng)基中發(fā)酵6 48小時(shí)，獲得發(fā)酵種子液，再按O. 5 8% (v/v)的接種量接種于所述的無(wú)菌培養(yǎng)基發(fā)酵，得到發(fā)酵液。更佳地，所述的步驟I)為將保藏號(hào)為CGMCC NO. 4524的放射形根瘤菌(Rhizobium radiobacter) SlO菌株于26 35°C下，在所述無(wú)菌培養(yǎng)基中發(fā)酵20 26小時(shí)，獲得發(fā)酵種子液，再按2 4%(v/v)的接種量接種于所述無(wú)菌培養(yǎng)基發(fā)酵，得到發(fā)酵液。最佳地，所述的步驟I)為將保藏號(hào)為CGMCC NO. 4524的放射形根瘤菌(Rhizobium radiobacter) SlO菌株于28 33°C下，在所述無(wú)菌培養(yǎng)基中發(fā)酵24小時(shí)，獲得發(fā)酵種子液，再按3% (v/v)的接種量接種于所述無(wú)菌培養(yǎng)基發(fā)酵，得到發(fā)酵液。在本發(fā)明的另一較佳實(shí)例中，本發(fā)明的制備方法包括如下步驟I)將保藏號(hào)為 CGMCC NO. 4524 的放射形根瘤菌(Rhizobium radiobacter) SlO 菌株于24 38°C下，在無(wú)菌培養(yǎng)基中發(fā)酵24 120小時(shí)得發(fā)酵液；2)將上述發(fā)酵液在95 100°C加熱10 15分鐘，然后離心或過濾獲得發(fā)酵上清液；3)加入2 3倍體積的體積百分?jǐn)?shù)為95%乙醇于上述發(fā)酵上清液中，離心或過濾收集沉淀物，在溫度不超過105°C下干燥得胞外多糖粗品；其中，步驟I)所述發(fā)酵的溫度優(yōu)選25 35°C，更優(yōu)選28°C;所述發(fā)酵的時(shí)間優(yōu)選24 120小時(shí)，更優(yōu)選120小時(shí)。
本發(fā)明所獲得的胞外多糖粗品可以直接碾碎進(jìn)行包裝，也可以作為增稠劑、膠凝劑或多糖粉的生產(chǎn)原料使用。本發(fā)明中，較佳地，在步驟4)之后還包括步驟5):將制得的胞外多糖粗品進(jìn)行進(jìn)一步的純化，以去除蛋白和其它雜質(zhì)。本發(fā)明中，所述進(jìn)一步的純化可以是現(xiàn)有技術(shù)中的任何常規(guī)的分離純化的步驟。較佳地，所述進(jìn)一步的純化是采用三氯乙酸法去除蛋白和采用透析法去除其它雜質(zhì)。所述的三氯乙酸法為將胞外多糖粗品用50 80°C蒸餾水溶解，使胞外多糖粗品的終濃度為
O.3 I. 5% (w/w)，待溶液冷卻至15 25°C時(shí)加入三氯乙酸，使三氯乙酸的最終質(zhì)量濃度為4 10%，再將溶液于O 8°C放置過夜，離心或過濾去除沉淀物。所述的透析法為將去除沉淀后的胞外多糖溶液用截留分子量為10，000道爾頓的透析膜在O 8°C透析48 72小時(shí)；在透析過程中較佳地還可以進(jìn)行多次換水。更佳地，步驟5)還包括，經(jīng)過透析后的多糖溶液還可以采用凝膠排阻層析的方法進(jìn)行更進(jìn)一步的純化。本發(fā)明中，純化后的多糖溶液可進(jìn)行干燥以獲得粉末狀的多糖，干燥方法可以為本領(lǐng)域常規(guī)，較佳地選自熱風(fēng)干燥、低溫干燥、冷風(fēng)干燥、冷凍干燥、真空干燥和真空冷凍干燥中的任一種，更佳的干燥方法選自冷風(fēng)干燥、冷凍干燥、真空干燥和真空冷凍干燥中的任一種。本發(fā)明提供的技術(shù)方案之四是一種增稠組合物，其包括前述胞外多糖和生理學(xué)上可接受的載體。本發(fā)明中，所述的生理學(xué)上可接受的載體為常規(guī)，可以是食品領(lǐng)域常規(guī)的增稠劑輔料，如食品膠、淀粉等，也可以是其他領(lǐng)域符合國(guó)家相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)的增稠劑輔料。本發(fā)明提供的技術(shù)方案之五是前述胞外多糖或增稠組合物在食品、醫(yī)藥和相關(guān)領(lǐng)域的應(yīng)用。本發(fā)明中，由于放射形根瘤菌(Rhizobium radiobacter)S10胞外多糖或多糖粗品能很好的溶于水形成膠態(tài)水溶性聚合物，能在低濃度時(shí)具有很高的粘度、很好的表面活性、很好的蛋白質(zhì)可混性以及極好的穩(wěn)定性/乳化性?；谶@些性質(zhì)，本發(fā)明所述胞外多糖或胞外多糖粗品可以被用作增稠劑、穩(wěn)定劑、懸浮劑、乳化劑或潤(rùn)滑劑及其相關(guān)用途。本發(fā)明的積極進(jìn)步效果在于本發(fā)明公開了一株新的放射形根瘤菌菌株及其胞外多糖與應(yīng)用，同時(shí)公開了該菌株胞外多糖的制備方法。本發(fā)明所述菌株的胞外多糖水溶性好，且在低濃度時(shí)具有很好的粘度、彳艮好的表面活性、很好的蛋白質(zhì)可混性以及極好的穩(wěn)定性/乳化性。本發(fā)明人經(jīng)過嚴(yán)密的實(shí)驗(yàn)分析了所述胞外多糖的理化性質(zhì)，并且驗(yàn)證了其作為食品添加劑和化妝品添加劑的效果，表明其具有廣闊的應(yīng)用前景。牛物材料的保藏本發(fā)明的放射形根瘤菌菌株，于2010年12月30日保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)，地址為北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，保藏號(hào)為CGMCC NO. 4524,名稱為放射形根瘤菌(Rhizobium radiobacter) S10。


以下結(jié)合

本發(fā)明的特征和有益效果。 圖I為本發(fā)明放射形根瘤菌SlO胞外多糖粗品在DEAE-S印harose CL-6B離子交換柱上的洗脫曲線圖；其中，縱坐標(biāo)為洗脫液經(jīng)過硫酸-苯酚比色法在n=490nm處的光吸收值0D,橫坐標(biāo)為試管號(hào)。圖2為本發(fā)明放射形根瘤菌SlO胞外多糖帶電荷部分峰2在S印harose4B分子篩凝膠柱上的洗脫曲線圖；其中，縱坐標(biāo)為洗脫液經(jīng)過硫酸-苯酚比色法在n=490nm處的光吸收值0D,橫坐標(biāo)為試管號(hào)。圖3為不同濃度下本發(fā)明放射形根瘤菌SlO胞外多糖粗品在不同剪切速率下(I/s)的粘度，其中濃度從上到下分別為O. 25%,O. 5%, I. 0%，測(cè)定溫度為25。。。圖4為不同轉(zhuǎn)速下(Ι/s)各樣品的粘度值；其中系列C為發(fā)酵乳1，系列I為發(fā)酵乳2，系列2為發(fā)酵乳3，系列3為發(fā)酵乳4。
具體實(shí)施例方式下面用實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步說明本發(fā)明，但并不因此將本發(fā)明限制在所述的實(shí)施例范圍之中。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，均按照本領(lǐng)域常規(guī)方法和條件，或按照商品說明書選擇；下列實(shí)施例中未特別說明的實(shí)驗(yàn)材料，均常規(guī)市售可得。實(shí)施例I菌株的獲得本發(fā)明中的放射形根瘤菌菌株可通過如下途徑獲得從新疆伊寧采集的開菲爾發(fā)酵乳中取出開菲爾顆粒，在無(wú)菌生理鹽水中用無(wú)菌藥勺搗碎，然后以無(wú)菌生理鹽水系列稀釋，取ImL稀釋后的菌液加入到培養(yǎng)皿中，注入46°C、含有2% (w/v)脫脂乳的瓊脂平板培養(yǎng)基中，待平板完全凝固后，30°C培養(yǎng)48小時(shí)。選取拉絲性好、呈黏液狀且有明顯突起的菌落，轉(zhuǎn)接到含10% (w/v)滅菌脫脂乳的液體培養(yǎng)基中，30°C培養(yǎng)48小時(shí)，加入三氯乙酸，使其終濃度達(dá)到4% (w/v)，4°C靜置10小時(shí)，離心(4°C，9000rpm)取上清加入3倍體積預(yù)冷的乙醇沉淀過夜，離心(4°C，9000rpm)取沉淀，透析凍干，即為胞外多糖粗品，苯酚硫酸法測(cè)多糖粗品產(chǎn)量，從而篩選出一株高產(chǎn)胞外多糖的菌株。該菌株為革蘭氏陰性無(wú)芽孢桿菌，好氣、有鞭毛。在營(yíng)養(yǎng)瓊脂及脫脂乳平板培養(yǎng)基上形成光滑、黏液狀菌落且有明顯突起，大多連成一片。該菌株16S rRNA基因序列在基因文庫(kù)中的進(jìn)入號(hào)為JX498970 (Genebank accessnumber JX498970)，根據(jù)其生理生化特性及16S rDNA序列分析的結(jié)果，經(jīng)中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)鑒定為(Rhizobium radiobacter)SlO菌株,并進(jìn)行了保藏，保藏號(hào)為CGMCC NO. 4524。
該菌株的微生物學(xué)特性如表I所示表I (Rhizobium radiobacter) SlO 菌株理化試驗(yàn)結(jié)果
權(quán)利要求
1.一株放射形根瘤菌(Rhizobium radiobacter) S10,其特征在于,其保藏號(hào)為CGMCCNO. 4524。
2.ー種放射形根瘤菌的胞外多糖，其特征在干，所述的胞外多糖主要由半乳糖和葡萄糖組成，所述的半乳糖和葡萄糖的摩爾比為I. 00 4. 60 6. 40，所述胞外多糖的平均重量分子量在3. 5 X IO3 3. 8 X IO6道爾頓之間。
3.如權(quán)利要求2所述的胞外多糖，其特征在于，所述的胞外多糖由保藏號(hào)為CGMCCNO. 4524的放射形根瘤菌(Rhizobium radiobacter) S 10菌株所產(chǎn)生；所述的胞外多糖中平均重量分子量在2. OX IO6 3. 8 X IO6道爾頓之間的胞外多糖占80 85%，平均重量分子量在3. 5X IO3 2. OXlO6道爾頓之間的胞外多糖占15 20%，以上百分比均指占總的胞外多糖的重量百分比。
4.ー種放射形根瘤菌胞外多糖的制備方法，其特征在于，其包括如下步驟 1)將放射形根瘤菌于24 38°C下，在無(wú)菌培養(yǎng)基中發(fā)酵24 120小時(shí)得發(fā)酵液；其中，所述的無(wú)菌培養(yǎng)基為下列任ー種①固形物含量為3 12%(w/w)的脫脂乳，②3 12%(w/w)脫鹽乳清和③常規(guī)的用于培養(yǎng)放射形根瘤菌的無(wú)菌合成培養(yǎng)基； 2)將步驟I)制得的發(fā)酵液在95 100°C加熱10 30分鐘，以滅活發(fā)酵液中使多糖發(fā)生降解的酶； 3)在經(jīng)過步驟2)滅酶處理后的發(fā)酵液中加入三氯こ酸，使其終濃度達(dá)到4 10%(w/v)，靜置8 16小時(shí)，尚心獲得發(fā)酵上清液； 4)在步驟3)獲得的上清液中加入2 4倍體積的體積百分?jǐn)?shù)為80 100%的こ醇，離心或過濾收集沉淀物并將沉淀物溶于水，用截留分子量為10，000D的透析袋在水中透析48 72小時(shí)，每12 24小時(shí)換水一次，在溫度不超過105°C下干燥或者真空冷凍干燥得胞外多糖粗品。
5.如權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于，步驟I)中所述的放射形根瘤菌是保藏號(hào)為CGMCC NO. 4524的放射形根瘤菌(Rhizobium radiobacter)S10菌株；所述發(fā)酵中放射形根瘤菌的接種量為0. 5 8% (v/v)。
6.如權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于，所述的步驟(I)為將保藏號(hào)為CGMCCNO. 4524的放射形根瘤菌(Rhizobium radiobacter) SlO菌株于24 38°C下，在所述無(wú)菌培養(yǎng)基中發(fā)酵6 48小時(shí)，獲得發(fā)酵種子液，再按0. 5 8% (v/v)的接種量接種于所述的無(wú)菌培養(yǎng)基發(fā)酵，得到發(fā)酵液。
7.如權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于，其在步驟4)之后還包括步驟5):將制得的胞外多糖粗品進(jìn)行進(jìn)一步的純化，以去除蛋白和其它雜質(zhì)；所述進(jìn)ー步的純化是采用三氯こ酸法去除蛋白和采用透析法去除其它雜質(zhì)。
8.如權(quán)利要求7所述的制備方法，其特征在于，所述的三氯こ酸法為將胞外多糖粗品用5(T80°C蒸餾水溶解，使其濃度為0. 3 I. 5% (w/w)，待溶液冷卻至15 25°C時(shí)加入三氯こ酸，使三氯こ酸的最終質(zhì)量濃度為4 10%，在0 8°C放置過夜，離心或過濾去除沉淀物；所述的透析法為將去除沉淀后的胞外多糖溶液用截留分子量為10，000道爾頓的透析膜在0 8°C透析48 72小時(shí)。
9.ー種增稠組合物，其特征在于，其包括如權(quán)利要求2 3任一項(xiàng)所述胞外多糖、常規(guī)增稠劑輔料和生理學(xué)上可接受的載體。
10.如權(quán)利要求9所述增稠組合物或如權(quán)利要求2 3任一項(xiàng)所述胞外多糖在食品、醫(yī)藥和相關(guān)領(lǐng)域的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一株新的放射形根瘤菌菌株和其所產(chǎn)生的胞外多糖，以及該胞外多糖的制備方法和應(yīng)用。所述的菌株是保藏號(hào)為CGMCC NO.4524的放射形根瘤菌(Rhizobium radiobacter)S10菌株；所述的胞外多糖主要由半乳糖和葡萄糖組成，其摩爾比為1.00︰4.60～6.40，該胞外多糖的平均重量分子量在3.5×103～3.8×106道爾頓之間。本發(fā)明所述放射形根瘤菌菌株的胞外多糖水溶性好，且在低濃度時(shí)具有很好的粘度、很好的表面活性、很好的蛋白質(zhì)可混性以及極好的穩(wěn)定性/乳化性。
文檔編號(hào)C12N1/20GK102816724SQ20121032471
公開日2012年12月12日 申請(qǐng)日期2012年9月4日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月4日
發(fā)明者吳正鈞, 周方方, 季紅, 韓瑨, 游春蘋, 艾連中, 陳衛(wèi) 申請(qǐng)人:光明乳業(yè)股份有限公司