一種恢復(fù)間充質(zhì)干細(xì)胞全能性的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種恢復(fù)間充質(zhì)干細(xì)細(xì)胞全能性的培養(yǎng)方法。本發(fā)明提供了一種恢復(fù)間充質(zhì)干細(xì)細(xì)胞全能性的方法，包括如下步驟：1）將全能性降低的離體間充質(zhì)干細(xì)胞懸滴培養(yǎng)，得到懸滴培養(yǎng)后的細(xì)胞；2）將所述懸滴培養(yǎng)后的細(xì)胞繼續(xù)懸浮培養(yǎng)，實(shí)現(xiàn)恢復(fù)間充質(zhì)干細(xì)細(xì)胞全能性。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明提供了一種恢復(fù)間充質(zhì)干細(xì)胞全能性的方法，具體采用3D培養(yǎng)，將經(jīng)過多次傳代培養(yǎng)的間充質(zhì)干細(xì)胞（全能性降低的離體間充質(zhì)干細(xì)胞）經(jīng)3D培養(yǎng)處理后，其增大的體積逐漸恢復(fù)、細(xì)胞活性增強(qiáng)、克隆能力和分化能力增強(qiáng)、其旁分泌作用也有所提高，使已經(jīng)衰老的間充質(zhì)干細(xì)胞重返年輕，恢復(fù)了干細(xì)胞特性。
【專利說明】—種恢復(fù)間充質(zhì)干細(xì)胞全能性的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種恢復(fù)間充質(zhì)干細(xì)胞全能性的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是一種成體干細(xì)胞，因其具有強(qiáng)大的增殖能力和多向分化潛能，免疫原性低，來源方便，易于分離、培養(yǎng)、擴(kuò)增和純化等優(yōu)點(diǎn)，使其在自身免疫性疾病以及各種替代治療等方面具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。盡管骨髓中間充質(zhì)干細(xì)胞含量相對較多，但僅占0.001%~0.01%，難以滿足細(xì)胞治療的需要，故需要在體外分離純化，培養(yǎng)擴(kuò)增才能滿足要求。但是，MSCs在體外擴(kuò)增過程中衰老和向成骨細(xì)胞自主分化問題嚴(yán)重影響其治療效果和使用安全性。
[0003]保持MSCs原有特性的關(guān)鍵在于改進(jìn)MSCs的培養(yǎng)條件。MSCs在體內(nèi)是處在一種立體環(huán)境，因此，有人提出三維培養(yǎng)的設(shè)想。1998年，Qiu對鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行三維培養(yǎng)，掃描電鏡檢測發(fā)現(xiàn)微載體cytodex-3表面大量細(xì)胞覆蓋，并相互橋接在一起，組成了三維多細(xì)胞聚合物。聚合物中可見礦化結(jié)節(jié)，免疫組化染色可見堿性磷酸酶和I 型膠原(Qiu Q, Ducheyne P,Gao H, Ayyaswamy P.Formation and differentiationof three-dimensional rat marrow stromal cell culture on microcarriers in arotating-wall vessel.Tissue Eng.1998;4:19-34.)? Glowacki 用膠原海綿作為載體進(jìn)行三維灌注培養(yǎng)，減少了代謝產(chǎn)物的聚集，結(jié)果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞外基質(zhì)含量提高，所培養(yǎng)的細(xì)胞活性和功能均加強(qiáng)(Glowacki J, Mizuno S，Greenberger JS.Perfusion enhancesfunctions of bone marrow stromal cells in three-dimensional culture.CellTransplant.1998;7:319-26.)。但cytodex-3和膠原海綿均為實(shí)心載體，比表面積較小，細(xì)胞難以大規(guī)模擴(kuò)增。而大載體生物反應(yīng)器能否用于MSCS的擴(kuò)增培養(yǎng)，還有待于一些問題的順利解決，如大孔微載體的研制、細(xì)胞與載體的粘附、貼壁細(xì)胞的洗脫等。
[0004]目前的3D培養(yǎng)都不能滿足目前細(xì)胞工程和基因工程對種子細(xì)胞量的需求而形成產(chǎn)業(yè)化，而且，3D培養(yǎng)是否從根本上恢復(fù)了 MSCs多能性目前尚未有研究。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種恢復(fù)間充質(zhì)干細(xì)細(xì)胞全能性的方法。
[0006]本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟:
[0007]1)將全能性降低的離體間充質(zhì)干細(xì)胞懸滴培養(yǎng)，得到懸滴培養(yǎng)后的細(xì)胞；
[0008]2)將所述懸滴培養(yǎng)后的細(xì)胞繼續(xù)懸浮培養(yǎng)，實(shí)現(xiàn)恢復(fù)所述全能性降低的離體間充質(zhì)干細(xì)胞全能性。
[0009]上述方法中，步驟1)中，所述全能性降低的離體間充質(zhì)干細(xì)胞為將離體間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)體外擴(kuò)增得到的間充質(zhì)干細(xì)胞。
[0010]其中，上述離體間充質(zhì)干細(xì)胞可來源于任何人體或動物組織和體液，如胎盤、臍帶、骨髓、脂肪和/或臍帶血等，而且該離體間充質(zhì)干細(xì)胞的全能性是完好的。[0011]上述全能性降低的離體間充質(zhì)干細(xì)胞可為任何原因所致，如體外擴(kuò)增培養(yǎng)所致，包括體外培養(yǎng)體系原因或傳代等因素；本發(fā)明的實(shí)施例中，上述全能性降低是由體外擴(kuò)增培養(yǎng)導(dǎo)致，具體為傳代培養(yǎng)4-10代；所述傳代培養(yǎng)具體采用貼壁培養(yǎng)的方式。
[0012]上述全能性降低的離體間充質(zhì)干細(xì)胞的特征體現(xiàn)在:與離體間充質(zhì)干細(xì)胞相比，細(xì)胞的體積變大、形狀由梭形變成不規(guī)則形、胞質(zhì)的透明度增高、自主向成骨細(xì)胞分化、干細(xì)胞相關(guān)基因0ct4、Sox2、Nanog表達(dá)量下降。
[0013]上述方法中，步驟I)中，
[0014]所述懸滴培養(yǎng)包括如下步驟:將所述全能性降低的離體間充質(zhì)干細(xì)胞懸浮，得到細(xì)胞懸液；再將所述細(xì)胞懸液滴加在培養(yǎng)皿蓋上，再將滴加后的蓋倒置在培養(yǎng)皿底上，培養(yǎng)，得到懸滴即為懸滴培養(yǎng)后的細(xì)胞；所述細(xì)胞懸液的濃度具體為IO4-1O8個(gè)/mL。
[0015]在上述懸浮前還包括將所述全能性降低的離體間充質(zhì)干細(xì)胞消化的步驟。
[0016]上述方法中，所述懸滴培養(yǎng)還包括如下步驟:在所述培養(yǎng)前，向所述培養(yǎng)皿底中加入防止懸滴干燥的水或溶液；所述溶液為濃度為0.01M、pH值為7.4的PBS緩沖液、生理鹽水、細(xì)胞培養(yǎng)液或其它緩沖液。
[0017]上述方法中，所述培養(yǎng)皿為細(xì)胞或細(xì)菌培養(yǎng)皿；所述細(xì)胞或細(xì)菌培養(yǎng)皿的材質(zhì)具體為塑料或玻璃。
[0018]本發(fā)明的實(shí)施例中懸滴培養(yǎng)具體如下:
[0019]1)用消化液將全能性降低的離體間充質(zhì)干細(xì)胞消化成單細(xì)胞懸液，用高糖的DMEM+10% (質(zhì)量百分含量)胎牛血清懸浮，調(diào)整單細(xì)胞懸液中細(xì)胞濃度為IX IO6個(gè)/mL，得到單細(xì)胞懸液；
[0020]2)以每滴35 μ I (每滴的細(xì)胞數(shù)約為35000個(gè)細(xì)胞)的體積把上述細(xì)胞懸液均勻的滴加到直徑9cm細(xì)菌培養(yǎng)皿(不貼壁的培養(yǎng)皿)的蓋中，每個(gè)細(xì)菌培養(yǎng)皿蓋懸滴滴數(shù)控制在40滴，再小心的把細(xì)菌培養(yǎng)皿蓋倒轉(zhuǎn)蓋在裝有IOml的PBS (濃度為0.01M、pH值為7.4)培養(yǎng)皿底上；置于培養(yǎng)箱內(nèi)，靜置懸滴培養(yǎng)36h,得到懸滴。
[0021]上述消化采用的消化液為將胰酶和EDTA溶于濃度為0.01M、pH值為7.4的PBS緩沖液得到的溶液，其中胰酶在消化液中的終濃度為0.25% (質(zhì)量百分含量)，EDTA在消化液中的終濃度為0.02% (質(zhì)量百分含量)。
[0022]上述方法中，所述懸滴培養(yǎng)中懸浮采用的懸浮液和所述懸浮培養(yǎng)采用的培養(yǎng)基均為細(xì)胞培養(yǎng)基或含有如下I)-3)中至少一種組分的細(xì)胞培養(yǎng)基:
[0023]1)促進(jìn)細(xì)胞生長組分:血清、生長因子、細(xì)胞因子、微量元素、激素、維生素、細(xì)胞信號通路抑制劑和/或激活劑；
[0024]2)助于細(xì)胞附著的組分:膠原、明膠、透明質(zhì)酸、纖維素、硫酸軟骨素、肽、甲殼素、聚乳酸和/或水凝膠；
[0025]3)抗病原體感染的組分:抗生素。
[0026]上述細(xì)胞培養(yǎng)基為培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)基；所述培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)基為含有胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基，具體按照如下方法制備:將胎牛血清與高糖DMEM培養(yǎng)基混合得到的細(xì)胞培養(yǎng)基，所述胎牛血清在所述細(xì)胞培養(yǎng)基中的濃度為10% (質(zhì)量百分含量)。
[0027]上述方法中，所述懸滴培養(yǎng)的時(shí)間為2-110小時(shí)；具體為36h ；[0028]所述懸浮培養(yǎng)的時(shí)間為2-110小時(shí)；具體為24h ；
[0029]所述懸滴培養(yǎng)和所述懸浮培養(yǎng)的條件如下:氧濃度為0.1-50%, CO2濃度為1-15%，溫度為30-40° C；
[0030]所述懸滴培養(yǎng)和所述懸浮培養(yǎng)均為靜態(tài)培養(yǎng)或動態(tài)培養(yǎng)；所述動態(tài)培養(yǎng)的方式為攪拌、旋轉(zhuǎn)或震蕩。
[0031]上述方法中，恢復(fù)所述全能性降低的離體間充質(zhì)干細(xì)胞全能性體現(xiàn)在減小所述全能性降低的離體間充質(zhì)干細(xì)胞的體積、降低所述全能性降低的離體間充質(zhì)干細(xì)胞S期的細(xì)胞數(shù)量、增強(qiáng)所述全能性降低的離體間充質(zhì)干細(xì)胞的分化能力、增強(qiáng)所述全能性降低的離體間充質(zhì)干細(xì)胞的克隆能力和/或提高所述全能性降低的離體間充質(zhì)干細(xì)胞中與全能性相關(guān)基因表達(dá)；
[0032]所述與全能性相關(guān)基因?yàn)镃CR1、CCR2、CX3CR、CD49b、CXCR4、0CT4、S0X2 和 / 或NANONG。
[0033]由上述的方法得到的間充質(zhì)干細(xì)胞也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。
[0034]本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種間充質(zhì)干細(xì)細(xì)胞培養(yǎng)方法。
[0035]本發(fā)明提供的方法，包括上述的方法的步驟。
[0036]本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明提供了一種恢復(fù)間充質(zhì)干細(xì)胞全能性的方法，具體采用3D培養(yǎng)，將經(jīng)過多次傳代培養(yǎng)的間充質(zhì)干細(xì)胞(全能性降低的間充質(zhì)干細(xì)胞)經(jīng)3D培養(yǎng)處理后，其增大的體積逐漸恢復(fù)、細(xì)胞活性增強(qiáng)、克隆能力和分化能力增強(qiáng)、其旁分泌作用也有所提高，這些結(jié)果說明`，此種3D培養(yǎng)的方法，使已經(jīng)衰老的間充質(zhì)干細(xì)胞重返年輕，恢復(fù)了干細(xì)胞特性；而且本方法采用一種可調(diào)控的無損傷的物理手段，體外調(diào)節(jié)人間充質(zhì)干細(xì)胞的多能性及分化能力，實(shí)現(xiàn)了體外擴(kuò)增間充質(zhì)干細(xì)胞的維持和恢復(fù)，進(jìn)而解決了人間充質(zhì)干細(xì)胞的臨床應(yīng)用中的難題，具有較好的經(jīng)濟(jì)效益和社會效益。另外，全能性恢復(fù)的MSCs作為移植的種子細(xì)胞具有以下優(yōu)點(diǎn):具有極低的免疫原性，因而不會引起排斥反應(yīng)；不涉及胚胎干細(xì)胞的倫理問題等等。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0037]圖1為貼壁培養(yǎng)的MSCs多能性降低
[0038]圖2為3D培養(yǎng)的MSCs細(xì)胞球的形成
[0039]圖3為3D培養(yǎng)的MSCs細(xì)胞大小形態(tài)的改變
[0040]圖4為3D培養(yǎng)對細(xì)胞周期和凋亡的影響[0041 ]圖5為3D培養(yǎng)對MSCs分化能力的影響
[0042]圖6為3D培養(yǎng)對MSCs克隆能力的影響
[0043]圖7為3D培養(yǎng)的MSCs全能性相關(guān)基因的表達(dá)
【具體實(shí)施方式】
[0044]下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0045]下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0046]下述實(shí)施例中離體間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells, MSCs)購自CyagenBiosciences Inc、產(chǎn)品目錄號為HUXMA-01001,也可以按照如下方法制備:胰酶分離離體人骨髓、臍帶或者胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞，然后收集細(xì)胞培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞達(dá)到70%-80%的融合時(shí)，用D-PBS清洗后，胰酶處理，然后加入完全培養(yǎng)基終止消化，吹打成單細(xì)胞懸液，離心去上清，完全培養(yǎng)基重懸后，傳代培養(yǎng)。
[0047]下述實(shí)施例中細(xì)菌培養(yǎng)皿(不貼壁的培養(yǎng)皿)購自武漢致誠信達(dá)科技開發(fā)有限公司，產(chǎn)品目錄號為T⑶000090。
[0048]下述實(shí)施例中的消化液為胰酶和EDTA溶于濃度為0.01M、pH值為7.4的PBS緩沖液得到的溶液，其中胰酶在消化液中的終濃度為0.25% (質(zhì)量百分含量)，EDTA在消化液中的終濃度為0.02% (質(zhì)量百分含量)。
[0049]下述實(shí)施例中濃度為0.01M、pH值為7.4的PBS緩沖液配方如下:NaCl 8.0Og,Na2HPO4.12H20 2.90g, KCl 0.2g, KH2PO4 0.24g。
[0050]下述實(shí)施例中細(xì)胞培養(yǎng)條件可采用:氧濃度為0.1-50%, CO2濃度為1_15%，溫度為30-40° C，具體均為氧濃度為10%，CO2濃度為2%，溫度為37° C ;
[0051]實(shí)施例1、全能性降低間充質(zhì)干細(xì)胞的獲得
[0052]一、間充質(zhì)干細(xì)胞的體外傳代貼壁培養(yǎng)
[0053]將離體間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)在含有10%的胎牛血清(FBS，Gibco)的低糖DMEM培養(yǎng)基(Hyclone，SH30021.01B)中貼壁傳代培養(yǎng)，每次傳代培養(yǎng)的時(shí)間為3天，分別得到第1-10代貼壁MSCs。
[0054]二、貼壁培養(yǎng)后細(xì)胞全能性檢測
[0055]I)、貼壁培養(yǎng)后MSCs的形態(tài)改變
[0056]將第I代和第10代培養(yǎng)MSCs細(xì)胞消化后接種在六孔板中培養(yǎng)過夜(12h)，第二天普通光學(xué)顯微鏡IOX物鏡觀察；結(jié)果如圖1A-B所示，從結(jié)果中可以看出，第I代和第10代培養(yǎng)MSCs細(xì)胞消化后再培養(yǎng)分別得到第2代(p2)和第12 R(PII)MSCs細(xì)胞，隨著傳代次數(shù)的增多，細(xì)胞的體積開始變大，形狀也由梭形開始變得不規(guī)則；從顯微鏡下觀察，細(xì)胞在體積增大過程中，邊界變的不明顯，胞質(zhì)的透明度增高?？梢钥闯觯N壁MSCs的全能性降低。
[0057]采用同樣的方法檢測貼壁培養(yǎng)第4、6代的貼壁MSC，也出現(xiàn)體積增大，全能性降低的結(jié)果。
[0058]2)、貼壁培養(yǎng)的MSCs自主向成骨細(xì)胞分化
[0059]貼壁培養(yǎng)第4代的貼壁MSC進(jìn)行堿性磷酸酶染色；結(jié)果如圖1C顯示，有少數(shù)細(xì)胞體積明顯變平變大，并呈堿性磷酸酶染色陽性(紅色)，呈現(xiàn)自主向成骨細(xì)胞的特征。可以看出，貼壁MSCs的全能性降低，不經(jīng)誘導(dǎo)自主向一個(gè)方向成骨細(xì)胞分化。
[0060]米用同樣的方法檢測貼壁培養(yǎng)第6、10代的貼壁MSC,也出現(xiàn)自主向一個(gè)方向成骨細(xì)胞分化的結(jié)果。
[0061]3)、貼壁培養(yǎng)的MSCs全能性相關(guān)基因的表達(dá)
[0062]實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢驗(yàn)不同代次貼壁培養(yǎng)的MSCs中全能性基因0CT4、S0X2和NANONG的表達(dá):其引物見后面表1。應(yīng)用PrimeScript?RT reagent Kit (TaKaRa)試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)及用SYBR ? Premix Ex Taq? II(TaKaRa)試劑盒在ABI 7300QPCR儀器進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng):16° C,30min ；42° C,30s ；85° C，酶滅活5s;定時(shí)熒光定量反應(yīng):95° C預(yù)變性IOmin ;95° C變性15s;60° C退火60s，40個(gè)循環(huán)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。GAPDH作為內(nèi)參，Λ Λ Ct法相對定量。
[0063]部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1D顯示，隨著MSCs傳代次數(shù)的增加，干細(xì)胞相關(guān)基因0ct4、Sox2、Nanog表達(dá)量都出現(xiàn)了不同程度的下降(第6代低于第2代)。
[0064]采用同樣的方法檢測第4、10代的貼壁MSC，表達(dá)量均低于第2代貼壁MSCs。
[0065]從上述結(jié)果可以看出，貼壁培養(yǎng)后，隨著傳代次數(shù)增多，MSCs的全能性逐漸降低。因此，與最初的離體間充質(zhì)干細(xì)胞相比，第4代貼壁MSCs、第6代貼壁MSCs、第10代貼壁MSCs均為全能性降低的間充質(zhì)干細(xì)胞。 [0066]實(shí)施例2、恢復(fù)間充質(zhì)干細(xì)胞全能性的培養(yǎng)
[0067]將上述實(shí)施例1得到的全能性降低的間充質(zhì)干細(xì)胞(第4代貼壁MSCs、第6代貼壁MSCs、第10代貼壁MSCs)分別進(jìn)行如下兩組處理:
[0068]A組:貼壁培養(yǎng):培養(yǎng)方法同上，得到第5代貼壁MSCs、第7代貼壁MSCs、第11代貼壁MSCs。
[0069]B組:3D培養(yǎng)，培養(yǎng)方法如下:
[0070]1、懸滴培養(yǎng)
[0071]用消化液將第4代貼壁MSCs、第6代貼壁MSCs、第10代貼壁MSCs分別消化成單細(xì)胞懸液，用高糖的DMEM (GIBC0,C11995)+10% (質(zhì)量百分含量)胎牛血清，調(diào)整單細(xì)胞懸液中細(xì)胞濃度為I X IO6個(gè)/mL，得到單細(xì)胞懸液；
[0072]以每滴35 μ I (每滴的細(xì)胞數(shù)約為35000個(gè)細(xì)胞)的體積把上述細(xì)胞懸液均勻的滴加到直徑9cm細(xì)菌培養(yǎng)皿(不貼壁的培養(yǎng)皿)的蓋中，每個(gè)細(xì)菌培養(yǎng)皿蓋懸滴滴數(shù)控制在40滴，再小心的把細(xì)菌培養(yǎng)皿蓋倒轉(zhuǎn)蓋在裝有IOml的PBS(濃度為0.01M、pH值為7.4，sigma,貨號:051M8311)培養(yǎng)皿底上；置于培養(yǎng)箱內(nèi)，靜置懸滴培養(yǎng)36h，得到懸滴。
[0073]2、懸浮培養(yǎng)
[0074]收集懸滴置于裝有IOml培養(yǎng)基(高糖DMEM+10%胎牛血清)的細(xì)菌培養(yǎng)皿繼續(xù)靜置懸浮培養(yǎng)24h，一共培養(yǎng)60h，得到第5代3D培養(yǎng)MSCs細(xì)胞球、第7代3D培養(yǎng)MSCs細(xì)胞球、第11代3D培養(yǎng)MSCs細(xì)胞球。
[0075]上述細(xì)胞球的形成過程如圖2所示(以第5代MSCs細(xì)胞球?yàn)槔?，A為懸滴培養(yǎng)4h ；B為懸滴培養(yǎng)12h ；C為懸滴培養(yǎng)24h ；D為懸滴培養(yǎng)36h ；E為懸滴培養(yǎng)48h ；F:10X物鏡下細(xì)胞球的形態(tài)，可以看出，懸滴培養(yǎng)36h即可得到細(xì)胞球。
[0076]3、消化
[0077]將上述2得到的第5代3D培養(yǎng)MSCs細(xì)胞球、第7代3D培養(yǎng)MSCs細(xì)胞球、第11代3D培養(yǎng)MSCs細(xì)胞球分別經(jīng)PBS洗兩遍，用消化液消化lOmin，得到第5代、第7代和第11代3D培養(yǎng)MSCs細(xì)胞。
[0078]采用同樣的方法消化第5代、第7代和第11代貼壁培養(yǎng)的MSCs，得到消化后第5代、第7代和第11代貼壁培養(yǎng)MSCs細(xì)胞。
[0079]三、檢測3D培養(yǎng)后間充質(zhì)干細(xì)胞的全能性
[0080]下述檢測實(shí)驗(yàn)中的3D培養(yǎng)MSCs細(xì)胞和貼壁MSCs細(xì)胞均為消化后的細(xì)胞。
[0081]1、3D培養(yǎng)后MSCs生物形態(tài)學(xué)的改變
[0082]將第5代、第7代和第11代3D培養(yǎng)MSCs細(xì)胞分別接種在六孔板中培養(yǎng)過夜(12h)，第二天普通光學(xué)顯微鏡觀察；以第5代、第7代和第11代貼壁MSCs細(xì)胞為對照。[0083]結(jié)果如圖3所示，圖3A為第11代貼壁MSCs細(xì)胞的結(jié)果；圖38為第11代3D培養(yǎng)MSCs細(xì)胞結(jié)果；可以看出，3D培養(yǎng)細(xì)胞形態(tài)又開始恢復(fù)為梭形，體積變小，更具立體感。
[0084]圖3C為第5代和第7代3D培養(yǎng)MSCs細(xì)胞、第5代和第7代貼壁MSCs前向反射角的大小比較；可以看出，與貼壁細(xì)胞相比，3D培養(yǎng)MSCs的第5代和第7代細(xì)胞的前向反射角變小，說明3D培養(yǎng)后細(xì)胞的體積減小(減少約42%)。
[0085]圖3D為第5代貼壁MSCs的10 X物鏡觀察；圖3E為第5代3D培養(yǎng)MSCs細(xì)胞的IOX物鏡觀察；可以看出，3D培養(yǎng)后細(xì)胞的體積明顯減小。
[0086]2,3D培養(yǎng)MSCs的凋亡和細(xì)胞周期
[0087]將第5代貼壁MSCs和第5代3D培養(yǎng)MSCs細(xì)胞用PI(P_4170，sigma)染色30min，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期分布情況。結(jié)果見圖4A-B所示，A為第5代貼壁MSCs的細(xì)胞周期分布；B為第5代3D培養(yǎng)MSCs細(xì)胞的細(xì)胞周期分布；可以看出，經(jīng)3D培養(yǎng)后，S期的細(xì)胞明顯減少(貼壁培養(yǎng):24.92% ；3D培養(yǎng):3.73%)，細(xì)胞大部分處于靜止期，從而維持了 MSCs的特性。
[0088]將第5 代貼壁 MSCs 和第 5 代 3D 培養(yǎng) MSCs 細(xì)胞 Annexin V/PI (invitrogen,944090 )雙染色I(xiàn)h后，流式檢測細(xì)胞凋亡。結(jié)果見圖4C-D，C為第5代貼壁MSCs的細(xì)胞凋亡；D為第5代3D培養(yǎng)MSCs細(xì)胞的細(xì)胞凋亡；可以看出，3D培養(yǎng)后細(xì)胞的凋亡率為4.2%+0.7%，死亡細(xì)胞為3.3%，而大部分(91%)的細(xì)胞為活細(xì)胞；3D培養(yǎng)和貼壁培養(yǎng)的細(xì)胞的存活率無顯著差異，說明3D培養(yǎng)不會降低細(xì)胞存活率。
[0089]3、3D培養(yǎng)的MSCs分化能力
[0090]I)、誘導(dǎo)3D培養(yǎng)`的MSCs成骨方向分化
[0091]成骨誘導(dǎo)培養(yǎng):計(jì)數(shù)為5 X IO4個(gè)/ml第5代貼壁MSCs (貼壁)和計(jì)數(shù)為5 X IO4個(gè)/ml第5代3D培養(yǎng)MSCs細(xì)胞(3D培養(yǎng))分別接種入六孔板中，細(xì)胞達(dá)到80%匯合后換成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)液(10%胎牛血清、0.1 μ mol/L地塞米松、50 μ mol/L抗壞血酸、10mmol/L β -甘油磷酸鈉的高糖DMEM培養(yǎng)基)進(jìn)行成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)，每3天換一次液。以未進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)的為對照，加入的為常規(guī)培養(yǎng)液(含10%FBS的L-DMEM培養(yǎng)液)。
[0092]在誘導(dǎo)14d時(shí)各取各組細(xì)胞進(jìn)行茜素紅染色，光鏡下觀察并攝影，結(jié)果見圖5A-D所示，其中，A為貼壁未誘導(dǎo)；B為3D培養(yǎng)未誘導(dǎo)；C為貼壁誘導(dǎo)；D為3D培養(yǎng)誘導(dǎo)；可以看出，未誘導(dǎo)，這兩種細(xì)胞無顯著差異；經(jīng)過誘導(dǎo)后，3D培養(yǎng)的MSCs成骨分化的能力高于貼壁培養(yǎng)的MSCs。
[0093]2)、誘導(dǎo)3D培養(yǎng)的MSCs成脂肪分化
[0094]計(jì)數(shù)為5 X IO4個(gè)/ml的第5代貼壁MSCs (貼壁)和計(jì)數(shù)為5 X IO4個(gè)/ml的第5代3D培養(yǎng)MSCs細(xì)胞(3D培養(yǎng))分別接種于培養(yǎng)皿中，細(xì)胞達(dá)到80%匯合后換成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)液(L-DMEM培養(yǎng)液，10%FBS,地塞米松10_6mol/L，胰島素10mg/L，3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(3-1sobutyl-l-methylxanthine, IBMX) 0.Smmol /I,, Π引哚美辛 0.2mmol/L)進(jìn)行脂肪誘導(dǎo)分化培養(yǎng)，每3天換一次液。以未進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)的為對照，加入的為常規(guī)培養(yǎng)液(含10%FBS的L-DMEM培養(yǎng)液)。
[0095]在誘導(dǎo)14d時(shí)各取各組細(xì)胞進(jìn)行油紅O染色，光鏡下觀察并攝影，結(jié)果見圖5E-H所示，E為貼壁未誘導(dǎo)；F為3D培養(yǎng)未誘導(dǎo)；G為貼壁誘導(dǎo)；H為3D培養(yǎng)誘導(dǎo)；可以看出，未誘導(dǎo)，這兩種細(xì)胞無顯著差異；經(jīng)過誘導(dǎo)后，3D培養(yǎng)的MSCs成脂肪分化的能力高于貼壁培養(yǎng)的MSCs。
[0096]4、3D培養(yǎng)的MSCs克隆能力檢測
[0097]第5代貼壁MSCs (貼壁)和第5代3D培養(yǎng)MSCs細(xì)胞(3D培養(yǎng))分別懸浮在10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中備用。
[0098]將上述各組200個(gè)細(xì)胞分別接種含IOmL 37° C預(yù)溫培養(yǎng)液(含10%FBS的L-DMEM培養(yǎng)液)的皿中，并輕輕轉(zhuǎn)動，使細(xì)胞分散均勻。置37° C 5%C02及飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2周。當(dāng)培養(yǎng)皿中出現(xiàn)肉眼可見的克隆時(shí)，用PBS小心浸洗2次。加2ml4%多聚甲醛，固定細(xì)胞固定15分鐘。去固定液，加適量結(jié)晶紫染液染30分鐘，然后用流水緩慢洗去染色液，空氣干燥。在顯微鏡(低倍鏡)計(jì)數(shù)大于10個(gè)細(xì)胞的克隆數(shù)。最后計(jì)算克隆形成率((克隆形成數(shù)/接種細(xì)胞數(shù))*100%)。
[0099]結(jié)果如圖6所示，A為藍(lán)色線上方為貼壁培養(yǎng)的三個(gè)復(fù)孔的克隆，下方為3D培養(yǎng)的克隆數(shù)；B為貼壁培養(yǎng)和3D培養(yǎng)的克隆形成率(貼壁con的為19%，3D的為41%) ;C為IOX物鏡下貼壁培養(yǎng)的克隆形態(tài)山為IOX物鏡下3D培養(yǎng)的克隆形態(tài)，從上述結(jié)果可以看出，經(jīng)3D培養(yǎng)后，MSCs的克隆數(shù)無論從數(shù)量還是質(zhì)量上都有了顯著的提高。
[0100]5,3D培養(yǎng)的MSCs全能性相關(guān)基因的表達(dá)
[0101]實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢驗(yàn)第5代貼壁MSCs (貼壁，con)和第5代3D培養(yǎng)MSCs細(xì)胞(3D培養(yǎng))中遷徙相關(guān)基因CCRl、CCR2、CX3CR、CD49b、CXCR4、全能性基因0CT4、S0X2和NANONG的表達(dá):其引物見表1。應(yīng)用PrimeScript? RT reagent Kit (TaKaRa)試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)及用SYBR ? Premix Ex Taq? II(TaKaRa)試劑盒在ABI 7300QPCR儀器進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)。逆轉(zhuǎn)錄 反應(yīng):16° C,30min ；42° C,30s ；85° C，酶滅活5s;定時(shí)熒光定量反應(yīng):95° C預(yù)變性IOmin ;95° C變性15s;60° C退火60s，40個(gè)循環(huán)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。GAPDH作為內(nèi)參，Δ Λ Ct法相對定量。
[0102]表1為全能性相關(guān)基因的引物
[0103]
【權(quán)利要求】
1.一種恢復(fù)間充質(zhì)干細(xì)細(xì)胞全能性的方法，包括如下步驟: 1)將全能性降低的離體間充質(zhì)干細(xì)胞懸滴培養(yǎng)，得到懸滴培養(yǎng)后的細(xì)胞； 2)將所述懸滴培養(yǎng)后的細(xì)胞繼續(xù)懸浮培養(yǎng)，實(shí)現(xiàn)恢復(fù)所述全能性降低的離體間充質(zhì)干細(xì)胞全能性。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于: 步驟I)中，所述全能性降低的離體間充質(zhì)干細(xì)胞為將離體間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)體外擴(kuò)增得到的間充質(zhì)干細(xì)胞。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于: 所述體外擴(kuò)增培養(yǎng)為傳代培養(yǎng)4-10代；所述傳代培養(yǎng)具體采用貼壁培養(yǎng)的方式。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于: 步驟I)中，所述懸滴培養(yǎng)包括如下步驟:將所述全能性降低的離體間充質(zhì)干細(xì)胞懸浮，得到細(xì)胞懸液；再將所述細(xì)胞懸液滴加在培養(yǎng)皿蓋上，再將滴加后的蓋倒置在培養(yǎng)皿底上，培養(yǎng)，得到懸滴即為懸滴培養(yǎng)后的細(xì)胞； 所述細(xì)胞懸 液的濃度具體為IO4-1O8個(gè)/mL。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于: 所述懸滴培養(yǎng)還包括如下步驟:在所述培養(yǎng)前，向所述培養(yǎng)皿底中加入防止懸滴干燥的水或溶液；所述溶液為濃度為0.01M、pH值為7.4的PBS緩沖液、生理鹽水、細(xì)胞培養(yǎng)液或其它緩沖液。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的方法，其特征在于: 所述培養(yǎng)皿為細(xì)胞或細(xì)菌培養(yǎng)皿；所述細(xì)胞或細(xì)菌培養(yǎng)皿的材質(zhì)具體為塑料或玻璃。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一所述的方法,其特征在于: 所述懸滴培養(yǎng)中懸浮采用的懸浮液和所述懸浮培養(yǎng)采用的培養(yǎng)基均為細(xì)胞培養(yǎng)基或含有如下I) -3)中至少一種組分的細(xì)胞培養(yǎng)基: 1)促進(jìn)細(xì)胞生長組分:血清、生長因子、細(xì)胞因子、微量元素、激素、維生素、細(xì)胞信號通路抑制劑和/或激活劑； 2)助于細(xì)胞附著的組分:膠原、明膠、透明質(zhì)酸、纖維素、硫酸軟骨素、肽、甲殼素、聚乳酸和/或水凝膠； 3)抗病原體感染的組分:抗生素。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一所述的方法，其特征在于: 所述懸滴培養(yǎng)的時(shí)間為2-110小時(shí)； 所述懸浮培養(yǎng)的時(shí)間為2-110小時(shí)； 所述懸滴培養(yǎng)和所述懸浮培養(yǎng)的條件如下:氧濃度為0.1-50%, CO2濃度為1-15%，溫度為 30-40。 C； 所述懸滴培養(yǎng)和所述懸浮培養(yǎng)均為靜態(tài)培養(yǎng)或動態(tài)培養(yǎng)；所述動態(tài)培養(yǎng)的方式為攪拌、旋轉(zhuǎn)或震蕩。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-8中任一所述的方法，其特征在于: 所述恢復(fù)所述全能性降低的離體間充質(zhì)干細(xì)胞全能性體現(xiàn)在減小所述全能性降低的離體間充質(zhì)干細(xì)胞的體積、降低所述全能性降低的離體間充質(zhì)干細(xì)胞S期的細(xì)胞數(shù)量、增強(qiáng)所述全能性降低的離體間充質(zhì)干細(xì)胞的分化能力、增強(qiáng)所述全能性降低的離體間充質(zhì)干細(xì)胞的克隆能力和/或提高所述全能性降低的離體間充質(zhì)干細(xì)胞中與全能性相關(guān)基因表達(dá)； 所述與全能性相關(guān)基因?yàn)?CCRl、CCR2、CX3CR、CD49b、CXCR4、0CT4、S0X2 和 / 或 NANONG。
10.由權(quán)利要求1-9中任一所述的方法得到的間充質(zhì)干細(xì)胞； 或一種間充質(zhì)干細(xì) 細(xì)胞培養(yǎng)方法，包括權(quán)利要求1-9中任一所述的方法的步驟。
【文檔編號】C12N5/0775GK103667186SQ201210326437
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2012年9月6日 優(yōu)先權(quán)日:2012年9月6日
【發(fā)明者】吳耀炯, 郭玲, 周瑩 申請人:清華大學(xué)深圳研究生院