專利名稱：一種分離植物低分子量rna的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，涉及一種分離植物低分子量RNA的方法。
背景技術(shù)：
低分子量RNA包括大小在20nt 24nt的siRNAs和miRNAs，這類小RNA分子對植物的生長、發(fā)育及響應(yīng)逆境脅迫方面起著重要的調(diào)控作用。自從2002年科學(xué)家首次在植物中發(fā)現(xiàn)miRNAs以來，miRNAs數(shù)據(jù)庫已收錄了 4169條植物miRNAs,小RNA分子的研究越來越受到植物科學(xué)家的重視。小RNA分子的獲得是開展小RNA研究的前提，小RNA的質(zhì)量直接影響后續(xù)實驗的開展。不管是用哪種提取方法，都要求所獲得的低分子量RNA純度高、質(zhì) 量好，沒有多酚、多糖等物質(zhì)的污染。目前，科研上獲得植物小RNA的方法主要有以下幾種①通過商業(yè)試劑盒提取小RNA ;②從總RNA中回收小RNA ;③直接富集小RNA。這3種方法的不同之處主要在于它們分離小RNA的手段。AmbioruStratagene等公司開發(fā)的小RNA提取試劑盒是利用高分子材料制成的膜吸附小RNA，然后再從膜上將其回收，這一方法雖然使用方便，但其價格昂貴，而且這些試劑盒不適合小RNA的大量提取。從總RNA中回收小RNA的方法是經(jīng)典的分離小RNA的方法，該方法首先要從植物組織中分離總RNA (大分子量RNA和低分子量RNA)，然后再利用切膠回收的方法從總RNA中回收低分子量RNA，這一方法耗時長，且小RNA的得率低。文獻(xiàn)報導(dǎo)的直接富集小RNA的方法有兩種，一種是用7. 5%的聚乙二醇和I. 25mol/L的氯化鈉來沉淀大分子量RNA，然后用等體積的異丙醇過夜沉淀回收小RNA ;另外一種是用5%的聚乙二醇和1/9體積的異丙醇來沉淀大分子量RNA，然后用等體積的異丙醇沉淀小RNA，這兩種方法雖然小RNA的得率較高，但耗時都相對較長。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種簡單、高效的提取高質(zhì)量植物低分子量RNA的方法。為了實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的一種分離植物低分子量RNA的方法，包括如下步驟I)樣品處理稱取O. 5g新鮮的幼嫩植物葉片，放進(jìn)盛有液氮的研缽中，研磨成粉末，然后將粉末迅速轉(zhuǎn)移至15ml的離心管中，加入經(jīng)65°C預(yù)熱的CTAB提取緩沖液5ml和β -巰基乙醇200 μ 1，震蕩混勻；所述的CTAB提取緩沖液的成分為2%十六烷基三甲基溴化銨，25mmol/L乙二胺四乙酸，2mol/L氯化鈉，3%聚乙烯吡咯烷酮(PVP-40)，lOOmmol/L三羥甲基氨基甲烷(ρΗ8· O) , O. 5g/L 亞精胺；2)DNA和蛋白質(zhì)的去除在上述離心管中加入水飽和酚氯仿異戊醇(25 24 I)溶液5ml，將離心管蓋緊，翻轉(zhuǎn)50次混合均勻，然后在4°C，12000rpm離心20min ;離心后將離心管中的上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中，加入等體積氯仿異戊醇(24 I)溶液，將離心管蓋緊，翻轉(zhuǎn)50次混合均勻，然后在4°C，12000rpm離心IOmin ;離心后將離心管中的上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中，再次加入等體積氯仿異戊醇(24 I)溶液，將離心管蓋緊，翻轉(zhuǎn)50次混合均勻，然后在4°C，12000rpm離心IOmin ;上清液中的蛋白質(zhì)和DNA被沉淀，RNA存留于上清液中；3)大分子量RNA的去除轉(zhuǎn)移上述離心管中的上清液至新的離心管中，加入1/4體積的30%聚乙二醇6000 (PEG6000)溶液，混勻后冰浴30min，然后在4°C，13000rpm離心IOmin ;再將離心管中的上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中，加入1/3體積的無水乙醇，混勻后于4°C，13000rpm離心5min ;上清液中的大分子量RNA被沉淀，低分子量RNA存留于上清液中；4)低分子量RNA的獲得轉(zhuǎn)移上述離心管中的上清液至新離心管中，加入1/10體積的3mol/L醋酸鈉(pH5. 2)溶液和2/3體積的無水乙醇，混勻后于4°C，13000rpm離心lOmin，所得沉淀物即為低分子量RNA ;然后用75%乙醇將離心管中的沉淀清洗兩次，獲得低分子量RNA ；
5)低分子量RNA的保存將低分子量RNA沉淀風(fēng)干后，用50 μ I DEPC水溶解沉淀，然后將其轉(zhuǎn)入I. 5ml離心管中，-80°C保存?zhèn)溆谩１景l(fā)明所用的植物材料為木瓜、香蕉、橡膠樹的新鮮葉片。低分子量RNA質(zhì)量評價過程中所用到的引物和接頭序列如下PCR-F TCGGACCAGGCTTCATTCCCCPCR-R AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTAC5，接頭CGACTGGAGCACGAGGACACTGACATGGACTGAAGGAGTAGAAA反轉(zhuǎn)錄弓I物AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTAC (T) 30VN本發(fā)明的優(yōu)點在于①整個提取過程操作簡便、實驗成本低、提取過程所需時間短，用150min即可完成低分子量RNA的提取提取過程中對DNA、大分子量RNA和低分子量RNA采用分級沉淀，用30%聚乙二醇(PEG)和1/3體積的無水乙醇沉淀DNA和大分子量RNA，用2/3體積的無水乙醇沉淀低分子量RNA ;③本方法所分離到的小RNA分子適用于進(jìn)一步的低分子量RNA相關(guān)研究，用電泳和紫外分光光度法對所提取的低分子量RNA進(jìn)行檢測，結(jié)果表明，用本方法提取的橡膠樹、香蕉和木瓜低分子量RNA質(zhì)量高，電泳條帶清晰，無拖尾(圖1)，純度好，得率高(表I);用RT-PCR法對提取的橡膠樹低分子量RNA進(jìn)行HbmiR166的擴增檢測，結(jié)果表明，提取的橡膠樹小RNA中包含有HbmiR166 (圖2，圖3)。表I不同材料的低分子量RNA的純度和得率
_材料_A260/280_A260/230_得率(gg/g·鮮重)
垮拎說2.09±0.012.07=0.06190.9±19.5
M 1.84+0.05 2.00=0.04 174.6+I8.9__2.05 土 0.06_2.09:0.09_216.9 士 33.6注平均值土標(biāo)準(zhǔn)差來自3次重復(fù)實驗。


圖I :利用本發(fā)明提取的植物低分子量RNA在I. 0%瓊脂糖甲醛變性膠中的電泳圖
-i'TfeP曰。
泳道I為木瓜低分子量RNA,泳道2為香蕉低分子量RNA,泳道3為橡膠樹低分子量RNA，泳道4為木瓜的PEG6000沉淀物，泳道5為香蕉的PEG6000沉淀物，泳道6為橡膠樹的PEG6000沉淀物。圖2 :橡膠樹HbmiR166的擴增結(jié)果。泳道I 泳道4分別為4次重復(fù)，M泳道為20bp ladder marker。圖3 :橡膠樹HbmiR166擴增產(chǎn)物的測序結(jié)果。
具體實施例方式以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。實施本發(fā)明時，可用木瓜、香蕉、橡膠樹的新鮮葉片。實施步驟為 (I)稱取O. 5g葉片，用液氮研磨成粉末后，迅速將粉末轉(zhuǎn)移至15ml的離心管中，并在離心管中加入經(jīng)65°C預(yù)熱的CTAB提取緩沖液[2%十六烷基三甲基溴化銨，25mmol/L乙二胺四乙酸，2mol/L氯化鈉，3%聚乙烯吡咯烷酮(PVP-40)，IOOmmoI/L三羥甲基氨基甲烷(pH8.0)，0. 5g/L亞精胺]5ml和β -巰基乙醇200 μ 1，震蕩混勻;接著在離心管中加入水飽和酚氯仿異戊醇為(25 24 I)溶液5ml，將離心管蓋緊，翻轉(zhuǎn)50次混合均勻，然后在 4°C, 12000rpm 離心 20min。(2)轉(zhuǎn)移上述離心管中的上清液至新的離心管中，加入等體積氯仿異戊醇(24 I)溶液，將離心管蓋緊，翻轉(zhuǎn)50次混合均勻，然后在4°C，12000rpm離心IOmin ；(本
步驟重復(fù)一次)。(3)轉(zhuǎn)移上述離心管中的上清液至新的離心管中，加入1/4體積的30%聚乙二醇6000 (PEG6000)溶液，混勻后冰浴 30min，然后在 4°C，13000rpm 離心 lOmin。(4)轉(zhuǎn)移上述離心管中的上清液至新的離心管中，加入1/3體積的無水乙醇，混勻后于 4°C, 13000rpm 離心 5min。(5)轉(zhuǎn)移上述離心管中的上清液至新的離心管中，加入1/10體積的3mol/L醋酸鈉(pH5. 2)溶液和2/3體積的無水乙醇，混勻后于4°C，13000rpm離心lOmin，所得沉淀物為低分子量RNA ;然后用75%乙醇將離心管中的沉淀物清洗兩次；待清洗過的沉淀物風(fēng)干后，用50 μ I DEPC水溶解沉淀物，然后將其轉(zhuǎn)入I. 5ml離心管中，_80°C保存?zhèn)溆?。雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對之作一些修改或改進(jìn)，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。
權(quán)利要求
1.一種分離植物低分子量RNA的方法，其特征在于包括樣品處理、DNA和蛋白質(zhì)的去除、DNA和大分子量RNA的去除、低分子量RNA的獲得、低分子量RNA的保存； 所述的樣品處理加入的CTAB提取緩沖液的成分為2%十六烷基三甲基溴化銨，25mmol/L乙二胺四乙酸，2mol/L氯化鈉，3%聚乙烯吡咯烷酮(PVP-40)，IOOmmoI/L三羥甲基氨基甲烷(PH8. O)，O. 5g/L亞精胺。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種分離植物低分子量RNA的方法，其特征在于，所述DNA和大分子量RNA的去除，是在RNA上清液加入1/4體積的30%聚乙二醇6000 (PEG6000)溶液，混勻后冰浴30min，然后在4°C，13000rpm離心IOmin ;再將離心管中的上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中，加入1/3體積的無水乙醇，混勻后于4°C，13000rpm離心5min ;上清液中的DNA和大分子量RNA被沉淀，低分子量RNA存留于上清液中，為低分子量RNA上清液。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種分離植物低分子量RNA的方法，其特征在于，所述低分子量RNA的獲得，是在低分子量RNA上清液加入1/10體積的3mol/L醋酸鈉(pH5. 2)溶液和2/3體積的無水乙醇，混勻后于4°C，13000rpm離心lOmin，所得沉淀物即為低分子量RNA ；然后用75%乙醇將離心管中的沉淀清洗兩次，獲得低分子量RNA。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種分離植物低分子量RNA的方法，主要包括樣品處理，DNA和蛋白質(zhì)的去除，大分子量RNA的去除，低分子量RNA的獲得，低分子量RNA的保存。本發(fā)明提取低分子量RNA過程中對DNA、大分子量RNA和低分子量RNA采用分級沉淀，用30%聚乙二醇(PEG)和1/3體積的無水乙醇沉淀DNA和大分子量RNA，用2/3體積的無水乙醇沉淀低分子量RNA，實現(xiàn)低分子量RNA的富集；提取過程中操作簡便、所需時間短，是一種簡單、經(jīng)濟(jì)、高效的提取高質(zhì)量植物低分子量RNA的方法。
文檔編號C12N15/10GK102888396SQ20121032705
公開日2013年1月23日 申請日期2012年9月6日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月6日
發(fā)明者安澤偉, 李雅超, 謝黎黎, 翟琪麟, 胡彥師, 程漢, 黃華孫 申請人:中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院橡膠研究所