專利名稱：人血清白蛋白與人生長激素脂肪分解結構域的融合蛋白的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物技術領域，尤其涉及一種人血清白蛋白與人生長激素脂肪分解結構域的融合蛋白。
背景技術：
人生長激素(human growth hormone, hGH)是由腦垂體嗜酸性細胞分泌的一種蛋白質類激素。hGH的功能復雜多樣，具有調節(jié)人體的生長發(fā)育，影響蛋白質、碳水化合物以及脂肪的代謝等作用。重組hGH是臨床上非常重要的一個藥物，在生理劑量上被用來治療成年人以及兒童的hGH缺乏癥；在藥理劑量上被用來治療很多疾病，比如骨質疏松癥、心力衰竭、慢性腎衰竭、特納氏綜合癥、以及多種急慢性代謝方面的疾病等。hGH在體內起作用主要是通過與受體的結合,而生長激素受體(growth hormonereceptor, GHR)在體內的分布非常廣泛，很多器官都有GHR的存在。并且hGH在體內被水解成各種活性肽段，也發(fā)揮多種作用，有些是與治療無關甚至是毒性的。因此長期使用hGH會產(chǎn)生一些諸如葡萄糖耐受性、胰島素拮抗性、浮腫以及高血壓等癥狀。有的甚至需要在施用hGH之后，對病人進行糖尿病治療，這在很大程度上限制了 hGH的應用。蛋白質水解及體外多肽合成研究發(fā)現(xiàn)結構完整的hGH分子包含一些獨立的結構區(qū)域，每個區(qū)域都具有獨立的生物化學或生理學作用。因此，具有與結構完整的hGH分子類似的功能，而沒有干擾活性的多肽成為人們研究的熱點。hGH177_191是hGH分子C末端的15個氨基酸，被認為是hGH促進脂肪分解的區(qū)域。1959年,Raben和Hollenberg首次在成年人中發(fā)現(xiàn)hGH具有分解脂肪的作用。實驗發(fā)現(xiàn)，hGH缺乏的成年人，當其循環(huán)系統(tǒng)中hGH的表達水平下降時，會出現(xiàn)腹部脂肪堆積，而用hGH替代治療后，則腹部恢復正常。這說明腹部脂肪堆積與循環(huán)系統(tǒng)中hGH的表達水平有密切的關系。后來實驗證實，hGH能夠抑制脂蛋白脂酶的活性，增加循環(huán)系統(tǒng)中游離脂肪酸的含量，最終減少脂肪細胞的聚集。hGH177,是hGH分子C末端的15個氨基酸，被認為是hGH促進脂肪分解的區(qū)域。通過水解和酶切的方法研究hGH的C末端的片段發(fā)現(xiàn)hGH177_191是保持該生物活性最小的片段。NMR顯示hGH177_191在溶液中呈現(xiàn)一種環(huán)狀結構，與在hGH中相似。hGH177_191具有與hGH相同的作用原理，都是直接作用于脂肪細胞，能夠加速細胞內儲存脂肪的釋放和燃燒，從而減少脂肪的聚集。對hGH177_191的體外活性研究發(fā)現(xiàn)hGH177_191對嚙齒動物、豬以及人的脂肪細胞或組織都能起到急性的脂肪分解作用。體內動物實驗顯示肥胖小鼠施用不同劑量的hGH177_191后，均能在不減少食物攝入量的基礎上使小鼠的體重有不同程度的減輕。人體毒性實驗也發(fā)現(xiàn)，hGH177_191的耐受性非常好，對人體安全無副作用。GH177_191有且唯一具有分解脂肪的生物活性，所以具有潛在的治療肥胖的應用價值。hGH177_191僅由15個氨基酸組成，在開發(fā)為藥物的過程中，面臨著一系列的問題。hGH177_191分子量特別小，在體內的半衰期非常短，只有幾分鐘。為了充分發(fā)揮其藥效，必需每天注射或口服。每天注射會給病人帶來注射部位疼痛等痛苦，造成病人的依從性比較差。而口服后，肽段會被水解，同樣不利于藥效的發(fā)揮。并且，通過體外合成的方法生產(chǎn)hGH177_191，其費用比較高，每天使用更增加了其成本，不利于藥物的大規(guī)模推廣應用。

發(fā)明內容
本發(fā)明提供了一種人血清白蛋白與人生長激素脂肪分解結構域的融合蛋白及其制備方法，解決了現(xiàn)有人生長激素脂肪分解結構域在體內的半衰期短，口服易被水解，藥效不易發(fā)揮的問題。一種融合蛋白，包括兩個區(qū)域，其中，第一區(qū)域為人血清白蛋白，第二區(qū)域為人生長激素脂肪分解結構域，人生長激素脂肪分解結構域的氨基酸序列為LRIVQCRSVEGSCGF。人血清白蛋白(Human Serum Albumin,簡稱HSA)HSA是由585個氨基酸殘基組成的蛋白質，分子量約為66. 5KD，是血漿的主要成分，正常情況下不易透過腎小球，在血漿中的半衰期較長，可達14 20天，而且體內分布極廣，沒有酶學和免疫學活性，是一種理想的 生物活性蛋白載體。人血清白蛋白與人生長激素脂肪分解結構域可以直接連接，也可以通過連接肽連接。連接肽的長短以及氨基酸組成等對融合蛋白的表達水平、產(chǎn)率、穩(wěn)定性以及活性等有影響，所述連接肽的長度優(yōu)選2 100個氨基酸,更優(yōu)選為5 50個氨基酸,最優(yōu)選為14 30個氨基酸。所述連接肽的氨基酸序列優(yōu)選為[GlyGlyGlyGlySer]n，其中η為I 10的自然數(shù)，更優(yōu)選為I 5的自然數(shù)。所述人血清白蛋白作為蛋白載體與人生長激素脂肪分解結構域融合形成的融合蛋白分子量較大，不易被腎小球濾過，能夠延長半衰期。所述HSA的氨基酸序列優(yōu)選為如SEQ ID NO. 2所示，hGH177_191與該序列的HSA融合在延長多肽作用半衰期的基礎上較大程度的保留了其活性和功能。所述HSA的氨基酸序列也可以與SEQ ID NO. 2具有85%同源性，優(yōu)選為具有95%的同源性。本發(fā)明還提供了編碼所述融合蛋白的基因，根據(jù)真菌密碼子偏好性，其堿基序列優(yōu)選為SEQ ID NO. 3所示。本發(fā)明還提供了一種包含所述融合蛋白的基因的重組質粒。所述重組質粒的原始載體可以選用pPIC系列載體，優(yōu)選為pPIC9K，pPICZ α等分泌型載體，最優(yōu)選為PPIC9。pPIC9載體上的醇氧化酶操縱子(AOXl) 5’序列和3’序列，能高密度發(fā)酵，重組蛋白表達量高。PPIC9載體能對表達后的外源蛋白進行加工處理，將外源蛋白分泌到細胞外，提高表達蛋白的活性，也便于重組蛋白的純化。在單個重組質粒中，人血清白蛋白基因和人生長激素脂肪分解結構域基因的相對順序可以任意，而且其中人生長激素脂肪分解結構域基因的拷貝數(shù)可以是兩個或兩個以上，所述重組質粒結構可以為pPIC9-HSA-hGH177_191，pPIC9-hGH177_191-HSA,pPIC9-HSA-L-hGH177_191，pPIC9-hGH177_191-L-HSA，pPIC9-hGH177_191-HSA-hGH177_191 或 pPIC9_hGH177-191-L-HSA-L-hGH177_191。本發(fā)明還提供了一種包含所基因的表達系統(tǒng)。所述的表達系統(tǒng)選擇的宿主可以為細菌、酵母、動物細胞或植物細胞，優(yōu)選為酵母，更優(yōu)選為畢赤酵母GS115。
本發(fā)明還提供了一種所述融合蛋白的制備方法，包括(I)構建包含融合蛋白基因的重組表達載體；具體可以為以人胎肝組織DNA為模板，擴增得到HSA基因片段，連接到載體中，接著設計帶hGH177_191基因的引物，然后以上述帶有HSA基因的重組載體為模板，擴增得到整個融合蛋白基因，最后將融合蛋白基因連接到PPIC9中。(2)將重組表達載體酶切線性化，轉入畢赤酵母GS115，獲得轉化子；酶切線性化所用的內切酶為Sail，所述的轉化的方法可以采用電穿孔法、化學法、原生質體生成法或全細胞法。(3)對轉化子細胞進行誘導培養(yǎng)，從培養(yǎng)基中分離純化所述融合蛋白。
本發(fā)明的融合蛋白可以有各種衍生物，這些衍生物可以是但不局限于其不同形式的鹽、修飾產(chǎn)物等。如在多肽的氨基、羧基、巰基上進行再修飾，所用修飾劑可以但不局限于
聚乙二醇、葡萄糖等。本發(fā)明的有益效果為①本發(fā)明的融合蛋白有且唯一具有促進脂肪分解的活性；②該融合蛋白在體內的半衰期較長；③融合蛋白在酵母中表達，表達后無需復性，便于純化；④純化步驟簡潔高效，終產(chǎn)品內毒素含量低，有利于臨床使用重組表達生產(chǎn)成本較低，效率高。


圖I 為質粒 pPIC9-HSA_hGH177_191 的構建過程；圖2 為質粒 pPIC9-HSA-L_hGH177_191 的構建過程；圖3 為質粒 pPIC9-hGH177_191-HSA_hGH177_191 的構建過程；圖4為pPIC9載體和融合基因的雙酶切電泳結果；圖5為畢赤酵母重組轉化子的PCR鑒定結果；圖6為純化后的融合蛋白的SDS-PAGE分析；圖7為融合蛋白PVDF膜免疫印跡分析；圖8為融合蛋白促進脂肪分解活性檢測結果。
具體實施例方式實施例I :HSA cDNA的克隆用PCR方法從人胎肝cDNA文庫中獲得不帶有信號肽編碼序列的HSAcDNA。設計的引物為HSA up :5，ATGCGAATTCGATGCACACAAGAGTGAGGTT 3，HSA dn :5’ ATGCGGATCCTAAGCCTAAGGCAGCTTGACT 3’ 上下游引物分別弓I入EcoRI和BamHI位點和保護堿基，劃線處為內切酶識別序列。PCR反應條件100 μ L反應體系中，加入I. 5 μ L肝組織cDNA (經(jīng)RNA提取試劑盒提取后逆轉錄而得到)，20ymol/L的上下游引物各I. 5μ L，IOmmoI/L的dNTP (脫氧核苷酸)I μ L，IOX反應緩沖液10 μ L，Taq DNA聚合酶O. 5 μ L，剩余用ddH20補足。用EPPEND0RF 公司的(型號為 Matstercycler Gradient) PCR 儀，PCR 反應條件為94°C預變性5min ;94°C變性40s ;54°C退火45s ;72°C延伸2min，共33個循環(huán)以后，再72°C延伸lOmin。通過O. 8%凝膠電泳分析得到預期為I. 8kb的條帶。PCR產(chǎn)物電泳純化用DNA片段回收試劑盒回收純化目的條帶。取純化的HSA cDNA3yL，加入IyL pGEM-T載體，5yL 2X反應緩沖液，I μ LT4DNA連接酶，16°C反應過夜，轉化新鮮制作的DH5a感受態(tài)細胞。轉化菌鋪于x-gal、IPTG和氨芐青霉素的LB瓊脂平板上，37°C培養(yǎng)過夜。挑取白色菌落，接種至5mL含SOyg/ml LB液體培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)過夜，用試劑盒進行小量質粒抽提，用EcoRI和BamHI雙酶切后進行電泳鑒定挑選片段插入的陽性克隆。從pGEM-T載體的多克隆位點兩端分別測序，完成HSAcDNA全長測序，獲得了含有序列正確的HSAcDNA的克隆。實施例2 :融合表達載體的構建
hGH177_191 是 hGH 的 C 末端的 15 個 AA,其氨基酸序列為H2N-Leu-Arg-Ile-Val_Gln-Cys-Arg-Ser-Val-Glu-Gly-Ser-Cys-Gly-Phe-OH。根據(jù)酵母偏愛的密碼子推導 IiGH177_191 的核苷酸序列為ctg aga ate gtt cag tgc aga tct gtt gag ggt tct tgt ggt ttc,構建的重組質粒，如圖1、2、3所示。以實施例I中構建的pGEM-T-HSA質粒為模板，PCR體外擴增得到HSA基因和hGH177_191片段的融合基因。用引物I和4互為上下游引物擴增得到融合基因HSA-L-hGH177_191，用引物3和2互為上下游引物擴增得到融合基因hGH177_191-HSA_hGH177_191。用引物I和2互為上下游引物擴增得到融合基因HSA-hGH177_191。表I :用于重組表達載體構建的引物
PrimerSequence(SW)
1(HSA up)5，-GCCTCGAGAAAAGAGATGCACACAAGAGTG
AGG'V
2(HSΑ-hGH,77-191 5，-CG-GAATTCCTAGAAACCACAAGAACCCTCAdn)ACAGATCTGCACTGAACGATTCTCAGTAAGCCTA AGGC AGCTTG AC-3’3(hGH177-19,-HSA- 5，-GC-CTCGAGAAAAGAATGCTGAGAATCGTTC
AGTGCAGATCTGTTGAGGGTTCTTGTGGTTTCChGH丨77_丨9丨 up)ACACAAGAGTGAGG-B5
4(HSA-L-hGH|77-i9i 5，-CG-GAATTCCTAGAAACCACAAGAACCCTCAdn)ACAGATCTGCACTGAACGATTCTCAGGGAACCACC ACC ACC-3’表I中上游引物中引入XhoI酶切位點(下劃線部分為限制性酶切位點)，下游引物引入EcoRI酶切位點(下劃線部分為限制性酶切位點)。粗體字部分為畢赤酵母中蛋白酶Kex2的識別位點氨基酸Lys和Arg的密碼子,加入這兩個氨基酸密碼子可以使表達的蛋白序列只含有預期的融合蛋白的肽序列。體外擴增的PCR反應體系為(Total 50 μ L)
權利要求
1.一種融合蛋白，包括兩個區(qū)域，其特征在于，第一區(qū)域為人血清白蛋白，第二區(qū)域為人生長激素脂肪分解結構域，人生長激素脂肪分解結構域的氨基酸序列為LRIVQCRSVEGSCGF。
2.如權利要求I所述的融合蛋白，其特征在于，包括連接第一區(qū)域和第二區(qū)域的連接肽。
3.如權利要求2所述的融合蛋白，其特征在于，所述連接肽的氨基酸序列為[GlyGlyGlyGlySer]n,其中η為I 10的自然數(shù)。
4.如權利要求I所述的融合蛋白，其特征在于，所述人血清白蛋白的氨基酸序列如SEQID NO. 2 所示。
5.一種編碼如權利要求I 4任一所述融合蛋白的基因。
6.一種包含權利要求5所述基因的重組質粒。
7.如權利要求6所述的重組質粒，其特征在于，原始載體為pPIC9。
8.一種包含權利要求5所述基因的表達系統(tǒng)。
9.如權利要求I所述融合蛋白的制備方法，包括 (1)構建包含融合蛋白基因的重組表達載體； (2)將重組表達載體酶切線性化，轉入畢赤酵母(Pichia.pastoris)GS115，獲得轉化子細胞； (3)對轉化子細胞進行誘導培養(yǎng)，從培養(yǎng)基中分離純化所述融合蛋白。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種人血清白蛋白與人生長激素脂肪分解結構域的融合蛋白，包括兩個區(qū)域，其中，第一區(qū)域為人血清白蛋白，第二區(qū)域為人生長激素脂肪分解結構域，人生長激素脂肪分解結構域的氨基酸序列為LRIVQCRSVEGSCGF。本發(fā)明融合蛋白有且唯一具有促進脂肪分解的活性；在體內的半衰期較長；在酵母中表達后無需復性，便于純化；純化步驟簡潔高效，終產(chǎn)品內毒素含量低，有利于臨床使用；重組表達生產(chǎn)成本較低，效率高。
文檔編號C12N1/19GK102827290SQ201210328039
公開日2012年12月19日 申請日期2012年9月7日 優(yōu)先權日2012年9月7日
發(fā)明者陳樞青, 王芙蓉, 吳敏, 沈其 申請人:浙江大學