專利名稱：一種蠟狀芽孢桿菌及其在促進(jìn)中國(guó)楓香生長(zhǎng)中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物肥料領(lǐng)域中的微生物肥料技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種蠟狀芽孢桿菌及其在促進(jìn)中國(guó)楓香生長(zhǎng)中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
中國(guó)楓香(Liquidambar formosana)為金縷梅科中國(guó)楓香屬落葉大喬木,又稱路路通，葉片三裂，稱為“三角楓”。中國(guó)楓香樹(shù)高干直，樹(shù)冠寬闊，氣勢(shì)雄偉，深秋葉色紅艷，驕艷如醉，美麗壯觀，是優(yōu)美的園林觀賞樹(shù)種及我國(guó)南方著名的秋色樹(shù)種。中國(guó)楓香木材無(wú)不良?xì)馕?，故我?guó)出口的高檔茶葉，多運(yùn)用中國(guó)楓香木為包裝的材料。中國(guó)楓香自然分布在中國(guó)長(zhǎng)江流域及其以南地區(qū)，西至四川、貴州，南至廣東，東至臺(tái)灣。垂直分布一般在海拔1000 1500m以下之丘陵及平原。深根性，主根粗長(zhǎng)，抗風(fēng)力強(qiáng)。幼年生長(zhǎng)較慢，入壯年后生長(zhǎng)轉(zhuǎn)快(方根深，2003)。中國(guó)楓香是我國(guó)亞熱帶地區(qū)優(yōu)良速生落葉闊葉樹(shù)種，無(wú)嚴(yán)重病蟲(chóng)害，落葉豐富，改土效果好(林￡，等，1985)，其適應(yīng)性廣、生長(zhǎng)迅速，屬典型的“荒山先鋒”樹(shù)種。維護(hù)地力效果明顯，生態(tài)效益好，是人工林樹(shù)種結(jié)構(gòu)調(diào)整的首選樹(shù)種之一。在觀賞、藥用、用材等方面都具有重要作用。近年來(lái)，中國(guó)楓香在生產(chǎn)、科研上備受重視，是很有潛力的造林綠化樹(shù)種。磷是植物生長(zhǎng)發(fā)育的重要物質(zhì)基礎(chǔ)，是植物體內(nèi)核酸及多種酶、輔酶、ATP等的重要組成成分，這些物質(zhì)對(duì)于細(xì)胞來(lái)說(shuō)是至關(guān)重要的。土壤中的磷總量并不少，但我國(guó)有74%的耕地土壤缺磷，土壤中95%以上的磷為無(wú)效形式，植物很難直接吸收利用(楊遷等，2001)。作物的磷肥當(dāng)季利用率一般只有59TlO%，大部分磷肥作為無(wú)效態(tài)(難溶態(tài))在土壤中積累(王光華，2004)。有機(jī)磷化物是土壤磷的重要組成部分，約占土壤總磷量的I/3 I/2。土壤中的有機(jī)磷不能被植物直接吸收，它們?cè)谖⑸锓置诘拿傅淖饔孟?，逐步降解，最終釋放出可以利用的無(wú)機(jī)態(tài)的磷才可被植物吸收利用，這種過(guò)程也被稱為有機(jī)磷的礦化作用。土壤磷素循環(huán)是以微生物活動(dòng)為中心的。我們把能夠?qū)⒅参镫y以吸收利用的磷轉(zhuǎn)化為可吸收利用形態(tài)的微生物稱為解磷菌或溶磷菌(Phosphate-solubilizingmicroorganisms, PSM)。土壤中有機(jī)磷化合物主要有機(jī)酵磷酸鹽、植酸鹽、磷脂等,我們把能夠?qū)㈦y溶地含磷有機(jī)化合物轉(zhuǎn)化為簡(jiǎn)單的無(wú)機(jī)化合物的微生物稱為有機(jī)磷微生物。研究表明，土壤解有機(jī)磷微生物一般約占土壤微生物總數(shù)的30% 60%。與真菌、放線菌相比，植物根際細(xì)菌被認(rèn)為是最有效的解有機(jī)磷微生物。前蘇聯(lián)學(xué)者蒙金娜(1935)首次從土壤中分離到一株分解核酸和卵磷脂的能力很強(qiáng)的解巨大芽孢桿菌(Bacillus megatherium var. phosphaticum)菌株，接種土壤后使得P2O5含量提高了 15%以上，該菌株并于1947年大量生產(chǎn)使用。我國(guó)對(duì)解磷細(xì)菌的研究起步于50年代，從土壤中分離得到了一些分解有機(jī)磷能力很強(qiáng)的菌種。1950年，我國(guó)前東北農(nóng)科所從東北黑土中分離出能分解有機(jī)磷的巨大芽孢桿菌。20世紀(jì)80年代以后，國(guó)內(nèi)許多單位相繼開(kāi)發(fā)出了有多種芽孢桿菌組成的復(fù)合解磷菌制劑，微生物肥料的研究及開(kāi)發(fā)得到了高度重視。目前國(guó)內(nèi)外報(bào)道的降解有機(jī)磷細(xì)菌主要有芽孢桿菌屬(Bacillus)、假單孢菌屬(Pseudomonas)、埃希氏菌屬(Escherichia)、歐文氏菌屬(Erwinia)、土壤桿菌屬(Agrobacterium)、沙雷氏菌屬(Serratia)、黃桿菌屬(Flavobacterium)、腸細(xì)菌屬(Enterbacter)、微球菌屬(Micrococcus)、固氮菌屬(Azotobacter)、沙門(mén)氏菌屬(Salmonella)、色桿菌屬(Chromobacterium)、產(chǎn)喊菌屬(Alcaligenes)、節(jié)細(xì)菌屬(Arthrobacter)等十幾個(gè)屬。1958年，Sperber等發(fā)現(xiàn)不同土壤中解磷微生物的數(shù)量有很大的差異，大部分解磷微生物出現(xiàn)在植物根際土壤中。1962年，Katznelson對(duì)從從小麥根際解磷細(xì)菌的分布研究發(fā)現(xiàn)，從根表面上分離的解磷細(xì)菌的數(shù)量要比非根際土和根際土區(qū)高18倍和6倍。解磷菌表現(xiàn)出強(qiáng)烈的根際效應(yīng)可能與根際磷素營(yíng)養(yǎng)虧缺誘導(dǎo)有關(guān)，但是由于根際微生物的群落結(jié)構(gòu)受根系分泌物及根脫落物的影響，導(dǎo)致不同植物根圈微生物的組成差異很大，這種作用也影響解磷菌的群落組成。可以看出，從土壤中篩選高效解磷微生物，研制解磷菌劑施入土壤，活化土壤中難溶性磷以供植物吸收利用是低投入高產(chǎn)出的可持續(xù)發(fā)展途徑。但是研究發(fā)現(xiàn)，微生物具有強(qiáng)烈的根際效應(yīng)，不同土壤、不同作物根際及不同環(huán)境條件下，解有機(jī)磷細(xì)菌的種類和數(shù)量均有所不同。 目前，國(guó)內(nèi)外未見(jiàn)中國(guó)楓香解有機(jī)磷細(xì)菌方面的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種中國(guó)楓香根際高效降解有機(jī)磷化物的蠟狀芽孢桿菌。本發(fā)明還要解決的一個(gè)技術(shù)問(wèn)題是提供上述蠟狀芽孢桿菌在促進(jìn)中國(guó)楓香生長(zhǎng)中的應(yīng)用。為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下2011年11月從江西省南昌市林科院中國(guó)楓香根際土壤中，篩選獲得了一株高效降解卵磷脂的蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus) FXY-JX21,已保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心CCTCC，地址:中國(guó).武漢·武漢大學(xué)，郵編430072，保藏編號(hào)=CCTCC NO :M2012262，保藏日期2012年7月I日。CCTCC NO M 2012262菌株主要生物學(xué)特征在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基平板上，菌落較大，乳白色，圓形、平鋪、邊緣整齊，菌落表面干燥，有褶皺，無(wú)光澤；菌體桿狀，兩端鈍園，革蘭氏染色陽(yáng)性，大小約O. 95Χ1.45μπΓ2. 50X4. 10 μ m，中生芽孢，周生鞭毛；好氧，氧化酶反應(yīng)陽(yáng)性，接觸酶試驗(yàn)陽(yáng)性，3%氫氧化鉀試驗(yàn)陰性，淀粉水解試驗(yàn)陽(yáng)性，明膠水解陽(yáng)性，硝酸還原試驗(yàn)陽(yáng)性，甲基紅、VP陽(yáng)性，吲哚陽(yáng)性，經(jīng)伴胞晶體染色，未見(jiàn)伴胞晶體出現(xiàn)。CCTCC NO M 2012262 菌株 16SrDNA 基因序列，見(jiàn) SEQ ID No. I 所示。將所測(cè)16SrDNA序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列進(jìn)行BLAST比對(duì)。結(jié)果表明，F(xiàn)XY-JX21菌株與芽孢桿菌(Bacillus)同源性都很高，其中與Bacillus cereus的相似度為100%。結(jié)合形態(tài)、生理生化特征及16SrDNA序列分析，鑒定為蠟狀芽孢桿菌(Bacilluscereus)。上述蠟狀芽孢桿菌FXY-JX21在促進(jìn)中國(guó)楓香生長(zhǎng)中的應(yīng)用。CCTCC NO M2012262菌株菌劑盆栽接種試驗(yàn)表明，該菌劑明顯促進(jìn)了中國(guó)楓香的生長(zhǎng)發(fā)育。有益效果本發(fā)明的蠟狀芽孢桿菌CCTCC NO M 2012262在蛋黃平板培養(yǎng)條件下，在菌落周?chē)僧a(chǎn)生明顯溶磷圈；在液體振蕩培養(yǎng)條件下，對(duì)卵磷脂具有較好降解效果，與對(duì)照(CK)相比，差異顯著；本發(fā)明的蠟狀芽孢桿菌CCTCC NO M 2012262制成菌劑接種中國(guó)楓香實(shí)生苗，結(jié)果表明，該菌劑明顯促進(jìn)中國(guó)楓香實(shí)生苗的生長(zhǎng)發(fā)育。因此，本發(fā)明為開(kāi)發(fā)中國(guó)楓香磷細(xì)菌肥料提供了優(yōu)良的菌株資源。


蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus) FXY-JX21，已保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心CCTCC，地址:中國(guó).武漢·武漢大學(xué)，郵編430072，保藏編號(hào)=CCTCC NO M 2012262，保藏日期2012年7月I日。圖I為FXY-JX21菌株在蛋黃平板上溶磷圈。圖2為FXY-JX21菌株對(duì)卵磷脂降解能力。圖3為FXY-JX21菌株對(duì)一年生中國(guó)楓香接種90天后促生效果。
具體實(shí)施例方式根據(jù)下述實(shí)施例，可以使本領(lǐng)域的技術(shù)人員更好地理解本發(fā)明。實(shí)施例所描述的僅用于說(shuō)明本發(fā)明，而不應(yīng)當(dāng)也不會(huì)限制權(quán)利要求書(shū)中所詳細(xì)描述的本發(fā)明。實(shí)施例I :FXY_JX21平板解磷能力測(cè)定。卵黃培養(yǎng)基牛肉膏3. 0g，蛋白胨10. Og,氯化鈉5. Og,蒸餾水IOOOmL,瓊脂15. 0^18. 0g, pH 7. 0，滅菌，待溫度降至50°C左右時(shí)，每50mL中加入3 4mL新鮮蛋黃液(蛋黃與無(wú)菌生理鹽水等體積混合)，混勻，倒平板。將活化2次的FXY-JX21菌株用滅菌牙簽點(diǎn)接于卵黃平板上，30°C培養(yǎng)3天后，測(cè)量溶磷圈與菌落直徑，并計(jì)算溶磷圈與菌落直徑之比(圖I)。從圖I中看出，F(xiàn)XY-JX21菌株在卵黃平板上培養(yǎng)后，可產(chǎn)生明顯不透明的溶磷圈。經(jīng)測(cè)量與計(jì)算，溶磷圈直徑為64. 28mm，菌落直徑為42. 05mm，溶磷圈與菌落比達(dá)I. 53。實(shí)施例2 FXY-JX21液體解磷能力測(cè)定。蒙金娜培養(yǎng)基葡萄糖10. Og,硫酸銨O. 5g，氯化鈉O. 3g，氯化鉀O. 3g，七水硫酸鎂O. 3g,七水硫酸亞鐵O. 03g,四水硫酸猛O. 03g,卵磷脂O. 4g,碳酸 丐5. Og,蒸懼水IOOOmL,pH 7. O將活化2次的FXY-JX21菌株接種NA培養(yǎng)基(牛肉膏3. 0g，蛋白胨10. Og,氯化鈉5. 0g，蒸餾水IOOOmL,瓊脂18. 0g, pH 7. 2^7. 4)中，30°C培養(yǎng)2天后，無(wú)菌水沖洗菌體制成菌懸液，取ImL菌懸液于含50mL蒙金娜培養(yǎng)基的IOOmL三角瓶中，以接ImL滅菌菌懸液的蒙金娜培養(yǎng)基為對(duì)照(CK)，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，30 0C，200r/min振蕩培養(yǎng)72h后，發(fā)酵液4°C，10000r/min離心IOmin,鑰鋪抗比色法測(cè)定發(fā)酵液中可溶性磷含量(圖2)。從圖2中可看出，接種FXY-JX21菌株發(fā)酵液中可溶性磷含量為7. 87mg · L—1，是對(duì)照(I. 24mg · Γ1)的6. 35倍。綜上表明，F(xiàn)XY-JX21菌株對(duì)卵磷脂具有較強(qiáng)的降解能力。實(shí)施例3 FXY-JX21溫室盆栽試驗(yàn)。將FXY-JX21活化2 3次后，用接種環(huán)挑取少量菌體接種于含有50mL NB培養(yǎng)基(牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化鈉5g，蒸餾水IOOOmL, pH 7. 2 7. 4) IOOmL三角瓶中，30°C，200r/min振蕩培養(yǎng)48h。發(fā)酵液(4°C, 6000r/min)離心5min,用無(wú)菌生理鹽水潤(rùn)洗菌體3次后，無(wú)菌生理鹽水調(diào)節(jié)菌懸液(108cfu/mL)制成菌劑。接種中國(guó)楓香(苗齡60天)，以等量無(wú)菌生理鹽水為對(duì)照，接種量為5mL/株。每處理8個(gè)重復(fù)，置于溫室統(tǒng)一管理，光照為12h/天，適時(shí)澆水。FXY-JX21菌株接種90天對(duì)一年生中國(guó)楓香實(shí)生苗生長(zhǎng)的影響(見(jiàn)表I)。從表I和圖3可看出，接種FXY-JX21菌劑明顯促進(jìn)了中國(guó)楓香實(shí)生苗的生長(zhǎng)。接種處理中國(guó)楓香實(shí)生苗的苗高、地徑與CK相比均有不同程度的增長(zhǎng)。其中，苗高和地徑比CK分別增長(zhǎng)了37. 80% 和 32. 09%ο表IFXY-JX21菌株接種90天對(duì)中國(guó)楓香實(shí)生苗生長(zhǎng)的影響
處理 WR (mm) 增長(zhǎng)率(％) 地徑(mm) 增長(zhǎng)率(%)FXY-JX21 64.25 ± 5.33a 37.80 5.78 ± 1.05a32.09
CK 46.63 ± 4.19b—4.38 ± 0.31b—注P〈0. 05，同列不同行小寫(xiě)字母不相同代表差異顯著。
權(quán)利要求
1.一種蠟狀芽孢桿菌FXY-JX21，其分類命名為蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)，已保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心CCTCC，保藏編號(hào)CCTCC NO :2012262,保藏日期2012年7月I曰。
2.權(quán)利要求I所述的蠟狀芽孢桿菌在促進(jìn)中國(guó)楓香生長(zhǎng)中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種蠟狀芽孢桿菌FXY-JX21，其分類命名為蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)，已保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心CCTCC，保藏編號(hào)CCTCC NOM 2012262，保藏日期2012年7月1日。本發(fā)明還公開(kāi)了上述蠟狀芽孢桿菌在促進(jìn)中國(guó)楓香生長(zhǎng)中的應(yīng)用。FXY-JX21菌株對(duì)卵磷脂具有較強(qiáng)降解能力；FXY-JX21菌劑接種中國(guó)楓香實(shí)生苗，結(jié)果表明，該菌劑能明顯促進(jìn)中國(guó)楓香苗的生長(zhǎng)。因此，本發(fā)明為開(kāi)發(fā)中國(guó)楓香磷細(xì)菌肥料提供了優(yōu)良的菌株資源。
文檔編號(hào)C12N1/20GK102796691SQ201210328300
公開(kāi)日2012年11月28日 申請(qǐng)日期2012年9月6日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月6日
發(fā)明者徐國(guó)芳, 陳鳳毛, 任嘉紅, 張明艷 申請(qǐng)人:南京林業(yè)大學(xué)