番茄LoxD基因在調(diào)控植物抗性中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了番茄LoxD基因在調(diào)控植物抗性中的應(yīng)用。本發(fā)明提供了一種DNA片段，其核苷酸序列為序列表中序列2自5’末端第106-570位核苷酸。本發(fā)明還提供了LoxD蛋白及其編碼基因在調(diào)節(jié)植物抗蟲性和/或抗病性中的應(yīng)用，其中LoxD蛋白的氨基酸序列為序列表中的序列1；所述LoxD蛋白編碼基因的核苷酸序列為序列表中的序列2。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明通過抑制野生型番茄中LoxD基因的表達(dá)得到轉(zhuǎn)基因番茄，其抗病性和抗蟲性均低于野生型番茄，從而證明，抑制植物L(fēng)oxD基因的表達(dá)降低植物抗蟲性和抗病性，說明LoxD該基因與植物抗病性相關(guān)。
【專利說明】番茄LoxD基因在調(diào)控植物抗性中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種番茄LoxD基因在調(diào)控植物抗性中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]LOX(lipoxygenase,脂肪氧化酶)普遍存在于植物、動(dòng)物以及真菌中，近年來發(fā)現(xiàn)細(xì)菌中也存在該類酶。根據(jù)LOX催化氧化二烯鍵的位置不同，可以分為:9_lipoxygenase和13-lipoxygenase ;根據(jù)LOX蛋白是否定位于葉綠體中，可以把LOX分為Typel和Type2兩大類。在植物中，LOX不僅參與了其的生長(zhǎng)發(fā)育過程，在植物抵抗昆蟲咀食及機(jī)械損傷等抗性反應(yīng)方面也起重要作用。番茄、擬南芥以及其他物種的植物基因組中均有多個(gè)拷貝的Lox基因，且不同的Lox基因具有不同的生物學(xué)功能。在JA的生物合成過程中，LOX煙草RNAi誘導(dǎo)的Lox沉默抑制了 JA合成，從而導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因植株喪失了對(duì)昆蟲的抗性。擬南芥L0X-2的功能喪失破壞了受傷誘導(dǎo)的JA合成，但沒有影響花發(fā)育。另有文獻(xiàn)報(bào)道表明，擬南芥中的Lox3、Lox4也參與了 JA合成,而且1οχ31οχ4雙突的雄性花育性受到影響,導(dǎo)致雄性不育。玉米的性別決定因子TASSELSEED1是定位于質(zhì)體中的JA合成酶13-Lipoxygenase,TASSELSEED1的功能喪失造成玉米雄性花序不能正常發(fā)育。這些結(jié)果說明，LOX調(diào)控的JA合成在植物抗性反應(yīng)和育性方面具有重要作用。目前，在番茄中已分離得到6個(gè)Lox的同源基因，其中，LOXD參與JA合成，把從質(zhì)膜上釋放的ALA催化形成13-HP0T (13-Hydroperoxy-octadecatrienoic acid), 13-HP0T 在經(jīng)過 AOS, AOC, OPDA 及 ACXl 等一系列的酶促反應(yīng)，生成JA，進(jìn)而誘導(dǎo)一系列的信號(hào)轉(zhuǎn)到途徑。早在1997年，LoxD基因被克隆出來，但對(duì)LoxD的基因功能仍有待更為詳盡的研究。
`[0003]已有研究表明，在過量表達(dá)系統(tǒng)素前體基因(Prosystemin)的轉(zhuǎn)基因番茄(35S: Prosystemin, 35S: PS)中，茉莉酸誘導(dǎo)的抗性蛋白組成型地高表達(dá)，因而對(duì)昆蟲的抗性大大提高。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種RNA分子。
[0005]本發(fā)明提供的RNA分子，為序列表中的序列2自5’末端第106-570位核苷酸所示的DNA分子轉(zhuǎn)錄的RNA。
[0006]LoxD蛋白及其編碼基因在調(diào)節(jié)植物抗蟲性和/或抗病性中的應(yīng)用是本發(fā)明保護(hù)的范圍；在上述應(yīng)用中，所述LoxD蛋白的氣基酸序列為序列表中的序列I ;所述LoxD蛋白編碼基因的核苷酸序列為序列表中的序列2。
[0007]上述應(yīng)用中，所述調(diào)控植物抗蟲性和/或抗病性為如下I)或2):1)降低植物抗蟲性和/或抗病性；2)提高植物抗蟲性和/或抗病性。
[0008]上述應(yīng)用中，所述病為番茄灰霉病，所述蟲為棉鈴蟲。
[0009]上述應(yīng)用中，所述番爺灰霉病的病原菌為灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)。[0010]上述應(yīng)用中，所述植物為單子葉植物或雙子葉植物，所述雙子葉植物具體為番茄。
[0011]本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法。
[0012]本發(fā)明提供的方法，為失活或抑制目的植物中LoxD蛋白編碼基因表達(dá)，得到轉(zhuǎn)基因植物；所述轉(zhuǎn)基因植物具有如下I)和2)中至少一種的特性:
[0013]I)所述轉(zhuǎn)基因植物的抗蟲性低于所述目的植物；
[0014]2)所述轉(zhuǎn)基因植物的抗病性低于所述目的植物。
[0015]所述病為番茄灰霉病，所述番茄灰霉病的病原菌具體為灰葡萄孢菌(Botrytiscinerea);所述蟲為棉鈴蟲。
[0016]上述方法中，所述目的植物為單子葉植物或雙子葉植物，所述雙子葉植物具體為番爺。
[0017]上述方法中，所述LoxD蛋白的氨基酸序列為序列表中的序列I ;所述LoxD蛋白編碼基因的核苷酸序列具體為序列表中的序列2。
[0018]上述應(yīng)用或上述方法中，上述抗蟲性通過經(jīng)蟲取食植物后，植物中抗蟲蛋白表達(dá)量和/或取食后蟲體重量體現(xiàn)；上述抗蟲蛋白具體為P1-1I ；
[0019]上述抗病性通過接種病原菌后，植物葉片菌斑直徑和/或植物葉片中與抗病相關(guān)基因(P1-11、PRlbl 和 / 或 Solyc07g006380)表達(dá)體現(xiàn)。
[0020]上述失活或抑制目的植物中LoxD蛋白編碼基因表達(dá)通過將用于失活或抑制目的植物中LoxD蛋白編碼基因表達(dá)的重組載體導(dǎo)入目的植物中實(shí)現(xiàn)；該重組載體為將DNA片段插入pCAMBIA 1301的多克隆位點(diǎn)間得到的載體；其中，該DNA片段由正向片段、內(nèi)含子和反向片段組成；所述反向片段核苷酸序列為正向片段的反向互補(bǔ)序列；所述正向片段的核苷酸序列為序列表中的序列2自5’末端第106-570位核苷酸；在本發(fā)明的實(shí)施例中，重組載體為pCAMBIA 1301-LoxDRNAi，為將上述DAN片段插入pCAMBIA1301的PstI酶切位點(diǎn)間得到的載體。
[0021]本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明通過抑制野生型番茄中LoxD基因的表達(dá)得到轉(zhuǎn)基因番茄，其抗病性和抗蟲性均低于野生型番茄，從而證明，抑制植物L(fēng)oxD基因的表達(dá)降低植物抗蟲性和抗病性，說明LoxD基因與植物抗病性相關(guān)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0022]圖1為抑制LoxD基因表達(dá)在降低番茄抵抗昆蟲
[0023]圖2為抑制LoxD基因表達(dá)在降低番茄抵抗Botrytis病毒
【具體實(shí)施方式】
[0024]下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0025]下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0026]下述實(shí)施例中定量實(shí)驗(yàn)，均重復(fù)三次，結(jié)果取平均值。
[0027]下述實(shí)施例中LoxD蛋白氨基酸序列為序列表中的序列I，其編碼基因LoxD的核苷酸序列為序列表中的序列2。
[0028]下述實(shí)施例中番茄采用番茄常規(guī)品種CM(Castlemart，以下也稱為野生型番茄)，購(gòu)自美國(guó)番爺遺傳資源中心(TGRC, http://tgrc.ucdavis.edu/)。[0029]實(shí)施例1、抑制LoxD基因表達(dá)的重組載體獲得
[0030]提取番爺(Solanum Iycopersicon)品種CM的總RNA,反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，用引物I和引物2進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
[0031]引物1:5' ~GCGCTCGAGAACCAGCAGTTTCAAGGAAGGAGG~3/ (上游引物，下劃線部分堿基為XhoI識(shí)別位點(diǎn))
[0032]引物2:5' -GCGACTAGTAACCGGACCACATGCAAACCCCT-3'(下游引物，下劃線部分堿基為SpeI識(shí)別位點(diǎn))
[0033]得到465bpPCR產(chǎn)物，經(jīng)過測(cè)序，該P(yáng)CR產(chǎn)物的核苷酸序列為序列表中序列2自5’末端第106-570位核苷酸，為L(zhǎng)oxD基因部分片段。
[0034]將上述PCR產(chǎn)物用XhoI和SpeI雙酶切后，與經(jīng)過同樣雙酶切的I3UCCRNAi載體(記載 Gan D, Zhang J, Jiang H, Jiang T, Zhu S，Cheng B.Bacterially expressed dsRNAprotects maize against SCMV infection.Plant Cell Rep.2010.29(11):1261-8.,公眾可從中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所獲得)連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α，挑選陽性克隆。提取陽性克隆的質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，該質(zhì)粒為在PUCC RNAi載體的XhoI和SpeI酶切位點(diǎn)間插入序列表中的序列2自5’末端第106-570位核苷酸,表明構(gòu)建的重組載體正確,記作PUCC-LoxD RNAi Forward。
[0035]將上述PCR產(chǎn)物經(jīng)過XhoI和SpeI雙酶切，與經(jīng)過同尾酶SalI和XbaI雙酶切的PUCC-LoxD RNAi Forward重組載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α，挑選陽性克隆。提取陽性克隆的質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，該質(zhì)粒為在F1UCC-LoxD RNAi Forward載體的SalI和XbaI中插入序列表中的序列2自5’末端第106-570位核苷酸，表明構(gòu)建的重組載體正確，記作PUCC-LoxDRNAi。
[0036]將構(gòu)建好的PUCC-LoxD RNAi載體用PstI酶切后，回收1175bp的片段，經(jīng)該片段與經(jīng)過同樣酶切的 PCAMBIA130`1 載體(記載 Cheng H, Song S，Xiao L, Soo HM, ChengZ, Xie D, Peng J.Gibberellin Acts through Jasmonate to Control the Expression ofMYB21, MYB24, and MYB57 to Promote Stamen Filament Growth in Arabidopsis.PLoSGenet.2009.5 (3): el000440.，公眾可從中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所獲得)連接，轉(zhuǎn)化DH5a，挑取單克隆進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，利用PstI酶切驗(yàn)證陽性質(zhì)粒(1175bp的為陽性)，命名為pCAMBIA 1301-LoxD RNAi，為抑制LoxD基因表達(dá)的重組載體。
[0037]實(shí)施例2、LoxD RNAi的轉(zhuǎn)基因番茄的獲得及功能鑒定
[0038]一、LoxD RNAi的轉(zhuǎn)基因番茄
[0039]1、抑制LoxD基因表達(dá)的重組菌獲得
[0040]將由實(shí)施例1得到的抑制LoxD基因表達(dá)的重組載體pCAMBIA 1301-LoxD RNAi轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌 AGLO (記載 Li C，Liu G, Xu C，Lee GI, Bauer P, Ling HQ, Ganal MW, HoweGA.The tomato suppressor of prosystemin—mediated responses2 gene encodes afatty acid desaturase required for the biosynthesis of jasmonic acid andthe production of a systemic wound signal for defense gene expression.PlantCell.2003.15 (7): 1646-1661.，公眾可從中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所獲得)，挑取單克隆，于含有卡那酶素與利福平抗生素的LB液體培養(yǎng)基中28°C過夜振蕩培養(yǎng)，得到轉(zhuǎn)化子。[0041]將轉(zhuǎn)化子進(jìn)行菌液PCR鑒定，采用引物I和引物2，得到465bp的為陽性重組菌，將陽性重組菌命名為AGLO/pCAMBIAl301-LoxD RNAi，并保存于_70°C備用。
[0042]2、LoxD RNAi的轉(zhuǎn)基因番茄
[0043]I)、番茄轉(zhuǎn)化相關(guān)培養(yǎng)基的配制
[0044]液體MS培養(yǎng)基:將4.4g MS鹽、30g蔗糖和水混合，用水定容至1L，用lmol/LKOH調(diào)pH至5.8~6.0之間，高壓滅菌。
[0045]種子生長(zhǎng)培養(yǎng)基(1/2MS培養(yǎng)基):將2.2g MS鹽、30g蔗糖和水混合，用水定容至1L，用lmol/L KOH調(diào)pH至5.8~6.0之間，加入0.8%的瓊脂，高壓滅菌。
[0046]預(yù)(共)培養(yǎng)培養(yǎng)基(Dl):將4.4g MS、1.0mg玉米素(Zeat in)和30g鹿糖溶于水中，用水定容至1L，用lmol/L KOH調(diào)pH至5.8~6.0之間，加0.8%的瓊脂，高壓滅菌。
[0047]篩選分化培養(yǎng)基(2Z):將4.4g MS鹽、2.0mg玉米素、50mg卡那霉素、IOOmg肌醇、
0.5mg葉酸和20g鹿糖溶于水中，用水定容至1L,用lmol/L KOH調(diào)pH至5.8~6.0之間，加0.8%的瓊脂，高壓滅菌。
[0048]生根培養(yǎng)基:將4.4g MS鹽、50mg卡那霉素、0.5mg葉酸、0.5mg吲哚丁酸和30g鹿糖溶于水中，用水定容至1L，用lmol/L KOH調(diào)pH至5.8~6.0之間，加0.8%的瓊脂，高壓滅菌。
[0049]2)、LoxD RNAi的轉(zhuǎn)基因番茄的制備
[0050](I)轉(zhuǎn)化外植體的`準(zhǔn)備
[0051]取野生型番茄(品種CM)，挑選飽滿、粒大種子，用40% NaCl浸泡20min，用無菌水沖洗5遍，播種于種子生長(zhǎng)培養(yǎng)基上，于25°C、16h光照/8h黑暗條件下光照培養(yǎng)。萌發(fā)8天后，在無菌條件下用鋒利的剪刀將子葉切成小方塊(動(dòng)作應(yīng)快)，將子葉小方塊接種于預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基中，于25°C、16h光照/8h黑暗條件下培養(yǎng)，2d后，可用于番茄轉(zhuǎn)化。
[0052](2)侵染液的準(zhǔn)備
[0053]將保存?zhèn)溆玫腁GLO/pCAMB IA 1301-LoxD RNAi接種于含相應(yīng)抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，28°C、200rpm過夜培養(yǎng)。次日以1:100的比例轉(zhuǎn)接至新的LB液體培養(yǎng)基中，28°C、200rpm培養(yǎng)至0D600=0.7。菌液以5000rpm離心IOmin,棄上清液,收集菌體。用液體MSO培養(yǎng)基重新懸浮菌體，稀釋至0D600=0.4后加入50uL 0.074mol/L的乙酰丁香酮，備用。
[0054](3)外植體的轉(zhuǎn)化、篩選與生根
[0055]將步驟(1)得到的子葉塊分別浸入(2)制備好的侵染液lOmin，然后接種于Dl培養(yǎng)基上(培養(yǎng)基上放濾紙)共培養(yǎng)2天，轉(zhuǎn)入到篩選分化培養(yǎng)基(2Z)中篩選培養(yǎng)，每2周繼代一次，培養(yǎng)8周后產(chǎn)生抗性芽。當(dāng)不定芽伸長(zhǎng)至3cm時(shí)，用解剖刀將抗性芽切下，并轉(zhuǎn)接至生根培養(yǎng)基上，進(jìn)行生根培養(yǎng)，將生根的Ttl代轉(zhuǎn)基因植株移入土中常規(guī)管理，收獲T1代LoxD RNAi的轉(zhuǎn)基因番茄種子。
[0056]上述共培養(yǎng)、篩選培養(yǎng)、生根培養(yǎng)的條件均為:溫度為25°C、16h光照/8h黑暗。
[0057]3)、LoxD RNAi的轉(zhuǎn)基因番茄的鑒定
[0058]將生長(zhǎng)18天的兩葉一心期的番茄葉片用止血鉗作機(jī)械損傷，在每個(gè)小葉垂直主葉脈的方向平行夾兩下，I小時(shí)后剪取植株地上部分，迅速用液氮速凍，-SO0C保存。提取T1 RLoxD RNAi的轉(zhuǎn)基因番茄葉片的RNA，反轉(zhuǎn)錄得到CDNA，以上游引物 F:ACTCATCAGCACCGACATCG，下游引物 R:ACTCTCCAGAAAGAACTCCTGC 為引物，以野生型番茄為對(duì)照，進(jìn)行RT-PCR。以actin為內(nèi)參，用于擴(kuò)增內(nèi)參基因的上游引物為F: TTGCTGACCGTATGAGCAAG，下游引物為 R: GGACAATGGATGGACCAGAC。
[0059]結(jié)果T1代LoxD RNAi的轉(zhuǎn)基因番茄中LoxD基因的相對(duì)表達(dá)量為0.0205 ；
[0060]野生型番茄中LoxD基因的相對(duì)表達(dá)量為0.0142 ；
[0061]可以看出，與野生型番茄比，T1 RLoxDRNAi的轉(zhuǎn)基因番茄中的LoxD基因的表達(dá)受到抑制，為陽性轉(zhuǎn)基因植物。
[0062]4)純合轉(zhuǎn)基因植物的獲得
[0063]將上述鑒定為陽性的T1代LoxDRNAi的轉(zhuǎn)基因番茄植株收種得到T2代種子，消毒后播在800 μ L/L潮霉素的1/2MS培養(yǎng)基上篩選(野生型CM在含潮霉素的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，其主根和地上部分都會(huì)受到嚴(yán)重抑制；轉(zhuǎn)基因材料由于具有潮霉素抗性生長(zhǎng)基本不受抑制)，對(duì)潮霉素有抗性的為T2代LoxDRNAi的轉(zhuǎn)基因番茄，得到純合體。
[0064]采用同樣的方法將空載體pCAMBIA 1301轉(zhuǎn)入野生型番茄中，得到Ttl代轉(zhuǎn)空載體番茄，收種、播種，直到得到T2代轉(zhuǎn)空載體番茄。采用同樣的方法檢測(cè)其LoxD基因相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果表明，T2代轉(zhuǎn)空載體番茄葉片中LoxD表達(dá)量與野生型番茄相比，無顯著差異。
[0065]二、LoxD RNAi的轉(zhuǎn)基因番爺對(duì)昆蟲抗性影響
[0066]1、昆蟲飼喂試驗(yàn)
[0067]棉鈴蟲(Helicoverpaarmigera)記載在文獻(xiàn)“Wu K., Y.Lu, H.Feng, Y.Jiang, andJ.Zha0.2008.Suppression of cotton bollworm in multiple crops in China in areaswith Bttoxin-containing cotton.Science.321 (5896): 1676-1678.，，中公開過，公眾可從
中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所獲得。
[0068]在昆蟲飼喂前，將轉(zhuǎn)基因番爺35S:PS (記載在“Howe GA, Lightner J, BrowseJ, Ryan CA.1996.An octadecanoid pathway mutant(JL5)of tomato is compromised insignaling for defense against insect attack.Plant Cell.1996.8(11): 2067-77.中，公眾可從中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所獲得)、野生型番茄、T2代轉(zhuǎn)空載體番茄和T2RLoxDRNAi的轉(zhuǎn)基因番茄在常規(guī)條件下培養(yǎng):光照16h，黑暗8h，光照強(qiáng)度70microeinsteins溫度25°C。待植物長(zhǎng)至4周時(shí),取長(zhǎng)勢(shì)一致的2齡期棉鈴蟲小心
放到植物上,任其自由取食。上述每個(gè)株系取20株進(jìn)行試驗(yàn)，每棵植株放3頭棉鈴蟲。
[0069]2、蛋白酶抑制劑II檢測(cè)
[0070]植物體內(nèi)的蛋白酶抑制劑是一種抵抗昆蟲侵害的抗性蛋白。這種富含絲氨酸的小分子量堿性蛋白質(zhì)分子，通過抑制昆蟲腸道內(nèi)消化酶的活性而達(dá)到抗蟲的目的。20世紀(jì)70年代Ryan教授發(fā)現(xiàn)，昆蟲侵害和機(jī)械損傷能夠誘導(dǎo)蛋白酶抑制劑的合成，蛋白酶抑制劑的表達(dá)量作為衡量植物對(duì)昆蟲抗性的強(qiáng)弱的重要指標(biāo)，是JA信號(hào)傳導(dǎo)途徑的下游基因，受JA上調(diào)，而LoxD是催化JA合成途徑中的第一個(gè)關(guān)鍵酶，因此，LoxD基因表達(dá)量的降低，導(dǎo)致JA含量的降低，最 終導(dǎo)致蛋白酶抑制劑II表達(dá)量的降低。
[0071]待到飼喂第7天時(shí)，對(duì)植物和棉鈴蟲進(jìn)行拍照記錄，并利用免疫擴(kuò)散測(cè)定蛋白酶抑制劑II含量，具體如下:
[0072]A.蛋白酶抑制劑II盤的制備
[0073]1)首先配制10 X buffer (放射免疫擴(kuò)散盤緩沖液)貯存液(500ml):
[0074]藥品重量終濃度[0075]Tris Base 12.1g 200mM Tris[0076]NaCl 45g 9% NaCl
[0077]調(diào)pH至8.5，用蒸餾水定容至500毫升，高壓滅菌，當(dāng)溶液冷卻后備用。
[0078]2)向 250ml 三角瓶?jī)?nèi)加入 100ml IXbuffer (10ml 10Xbuffer+90ml 蒸餾水)，同時(shí)加入磁棒在加熱磁力攪拌器上攪動(dòng)。
[0079]3)加入2g瓊脂(Noble Agar)，加熱直沸騰，使瓊脂顆粒充分溶解。
[0080]4)緩慢攪動(dòng)讓溶液逐漸冷卻至58°C,加入Iml的蛋白酶抑制劑II羊抗血清(用蛋白酶抑制劑II抗原免疫羊制得，該蛋白酶抑制劑II編碼基因的核苷酸序列為序列表中的序列3)，此溶液即為I %抗血清的免疫擴(kuò)散盤瓊脂固定液。
[0081]5)將Ilml該固定液加入一刻度方型的培養(yǎng)皿(Falcon351012Integrid)，使其完全蓋住培養(yǎng)皿的底部，形成均勻的一層。冷卻后用封口膜將其封閉，保存在4°C條件下備用。
[0082]B、蛋白酶抑制劑II含量放射免疫擴(kuò)散測(cè)定
[0083]I)分別收獲處理后的番茄受傷葉片(棉鈴蟲取食后的葉片)，研磨擠壓葉片。
[0084]2)吸取5μ I番茄葉片汁液加在已制備好的蛋白酶抑制劑II盤相應(yīng)的小方格中央的小孔中，放置24小時(shí)。
[0085]3)向蛋白酶抑制劑II盤中倒入7%的乙酸溶液，讓溶液覆蓋盤面，反應(yīng)5分鐘后，倒掉乙酸溶液，用蒸餾水沖洗。
[0086]4)結(jié)果觀測(cè)，精確測(cè)定蛋白酶抑制劑II盤內(nèi)的免疫擴(kuò)散環(huán)的直徑(厘米)，精確到毫米。應(yīng)用于下列公式計(jì)算出蛋白酶抑制劑II的含量。蛋白酶抑制劑II含量公式:蛋白酶抑制劑II含量(yg/ml汁液)=(環(huán)直徑數(shù)據(jù)X環(huán)直徑數(shù)據(jù)X 10000-625) X0.016。
[0087]結(jié)果如圖1所示，
[0088]IA為觀察35S:PS、野生型番茄和T2RLoxD RNAi的轉(zhuǎn)基因番茄的表型，可以看出，T2RLoxD RNAi的轉(zhuǎn)基因番茄在昆蟲飼喂實(shí)驗(yàn)中更容易受到傷害其植株葉片被棉鈴蟲幾乎咀食干凈。而昆蟲咀食后的35S:PS和野生型番茄仍然生長(zhǎng)正常。
[0089]川為355:?5、野生型番茄和1'2代1^?0 RNAi的轉(zhuǎn)基因番茄中蛋白酶抑制劑II含量結(jié)果，由圖可以看出，昆蟲咀食前，35S: PS的蛋白酶抑制劑含量為58.6mg/mL,野生型和T2代LoxDRNAi的轉(zhuǎn)基因番茄中蛋白酶抑制劑II含量均為O ;昆蟲咀食后，35S:PS，野生型和T2代LoxDRNAi的轉(zhuǎn)基因番茄葉片中蛋白酶抑制劑II含量分別為436.7mg/mL, 454.2mg/mL與18.6mg/mL ;表明，昆蟲咀食后，35S:PS和野生型植物葉片中的蛋白酶抑制劑II蛋白受到強(qiáng)烈誘導(dǎo)積累，而T2 RLoxD RNAi的轉(zhuǎn)基因番茄葉片中的蛋白酶抑制劑II蛋白并未受到明顯誘導(dǎo)。
[0090]IC為35S:PS、野生型番茄和T2代LoxD RNAi的轉(zhuǎn)基因番茄上的昆蟲生長(zhǎng)情況，可以看出，在飼喂7天時(shí)觀察，T2代LoxD RNAi的轉(zhuǎn)基因番茄上的昆蟲生長(zhǎng)健康，體重較大，這是由于T2 RLoxDRNAi的轉(zhuǎn)基因番茄中蛋白酶抑制劑II蛋白積累量非常少，所以昆蟲生長(zhǎng)健康，體重隨著飼喂時(shí)間而增加的速度也較35S:PS和野生型植株上的昆蟲快。
[0091]ID為35S:PS、野生型番茄和T2代LoxD RNAi的轉(zhuǎn)基因番茄上的昆蟲體重；在飼喂7天時(shí)，35S:PS、野生型番茄和T2代LoxDRNAi的轉(zhuǎn)基因番茄上的每只昆蟲的平均體重分別26.7mg、62.8mg 和 241.8mg。
[0092]野生型番茄和T2代轉(zhuǎn)空載體番茄的結(jié)果無顯著差異。[0093]從上述結(jié)果表明，LoxDRNAi的轉(zhuǎn)基因番茄在受到昆蟲嚼食后抗蟲蛋白蛋白酶抑制劑II積累少量甚至為0，同時(shí)在LoxD RNAi的轉(zhuǎn)基因番茄上的昆蟲體重增加，說明與35S:PS和野生型相比，LoxD RNAi的轉(zhuǎn)基因番茄對(duì)昆蟲的抗性顯著降低，表明LoxD基因具有抗蟲作用，抑制其表達(dá)會(huì)使抗蟲性降低。
[0094]三、LoxD RNAi的轉(zhuǎn)基因番茄對(duì)番茄灰霉病的病原菌侵染的影響
[0095]1、Botrytis的培養(yǎng)與孢子收集
[0096]番爺灰霉病的病原菌為灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)記載在AbuqamarS,ChaiMF, Luo H, Song F，Mengiste T.Tomato protein kinase Ib mediates signalingof plant responses to necrotrophic fungi and insect herbivory.PlantCell.2008.20(7): 1964-83.公眾可從中科院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所獲得。
[0097]挑取少量番爺灰霉病致病菌灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)菌絲,接種在potatodextrose agar (PDA)培養(yǎng)基上，于24° C光周期為12h/12h條件下培養(yǎng)20天時(shí)，收集孢子。用鑷子在培養(yǎng)基上刮取菌絲，放入滅菌水中，充分振蕩，使孢子脫離菌絲；利用8層紗布過濾懸浮液以去除菌絲，將濾液1000rpm離心8min ;小心倒掉上清液,用potato dextrosebroth(PDB)重懸孢子，利用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行孢子濃度計(jì)算并調(diào)至試驗(yàn)濃度5X IO5個(gè)，得到灰葡萄孢菌孢子液。
[0098]2、離體葉片接菌實(shí)驗(yàn)[0099]將35S:PS、野生型番茄、T2代轉(zhuǎn)空載體番茄和T2 RLoxDRNAi的轉(zhuǎn)基因番茄在常規(guī)條件下培養(yǎng):光照16小時(shí),黑暗8小時(shí),光照強(qiáng)度70microeinsteins HT2SA溫度25°C。待植物長(zhǎng)至4周時(shí)，選取生長(zhǎng)一致的植物，剪取第三葉位的番茄小葉，放于0.8%瓊脂板上，并將葉柄基部插于瓊脂中，在每片葉子中部滴加5μ L上述I得到的灰葡萄孢菌孢子液，放于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h，培養(yǎng)條件為:光照16小時(shí)，黑暗8小時(shí)，光照強(qiáng)度70microeinsteinsm_2s_2，溫度25°C。然后測(cè)量統(tǒng)計(jì)菌斑直徑。每個(gè)株系10株，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，結(jié)果取平均值。
[0100]表型觀察結(jié)果如圖2A所示，離體葉片接種灰葡萄孢菌孢子液3天，35S:PS和野生型的菌斑直徑較T2代LoxDRNAi的轉(zhuǎn)基因番茄的菌斑小，但二者之間沒有顯著差異，表現(xiàn)為感病性差。
[0101]離體葉片接種灰葡萄孢菌孢子液3天統(tǒng)計(jì)菌斑直徑結(jié)果如圖2B所示，35S:PS、野生型番茄和T2代LoxD RNAi的轉(zhuǎn)基因番茄的菌斑直徑分別為0.5cm、0.5cm和1.2cm ;可見T2代LoxDRNAi的轉(zhuǎn)基因番茄用菌侵染3天后，其菌斑直徑顯著高于35S:PS與野生型，幾乎是二者的2.4倍，表現(xiàn)為強(qiáng)感病性。
[0102]野生型番茄和T2代轉(zhuǎn)空載體番茄結(jié)果無顯著差異。
[0103]3、活體葉片接菌實(shí)驗(yàn)
[0104]I)活體葉片接菌
[0105]將35S:PS、野生型番茄、T2代轉(zhuǎn)空載體番茄和T2RLoxD RNAi的轉(zhuǎn)基因番茄在常規(guī)條件下培養(yǎng):光照16小時(shí),黑暗8小時(shí),光照強(qiáng)度70microeinsteins m_2s_2,溫度25。。。待植物長(zhǎng)至20天時(shí)，選取生長(zhǎng)一致的植物，在每片小葉上滴加5 μ L述I得到的灰葡萄孢菌孢子液，每片大葉滴加三片小葉，以保證每株植物滴加相同量的孢子。將滴有孢子液的植物放于密閉的有機(jī)玻璃箱中，確?；移咸焰呔秩镜母邼駰l件。每個(gè)株系5株，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，結(jié)果取平均值。[0106]分別于接種I天、2天和3天時(shí)取番茄葉片，并用液氮速凍，于-80°C保存，用于RNA提取，及后續(xù)的抗性基因表達(dá)分析。
[0107]2)抗病性基因表達(dá)檢測(cè)
[0108]A、番茄葉片RNA提取
[0109]總RNA的提取用Trizol法提取:
[0110]I)將各株系上述I)不同時(shí)間取的番茄葉片在液氮中磨成粉末后，取IOOmg葉片粉末轉(zhuǎn)入加有ImL Trizol提取液的RNase-free離心管中，震蕩混勻。
[0111]2)研磨液室溫(25°C)放置5分鐘，加入0.2mL氯仿，蓋緊離心管，劇烈搖蕩離心管20秒，室溫放置3分鐘。40C 12000g離心15分鐘。
[0112]3)取上層水相約600 μ L于一新離心管，加0.5mL異丙醇，室溫放置10分鐘，4°C，12000g離心10分鐘。
[0113]4)棄去上清液，加入ImL的75%乙醇，渦旋混勻，4°C下12000g離心I分鐘。
[0114]5)重復(fù)步驟4)，小心棄去上清液，然后室溫或真空干燥10分鐘，溶解于DEPC處理過的雙蒸水中，得到RNA。
[0115]B、單鏈cDNA的合成
[0116]I)在200 μ L的RNase-free離心管中加入下列試劑:
[0117]模板RNA (總 RNA)2 μ g
[0118]引物Oligo (dT)` 18 (0.5 μ g/μ L) I μ L
[0119]RNase-free ddH20補(bǔ)至 13 μ L
[0120]2)輕輕混勻后離心3~5s，70°C反應(yīng)5分鐘，迅速置于冰上冷卻5分鐘，然后加入:
[0121]
5XReaction Buffer5 μ Ij
dNTP Mix5 μ L
RNase InhibitorIpL
MMLV- RTIpL
[0122]3)終體積為25L。輕輕混勻后稍離心，42°C反應(yīng)60分鐘，94°C反應(yīng)5分鐘后，置冰上進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)或-20°C冷凍保存，得到cDNA。
[0123]C、熒光定量RT-PCR分析
[0124]I)反應(yīng)體系
[0125]SYBR Premix Ex Taq (2X ) 10 μ L
[0126]
上游引物0.5uL
下游引物0.5uL
cDNA0.5 μ L
ddH208.5 μ L
[0127]2)反應(yīng)程序
[0128]95°C,30s ；45cycles of (95°C, IOs ；60°C,20s ；72°C,20s)
[0129]3)數(shù)據(jù)分析[0130]Ct值為PCR管中熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。
[0131]ACt=Ct(Gene)-Ct(Actin),以2_ΔΜ的值衡量基因的轉(zhuǎn)錄水平。
[0132]涉及到的定量PCR分析表達(dá)的基因及所用引物如下所示:
[0133]內(nèi)參基因?yàn)锳ctin，用于擴(kuò)增內(nèi)參基因的上游引物為F:TTGCTGACCGTATGAGCAAG，下游引物為 R:GGACAATGGATGGACCAGAC ；
[0134]蛋白酶抑制劑II (P1-1I，該基因的核苷酸序列作為序列3)，用于擴(kuò)增蛋白酶抑制劑II的上游引物為F:AATTATCCATCATGGCTGTTCAC，下游引物為R:CCTTTTTGGATCAGATTCTCCTT ；
[0135]PRlbl (該基因的核苷酸序列為序列4)，用于擴(kuò)增PRlbl的上游引物為F:TGGTATTAGCCATATTTCACTC，下游引物為 R: CACATTGGTTGGTAGCGTAG ；
[0136]Solyc07g006380(該基因的核苷酸序列為序列5)，用于擴(kuò)增Solyc07g006380的上游引物為 F: GTCTTGGCAATGATGCTCTTTGTTAC，下游引物為 R: TGAGATTTTGTCAAATACACATGG。
[0137]上述抗病性基因表達(dá)的檢測(cè)結(jié)果如圖2C-E所示，具體如下:
[0138]圖2C為P1-1I基因的表達(dá)結(jié)果，從圖中看出，接種病原菌后，與35S:PS、野生型番茄相比，T2RLoxD RNAi的轉(zhuǎn)基因番茄中P1-1I基因的相對(duì)表達(dá)量顯著降低；且P1-1I在接種I天后表達(dá)量最高，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸下降。
[0139]圖2D為PRlbl基因的表達(dá)結(jié)果，從圖中看出，接種病原菌后，與35S:PS、野生型番茄相比，T2代LoxD RNAi的轉(zhuǎn)基因番茄中PRlbl基因的相對(duì)表達(dá)量顯著降低。
[0140]圖2E為Solyc07g006380基因(番茄中PDF1.2的同源基因)的表達(dá)結(jié)果，從圖中看出，接種病原菌后，與35S:PS、野生型番茄相比，T2RLoxD RNAi的轉(zhuǎn)基因番茄中Solyc07g006380基因的相對(duì)表達(dá)量顯著降低；且Solyc07g006380基因在接種I天時(shí)表達(dá)量最高，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸下降。
[0141]野生型番茄和T2代轉(zhuǎn)空載體番茄結(jié)果無顯著差異。
[0142]從上述結(jié)果可以看出，接種番爺灰霉病的病原菌灰葡萄孢菌Botrytis cinerea后，LoxDRNAi的轉(zhuǎn)基因番茄的葉片菌斑大小和抗病性基因P1-11、PRlbU Solyc07g006380表達(dá)量均低于35S:PS、野生型番茄，說明LoxD基因具有抗番茄灰霉病蟲作用，抑制其表達(dá)會(huì)使抗番爺灰霉病降低。
【權(quán)利要求】
1.一種RNA分子,為序列表中的序列2自5’末端第106-570位核苷酸所不的DNA分子轉(zhuǎn)錄的RNA。
2.LoxD蛋白及其編碼基因在調(diào)控植物抗蟲性和/或抗病性中的應(yīng)用；所述LoxD蛋白的氨基酸序列為序列表中的序列I ;所述LoxD蛋白編碼基因的核苷酸序列為序列表中的序列2。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于:所述調(diào)控植物抗蟲性和/或抗病性為如下I)或2):1)降低植物抗蟲性和/或抗病性；2)提高植物抗蟲性和/或抗病性。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于:所述病為番茄灰霉??；所述蟲為棉鈴蟲。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于: 所述番爺灰霉病的病原菌為灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)。
6.根據(jù)權(quán)利要求2-5中任一所述的應(yīng)用，其特征在于:所述植物為單子葉植物或雙子葉植物，所述雙子葉植物具體為番茄。
7.一種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，為失活或抑制目的植物中LoxD蛋白編碼基因表達(dá)，得到轉(zhuǎn)基因植物；所述轉(zhuǎn)基 因植物具有如下I)和2)中至少一種的特性: 1)所述轉(zhuǎn)基因植物的抗蟲性低于所述目的植物； 2)所述轉(zhuǎn)基因植物的抗病性低于所述目的植物。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于: 所述病為番茄灰霉病，所述番茄灰霉病的病原菌具體為灰葡萄孢菌(Botrytiscinerea);所述蟲為棉鈴蟲。
9.根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的應(yīng)用，其特征在于:所述目的植物為單子葉植物或雙子葉植物，所述雙子葉植物具體為番茄。
10.根據(jù)權(quán)利要求7-9中任一所述的應(yīng)用，其特征在于:所述LoxD蛋白的氨基酸序列為序列表中的序列I ;所述LoxD蛋白編碼基因的核昔酸序列具體為序列表中的序列2。
【文檔編號(hào)】C12N15/11GK103667265SQ201210328324
【公開日】2014年3月26日 申請(qǐng)日期:2012年9月6日 優(yōu)先權(quán)日:2012年9月6日
【發(fā)明者】李傳友, 閆留華, 王保, 翟慶哲 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所