專利名稱：轉(zhuǎn)基因玉米t25品系的環(huán)介導等溫擴增引物、試劑盒及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于食品檢驗技術(shù)方法領(lǐng)域，具體涉及一種食品中轉(zhuǎn)基因玉米T25品系環(huán)介導等溫擴增(LAMP)引物、試劑盒及檢測方法。
背景技術(shù)：
玉米是世界上重要的糧食作物之一，其單位面積產(chǎn)量位居榜首。世界范圍內(nèi)玉米害蟲高達350多種，其中以鱗翅目的玉米螟分布最廣、危害最重，是世界性的重要玉米害蟲，其嚴重影響著玉米的產(chǎn)量和品質(zhì)。近十多年來，轉(zhuǎn)基因植物培育取得突破，推出了一批新品種，在改善農(nóng)作物生產(chǎn)中發(fā)揮了明顯的作用，也顯露出巨大的潛力。然而，人們對轉(zhuǎn)基因玉米的安全性存在著很多的爭論。面對生物基因工程技術(shù)對我國經(jīng)濟利益帶來的沖擊和國外轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品對生態(tài)環(huán)境和消費者可能帶來的風險，對轉(zhuǎn)基因玉米進行檢測具有重要的現(xiàn)實意義。2009年，我國已經(jīng)解除了對玉米進口的限制，大批量的玉米已經(jīng)涌入中國。這勢 必對我國的農(nóng)業(yè)安全帶來沖擊。T25轉(zhuǎn)基因玉米品系是拜耳作物科學股份有限公司研發(fā)的產(chǎn)品，具有抗草銨膦除草劑的特性。在2004年4月6日首次獲得中國農(nóng)業(yè)部頒發(fā)的安全證書，是目前用于加工食品和詞料最多的品系之一。目前，轉(zhuǎn)基因玉米成分檢測方法主要為TaqMan實時熒光PCR方法和普通PCR方法。普通PCR方法由于操作繁瑣，污染環(huán)境、靈敏度低等不足已逐漸被實時熒光PCR檢測方法所取代。但是TaqMan實時熒光PCR檢測對技術(shù)要求相對較高且成本昂貴，目前急需制定在檢驗檢疫一線的基層實驗室能夠普遍適用的快速、簡便、準確的標準檢測方法。隨著分子生物學理論和技術(shù)的快速發(fā)展，以聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)技術(shù)為基礎(chǔ)的新型鑒定技術(shù)已日益得到廣泛應(yīng)用。環(huán)介導等溫擴增法(LAMP, Loop-mediated IsothermalAmplification)是在PCR基礎(chǔ)上創(chuàng)建的一種較理想的手段，其特點是①只需一恒定溫度就能擴增反應(yīng)，不需要特殊試劑，不需要預先進行雙鏈DNA的變性；②高特異性采用六個區(qū)段，四條引物，擴增特異性高，可以根據(jù)是否擴增來判斷目標基因的存在與否；③快速、高效擴增擴增在不到Ih即可完成，且產(chǎn)率高；④靈敏度高擴增模板可達10拷貝或更少； 鑒定簡便在核酸大量合成時，從dNTP析出的焦磷酸根離子與反應(yīng)溶液中的Mg2+結(jié)合，產(chǎn)生副產(chǎn)物-焦磷酸鎂乳白色沉淀可用肉眼觀察判斷擴增與否，也可以結(jié)合實時濁度法檢測設(shè)備檢測；如果加入顯色液，也可通過顏色變化觀察判定結(jié)果(即顯色法檢測)。另外，它利用恒溫和低反應(yīng)溫度(63°C)，減少細胞損傷，檢測人員實際操作非常簡便?？傮w而言，LAMP法是一種簡便、快速、高特異的基因擴增法，不需要特殊的試劑和儀器設(shè)備，采用該方法能建立起總成本低廉的檢測體系，在轉(zhuǎn)基因食品檢測等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。目前尚未發(fā)現(xiàn)LAMP方法應(yīng)用于食品轉(zhuǎn)基因成分檢測的標準化研究
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明通過查閱轉(zhuǎn)基因玉米品系T25外源基因和植物基因組插入處接頭序列信息，并對玉米基因組DNA序列和載體序列的分析、查找、比對后，最終確定T25品系特有的序列；擴增的目的片段覆蓋玉米基因組和外源序列接頭部分。本發(fā)明通過考察并鎖定轉(zhuǎn)基因玉米T25品系靶基因(即AY629235、AX195438和AX695990中的序列SEQ ID NO :1)設(shè)計合成6套特異性LAMP引物，優(yōu)化體系，最后從中篩選出一套出峰時間早，信號強的LAMP T25引物，將反應(yīng)條件控制在63°C，45min進行檢測，成功建立了轉(zhuǎn)基因玉米T25品系鑒定的LAMP檢測方法，進而確定了 LAMP方法的技術(shù)參數(shù)(驗證弓I物特異性、靈敏度、穩(wěn)定性)，最后室內(nèi)驗證。本發(fā)明的LAMP T25引物包括兩個外引物和兩個內(nèi)引物，特異結(jié)合靶序列上的6個特異區(qū)域。內(nèi)引物FIP包含F(xiàn)lc (與Fl區(qū)域互補)和F2序列，內(nèi)引物BIP包含Blc (與BI區(qū)域互補)和B2序列，外引物為F3和B3序列，在內(nèi)外引物的基礎(chǔ)上引入環(huán)引物FLP和BLP (圖I),大大縮短了反應(yīng)時間。本發(fā)明的具體技術(shù)方案如下本發(fā)明涉及一種檢測轉(zhuǎn)基因玉米T25品系的環(huán)介導等溫擴增引物，其堿基序列為SEQ IDNO : 2 7，如表 I 表I轉(zhuǎn)基因玉米品系LAMP T25引物
I序歹ijIseq id no
F3GGAACGACTCMTGACAAGA2
B3AGAGGCATCTTCAACGATG3
FIP(Flc+F2) GGAATCCGAGGAGGTTTCCG-ATCTTCGTCAACATGGTGG4
BIP(Blc+B2) TTGCCCAGCTATCTGTCACTTT-GCAATGATGGCATTTGTAGG5
FLPTTGGAGTAGACAAGCGTGTC6
BLPTAGTGGAAAAGGAAGGTGGC7本發(fā)明的另一方面涉及一種轉(zhuǎn)基因玉米T25品系的環(huán)介導等溫擴增法檢測試劑盒，其檢測試劑盒包括檢測引物SEQ ID N0:2 7。優(yōu)選的情況下對于上述轉(zhuǎn)基因玉米T25品系的環(huán)介導等溫擴增法檢測試劑盒，其包括每25μL 的 LAMP 反應(yīng)體系，其包括SEQ ID NO : 2 3 各 O. 2 μ M、SEQ ID NO :4 5 各I. 6 μ M、SEQ ID NO :6 7 各 0.8 μ Μ、I X ThermoPol 緩沖液、0.8mM 甜菜堿、I. 4 mM dNTP、8UBstDNA大片段聚合酶；其中上述IXThermoPol 緩沖液為10 mM KCl, 20 mM pH 8. 8 的 Tris-HCl，IOmM (NH4)2SO4, 2 mM MgSO4 和 O. l%TritonX-100 ；上述試劑盒在使用過程中，除了按照上述25 μ L反應(yīng)體系加入上述試劑之外，還需要加入模板DNA和蒸餾水(補足25 μ L反應(yīng)體系)，再進行LAMP擴增反應(yīng)。
本發(fā)明的另一方面在于，公開一種利用上述轉(zhuǎn)基因玉米T25品系的環(huán)介導等溫擴增法檢測試劑盒，來檢測轉(zhuǎn)基因玉米T25品系的方法，其方法步驟包括①分別提取T25轉(zhuǎn)基因玉米品系標準樣品和待測樣品的基因組DNA ；②分別以步驟①精提的DNA作為模板，利用環(huán)介導等溫擴增法檢測每25 μ L 的 LAMP 反應(yīng)體系中DNA 模板 200ng、SEQ ID NO :2 3 各 O. 2 μ M、SEQIDNO :4 5 各 I. 6yM、SEQ ID NO :6 7 各 O. 8 μ Μ、I X ThermoPol 緩沖液、O. 8mM甜菜堿、I. 4mMdNTP、8U Bst DNA大片段聚合酶、蒸餾水余量；
其中上述IXThermoPol 緩沖液為10 mM KCl, 20 mM ρΗ8· 8 的 Tris-HCl，IOmM (NH4)2SO4, 2 mM MgSO4 和 O. l%TritonX-100 ；③環(huán)介導等溫擴增法的檢測結(jié)果以肉眼、濁度法或顯色法進行判斷。具體情況下對于上述的檢測轉(zhuǎn)基因玉米T25品系的方法，其所述步驟③中的濁度法利用LAMP實時濁度儀完成。具體情況下對于上述的檢測轉(zhuǎn)基因玉米T25品系的方法，其所述步驟③中的顯色法使用的顯色劑為熒光染料SYBR Green I。其中，環(huán)介導等溫擴增(LAMP)快速檢測技術(shù)結(jié)合實時濁度法或顯色法的檢測原理本發(fā)明根據(jù)轉(zhuǎn)基因玉米T25品系外源基因和玉米邊界序列設(shè)計特異性內(nèi)引物和外引物各一對特異結(jié)合靶序列上的6個特異區(qū)域，利用Bst酶啟動循環(huán)鏈置換反應(yīng)，在玉米T25品系特異靶序列啟動互補鏈合成，在同一鏈上互補序列周而復始形成有很多環(huán)的花椰菜結(jié)構(gòu)的莖-環(huán)DNA混合物；LAMP擴增效率很高，在反應(yīng)過程中，核酸大量合成，從dNTP析出的焦磷酸根離子與反應(yīng)溶液中的Mg2+結(jié)合，產(chǎn)生副產(chǎn)物白色焦磷酸鎂沉淀，因此可直接通過肉眼進行判斷或者對其濁度進行檢測；也可用結(jié)合雙鏈DNA的熒光染料SYBR GreenI染色，在紫外燈或日光下通過肉眼進行判定，如果含有擴增產(chǎn)物，反應(yīng)混合物變綠；反之，則保持SYBRGreenI的橙色不變，日本已利用這種特性研制出專門用于LAMP檢測的實時監(jiān)控濁度儀，可以實現(xiàn)對LAMP擴增過程的全程實時監(jiān)控。本發(fā)明的創(chuàng)新特征是⑴LAMP T25引物特異性較好，實施例中對非轉(zhuǎn)基因水稻，玉米，小麥，花生，大杏仁，綠豆，核桃，胡蘿卜，鷹嘴豆，羽扇豆，四季豆，桔子，白云豆，大豆，燕麥，番爺，轉(zhuǎn)基因玉米 M0N810、M0N863、M0N89034、BT176、GA21、BTlU NK603，轉(zhuǎn)基因油菜 RT73，轉(zhuǎn)基因大豆M0N88017、M0N89788、DP305423、DP356043、GTS40-3-2，轉(zhuǎn)基因土豆 EH92-527-1 等均無非特異擴增；(2)引物T25的靈敏度實驗果顯示該引物檢測限可達O. 5% ；(3)本項目研制的玉米T25品系特異性LAMP檢測引物和方法，檢測的特異性達到100%,性能參數(shù)等同于傳統(tǒng)PCR方法或熒光定量PCR方法，(4)引物T25的穩(wěn)定性實驗結(jié)果顯示引物1%，0. 5%及陰性精密度的穩(wěn)定性均良好;(5) LAMP法不需要PCR儀等昂貴、操作復雜的儀器，水浴鍋或恒溫裝置即可完成反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，通過觀察是否產(chǎn)生了白色沉淀或加入SYBR顯色劑觀察顏色變化就可判定反應(yīng)是否發(fā)生，操作簡便，適于基層推廣，具有很好的應(yīng)用前景。


圖I :LAMP T25引物的檢測原理；圖2 LAMP T25引物篩選的LAMP實時濁度法檢測結(jié)果；圖3 =LAMP弓丨物T25的靈敏度；圖4 LAMP T25引物特異性檢測結(jié)果；圖5 =LAMP引物T25檢測模板濃度為1%時的精密度；
圖6 =LAMP引物T25檢測模板濃度為O. 5%時的精密度；圖7 =LAMP引物T25檢測模板為ddH20時的精密度。
具體實施例方式下述非限制性實施例可以使本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員更全面地理解本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。本發(fā)明所述的非轉(zhuǎn)基因玉米樣品是為A0CS0406-A ;購自Sigma公司。本發(fā)明所述的T25轉(zhuǎn)基因玉米品系標準樣品為A0CS0306-H3 ;購自Sigma公司。(I)LAMP 反應(yīng)試劑Bst DNA 大片段聚合酶(Bst DNA polymerase large fragment), New EnglandBiolabs 公司；甜菜堿(Betaine)、MgCl2,Sigma 公司；dNTPs,寶生物工程(大連)有限公司；IOXThermoPol 緩沖液(貯存液)配制方法如下，100 mM KCl, 200 mM Tris-HCl(pH8. 8,25°C), 100 mM (NH4)2SO4, 20 mM MgSO4 和 l%TritonX_100。使用時，需做 10 倍稀釋。(2) SYBR Green I熒光染料，廈門致善生物科技有限公司；(3) LAMP引物(正向外引物F3、正向內(nèi)引物FIP、反向內(nèi)引物BIP、反向外引物B3、正向環(huán)引物FLP、反向環(huán)引物BLP)，由生工生物工程(上海)有限公司合成；(4) LAMP實時濁度儀，LA-320C，日本榮研化學株式會社；(5)本發(fā)明所述的對照樣品以及LAMP反應(yīng)體系中所使用的各種溶劑均由常規(guī)途徑制備或者商業(yè)途徑獲得。實施例I(一)LAMP反應(yīng)體系的建立與引物篩選用濃度為100%的T25轉(zhuǎn)基因玉米品系標準樣品，進行精提DNA，精提DNA的實驗方法參考《分子克隆實驗指南第三版》(薩姆布魯克D. W拉塞爾著·科學出版社2002 [美]J.黃培堂等譯)。精提DNA的濃度及純度的測定取5 μ L DNA溶液加ddH20梯度稀釋至lmL，使用核酸蛋白分析儀或紫外分光光度計測260nm和280nm處的光密度值。DNA的濃度按照以下公式計算獲得C=AXNX50/1000 式中C-DNA 濃度(μ g/ μ L)A——260nm處的吸光值
N——核酸稀釋倍數(shù)IOD260nm = 50 μ g/mL 雙鏈 DNA，當 0D26(l/0D28。比值在 L 7 L 9 之間時，適宜于 LAMP檢測。T25轉(zhuǎn)基因玉米品系標準樣品(即濃度為100%)，提取后基因組DNA濃度為IOOng/μ 1，[為方便表述，以下簡寫為T25DNA (100%，IOOng/μ I)]，作為陽性模板進行引物的初步篩選；所述的引物具體信息如下應(yīng)用LAMP T25引物，采用下述反應(yīng)體系，分別以上述精提的DNA作為模板，進行LAMP引物篩選與反應(yīng)體系的建立每25 μ L 的 LAMP 反應(yīng)體系中DNA 模板 200ng、SEQ ID NO :2 3 各 O. 2 μ M、SEQIDNO :4 5 各 I. 6yM、SEQ ID NO :6 7 各 O. 8 μ Μ、I X ThermoPol 緩沖液、O. 8mM甜菜堿、I. 4mMdNTP、8UBst DNA大片段聚合酶、蒸餾水余量； 其中上述IXThermoPol 緩沖液為10 mM KCl，20 mM ρΗ8· 8 的 Tris-HCl，IOmM (NH4)2SO4, 2 mM MgSO4 和 O. l%TritonX-100 ；LAMP (實時濁度法)具體操作步驟參照LAMP實時濁度儀使用說明書，將混合物置于反應(yīng)孔中，反應(yīng)條件為于63°C恒溫反應(yīng)60min，最后80°C下保溫5min以結(jié)束反應(yīng)，根據(jù)出峰時間初步篩選反應(yīng)條件。LAMP T25弓丨物的LAMP反應(yīng)結(jié)果如圖2，其中CHf 2兩組是指擴增模板為陰性對照的ddH20，這兩條擴增曲線在圖2中重合成一條直線(虛線)，證明沒有擴增，從而說明本實驗中沒有假陰性結(jié)果；CH3 4兩組是指擴增DNA模板為Τ2 ΝΑ( 100%，IOOng/μ I);這兩條擴增曲線在圖2中重合成一條擴增曲線(實線);證明本實驗中所設(shè)計的LAMP T25引物，出峰時間為25min左右。進一步將反應(yīng)時間控制在45min進行特異性和靈敏度等實驗。實施例2 LAMP引物T25的靈敏度為檢測LAMP引物T25的靈敏度，同時根據(jù)最低靈敏度出峰時間及假陽性最早出峰時間，確定反應(yīng)時間。重復實施例I的實驗方法，但將LAMP T25的模板和反應(yīng)條件進行下述調(diào)整①模板如下將轉(zhuǎn)基因玉米品系T25精提DNA (100%，IOOng/μ I)用非轉(zhuǎn)基因玉米A0CS0406-A DNA分別稀釋到10%，5%, 1%，O. 5%, O. 1%，O. 05%幾個梯度，每個稀釋度分別取
2μ I進行LAMP實驗；同時，以ddH20代替DNA模板作為陰性對照；再以轉(zhuǎn)基因玉米品系T25精提DNA (100%, IOOng/ μ I)作為陽性對照，分別進行LAMP擴增；通過實時濁度法檢測結(jié)果;②實施例I反應(yīng)條件中的恒溫反應(yīng)時間由“60min”改為“45min”。上述LAMP引物T25的靈敏度試驗結(jié)果如圖3所示，結(jié)果分析如下CHl組，其反應(yīng)的模板為陽性對照——T25基因組DNA (100%, IOOng/μ I)；CH2 5組的DNA模板為將轉(zhuǎn)基因玉米品系Τ25精提DNA (100%, IOOng/ μ I)用非轉(zhuǎn)基因玉米A0CS0406-A DNA分別稀釋到10%，5%，1%, O. 5%幾個梯度在圖3中都有對應(yīng)的擴增曲線(CHl飛組的擴增曲線在圖3中是實線)；CH6 7組的DNA模板為將轉(zhuǎn)基因玉米品系Τ25精提DNA (100%, IOOng/ μ I)用非轉(zhuǎn)基因玉米A0CS0406-A DNA分別稀釋到O. 1%, O. 05%。圖3中CH6 7組沒有擴增曲線，證明最低檢出限是O. 5% ；CH8組的DNA模板為陰性對照(ddH20)，在圖3中是平直的虛線；證明假陽性未出現(xiàn)；從圖3中可以看出，采用轉(zhuǎn)基因玉米品系T25 DNA用非轉(zhuǎn)基因玉米A0CS0406-ADNA稀釋至不同濃度梯度，T25作為LAMP引物進行LAMP擴增，出峰時間和濃度梯度呈明顯梯度變化，檢測靈敏度可達O. 5%。最低檢出限O. 5%約24min出峰，假陽性未出現(xiàn)，最終將反應(yīng)時間確定為45min。實施例3 LAMP弓丨物T25的特異性(實時濁度法)為驗證LAMP反應(yīng)的特異性，重復實施例2，將實施例2中LAMP反應(yīng)的模板DNA換成下述樣品的精提DNA，并分組
CHl組，其反應(yīng)的模板為陽性對照——T25基因組DNA (100%, IOOng/μ I)；CH2組的DNA模板為陰性對照(ddH20)；CH3 32依次為下述樣品的DNA :水稻，玉米，小麥，花生，大杏仁，綠豆，核桃，胡蘿卜，鷹嘴豆，羽扇豆，四季豆，桔子，白云豆，大豆，燕麥，番爺，轉(zhuǎn)基因玉米M0N810、M0N863、
M0N89034、BT176、GA21、BTlU NK603，轉(zhuǎn)基因油菜 RT73，轉(zhuǎn)基因大豆 M0N88017、M0N89788、DP305423、DP356043、GTS40-3-2，轉(zhuǎn)基因土豆 EH92-527-1。反應(yīng)體系和反應(yīng)條件如實施例2，LAMP T25引物特異性檢測結(jié)果如圖4，CHl組的DNA模板為陽性對照；在圖4中有對應(yīng)的擴增曲線(是實線)；CH2組的DNA模板為陰性對照(ddH20)，在圖4中是平直的虛線；證明假陽性未出現(xiàn)；CH3 32組的DNA模板在圖4中沒有擴增曲線，呈現(xiàn)為平直的虛線；證明本引物沒有非特異性的擴增，具有良好的特異性。實施例4穩(wěn)定性實驗(一)1%精密度實驗為驗證LAMP反應(yīng)的穩(wěn)定性，重復實施例2，將實施例2中LAMP反應(yīng)的模板DNA換成下述樣品的精提DNA，并分組將轉(zhuǎn)基因玉米品系T25精提DNA (100%, IOOng/μ I)用非轉(zhuǎn)基因玉米A0CS0406-ADNA稀釋到1%[即Τ25精提DNA (1%，Ing/ μ I)] 20個平行樣品作為模板，以ddH20代替DNA模板作為陰性對照，以轉(zhuǎn)基因玉米品系T25精提DNA (100%, IOOng/μ I)作為陽性對照，進行LAMP擴增，觀察1%精密度LAMP反應(yīng)的穩(wěn)定性。檢測結(jié)果如圖5，對結(jié)果分析如下CHl 陰性對照(超純水)；CH2 陽性對照(100%轉(zhuǎn)基因玉米品系T25 DNA)組，CH3 22 :1%轉(zhuǎn)基因玉米品系T25 DNA。檢測結(jié)果分析CH2組以及CH3 22組均為實線，均集中在2f27min之間出峰，部分峰形有重疊現(xiàn)象；陰性對照組CHl組沒有擴增出相應(yīng)的峰，是一條平直的虛線；顯示出1%精密度的穩(wěn)定性良好。(二)O. 5%精密度實驗為驗證LAMP反應(yīng)的穩(wěn)定性，重復實施例3，將實施例3中LAMP反應(yīng)的模板DNA換成下述樣品的精提DNA，并分組將轉(zhuǎn)基因玉米品系T25精提DNA (100%, IOOng/μ I)用非轉(zhuǎn)基因玉米A0CS0406-ADNA稀釋至IJ O. 5%[即T25精提DNA (O. 5%，O. 5ng/ μ I)] 20個平行樣品作為模板，以ddH20代替DNA模板作為陰性對照，以轉(zhuǎn)基因玉米品系T25精提DNA (100%, IOOng/ μ I)作為陽性對照，進行LAMP擴增，觀察O. 5%精密度LAMP反應(yīng)的穩(wěn)定性。檢測結(jié)果如圖6，對其結(jié)果分析如下 CHl 陰性對照(超純水)；CH2 陽性對照(100%轉(zhuǎn)基因玉米品系T2OTNA)組，CH3 22 0. 5%轉(zhuǎn)基因玉米品系T25 DNA ；檢測結(jié)果分析CH2組以及CH3 22組均為實線，均集中在2廣27min之間出峰，因此部分峰形重疊在一起；陰性對照組CHl組沒有擴增出相應(yīng)的峰，是一條平直的虛線；顯示出O. 5%精密度的穩(wěn)定性良好。
(三)陰性精密度實驗為驗證LAMP反應(yīng)的穩(wěn)定性，重復實施例2，將實施例2中LAMP反應(yīng)的模板DNA換成下述樣品的精提DNA，并分組以21份ddH20分別作為待檢樣品的模板和陰性對照的模板，以轉(zhuǎn)基因玉米品系T25精提DNA (100%, IOOng/μ I)作為陽性對照，以Τ25作為LAMP引物進行LAMP擴增，20個平行樣品觀察陰性精密度LAMP反應(yīng)的穩(wěn)定性。圖7為陰性精密度實驗LAMP反應(yīng)結(jié)果，對其結(jié)果分析如下；CHl 陽性對照(100%轉(zhuǎn)基因玉米品系T2OTNA)組，CH2 22 陰性對照(超純水)；CH2^22組為重疊的平直的虛線，均沒有擴增；這說明，①模板為ddH20的組沒有擴增，說明本發(fā)明沒有假陰性結(jié)果；②CHl組有擴增的曲線(實線)，說明陽性結(jié)果正常。結(jié)果顯示，CHl組有實線的峰形出現(xiàn)，而20份陰性平行樣品均沒有擴增峰出現(xiàn)，在圖7中對應(yīng)的是一條重疊的直線(虛線)，顯示出陰性樣品的精密度穩(wěn)定性良好。綜上，(一) (三)的實驗結(jié)果證明LAMP T25弓丨物的特異性好、檢測限可達(λ 5%，即Τ25的基因組DNA的濃度為O. 5ng/μ 1，靈敏度和穩(wěn)定性都較好。實施例5室內(nèi)驗證本發(fā)明設(shè)計一種轉(zhuǎn)基因玉米Τ25品系的環(huán)介導等溫擴增法檢測試劑盒，試劑盒包括的溶液每25 μ I的反應(yīng)體系中，包括SEQ ID NO :2 3各0.2 μ M、SEQ ID NO :4 5各I. 6 μ M、SEQ ID 吣6 7各0.8“] 、20 mM ρΗ8· 8 的 Tris-HCl、10 mM KCl,8 mM MgSO4UOmM(NH4)2S04、0. l%Tween20、lmM 甜菜堿、6 mM MgSO4U. 6 mM dNTP,8U Bst DNA 大片段聚合酶；蒸餾水，余量；其使用方法步驟包括①分別提取待測樣品的基因組DNA ；②分別以步驟①精提的DNA作為模板，利用上述25 μ I的反應(yīng)體系所包含的試劑，進行環(huán)介導等溫擴增法檢測63°C恒溫反應(yīng)45min，8(TC下保溫5min ；③環(huán)介導等溫擴增法的檢測結(jié)果以肉眼、濁度法或顯色法進行判斷。為評估LAMP方法的特異性，采用以下試驗方法進行對比試驗實時熒光PCR方法按照GB/T19495. 5 一 2004《轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測核酸定量PCR檢測方法》執(zhí)行。文獻中用于熒光定量PCR進行品系特異性檢測的序列分別為正向引物ACAAGCGTGTCGTGCTCCAC
反向引物GACATGATACTCCTTCCACCG探針序列為FAM-TCATTGAGTCGTTCCGCCATTGTCG-TAMRA分別對模擬樣品進行檢測，模擬樣品DNA的配制取非轉(zhuǎn)基因玉米樣品(A0CS0406-A，即空白樣品)的DNA溶液(濃度為lOOng/μ I)2份，用100%的轉(zhuǎn)基因玉米T25標準品的DNA對2份空白樣品的DNA進行添加，制備2個不同質(zhì)量濃度的T25模擬樣品DNA 即，將轉(zhuǎn)基因玉米品系T25精提DNA分別稀釋到1%( Ing/μ 1)、0· 5% (O. 5ng/ μ I),并簡稱為1%和O. 5%的模擬樣品DNA0分別對上述樣品以LAMP實時濁度法檢測，檢測結(jié)果如表2
表2 LAMP方法檢測結(jié)果(實時濁度法)
權(quán)利要求
1.ー種檢測轉(zhuǎn)基因玉米T25品系的環(huán)介導等溫擴增引物，其特征在于，堿基序列為SEQID NO :2 7。
2.—種轉(zhuǎn)基因玉米T25品系的環(huán)介導等溫擴增法檢測試劑盒，其特征在于，包括檢測引物SEQ ID NO :2 7。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的轉(zhuǎn)基因玉米T25品系的環(huán)介導等溫擴增法檢測試劑盒，其特征在于，所述的檢測試劑盒中 每25μ L的LAMP反應(yīng)體系，其包括SEQ ID NO :2 3各O. 2 μ M、SEQ ID NO : 4 5各1.6yM、SEQ ID NO :6 7 各 O. 8 μ Μ、I XThermoPol 緩沖液、O. 8mM甜菜堿、I. 4mM dNTP、8U BstDNA大片段聚合酶； 其中上述 IXThermoPol 緩沖液為10 mM KCl, 20 mM pH8. 8 的 Tris-HCl，IOmM (NH4)2SO4, 2 mM MgSO4 和 O. l%TritonX_100。
4.利用權(quán)利要求2所述試劑盒檢測轉(zhuǎn)基因玉米T25品系的方法，其特征在于，檢測步驟包括 ①分別提取T25轉(zhuǎn)基因玉米品系標準樣品和待測樣品的基因組DNA； ②分別以步驟①精提的DNA作為模板，利用環(huán)介導等溫擴增法檢測每 25 μ L 的 LAMP 反應(yīng)體系中DNA 模板 200ng、SEQ ID NO :2 3 各 O. 2 μ M、SEQ IDNO 4 5 各 I. 6yM、SEQ ID NO :6 7 各 O. 8 μ Μ、I X ThermoPol 緩沖液、O. 8mM 甜菜堿、I. 4mM dNTP、8U Bst DNA大片段聚合酶、蒸餾水余量； 其中上述 IXThermoPol 緩沖液為10 mM KCl, 20 mM pH8. 8 的 Tris-HCl，IOmM (NH4)2SO4, 2 mM MgSO4 和 O. l%TritonX-100 ； 反應(yīng)條件為63°C恒溫反應(yīng)45min，80°C下保溫5min ； ③環(huán)介導等溫擴增法的檢測結(jié)果以肉眼、濁度法或顯色法進行判斷。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的檢測轉(zhuǎn)基因玉米T25品系的方法，其特征在于，所述步驟③中的濁度法利用LAMP實時濁度儀完成。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的檢測轉(zhuǎn)基因玉米T25品系的方法，其特征在于，所述步驟③中的顯色法使用熒光染料SYBR Green I。
全文摘要
本發(fā)明公開一套LAMP檢測所用的引物適用于轉(zhuǎn)基因玉米T25品系特異性檢測，其堿基序列如SEQ ID NO2~7；采用LAMP檢測技術(shù)，結(jié)合濁度法或顯色法，建立了適用于食品中轉(zhuǎn)基因玉米T25品系特異性檢測標準方法，本發(fā)明所述方法操作簡單，在恒溫的條件下、不依賴昂貴儀器，檢測時間在1小時左右，方法靈敏度達到0.5%，檢測效率達到傳統(tǒng)PCR方法或熒光定量PCR方法，結(jié)果判斷簡單，又可大大降低檢測成本，能夠應(yīng)用于檢驗檢疫實際工作，尤其適用于大量樣品快速初篩和各種基層實驗室食品品質(zhì)監(jiān)控，也可作為傳統(tǒng)PCR方法的有益補充。
文檔編號C12Q1/68GK102816859SQ201210329428
公開日2012年12月12日 申請日期2012年9月7日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月7日
發(fā)明者徐君怡, 曹際娟, 齊震玉, 姜麗 申請人:徐君怡, 曹際娟, 齊震玉, 姜麗