專利名稱：一種簡(jiǎn)單快速的肉鴨糞樣總dna提取方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于動(dòng)物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，特別涉及動(dòng)物糞便中DNA的提取方法。
背景技術(shù)：
動(dòng)物腸道中存在約30個(gè)屬500多種不同的細(xì)菌，約I X IOltl個(gè)活細(xì)菌，形成了復(fù)雜而動(dòng)態(tài)平衡的微生態(tài)系統(tǒng)，動(dòng)物胃腸道內(nèi)龐大多樣的微生物群落與動(dòng)物的健康和疾病有密切的聯(lián)系，對(duì)宿主營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化、吸收及免疫機(jī)制激活、生長(zhǎng)發(fā)育等都起著十分重要的作用。若這種微生態(tài)平衡失調(diào)，則動(dòng)物機(jī)體正常的生理功能就會(huì)發(fā)生紊亂，導(dǎo)致疾病的發(fā)生、流行，對(duì)畜牧養(yǎng)殖業(yè)尤其是規(guī)?；B(yǎng)殖產(chǎn)生了極大的潛在威脅。因而，近年來(lái)對(duì)腸道微生物區(qū)系結(jié)構(gòu)及其多祥性研究成為當(dāng)前的熱點(diǎn)，但由于腸道的特殊生存環(huán)境，使得腸道中
有60% -80%的微生物目前無(wú)法用傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行研究，從而阻礙了人們對(duì)腸道微生物結(jié)構(gòu)及其多祥性的客觀認(rèn)識(shí)。迄今為止，腸道中只有極少部分微生物可以被培養(yǎng)，絕大多數(shù)還不為人所知。隨著分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，腸道微生物的研究也深入到了基因和作用機(jī)制水平，人們能避開(kāi)了傳統(tǒng)菌的群分離培養(yǎng)過(guò)程，直接從DNA水平上對(duì)這些腸道菌群進(jìn)行相關(guān)研究，從糞便樣品中提取高質(zhì)量的、具有代表性的腸道菌群總DNA是腸道微生物生態(tài)學(xué)研究的基礎(chǔ)。但由于糞便不但組成成分復(fù)雜(含有多聚糖、膽酸、膽鹽、膽色素、腐殖質(zhì)、動(dòng)物腸道脫落細(xì)胞及碎片、各種無(wú)機(jī)物和有機(jī)物等PCR的強(qiáng)抑制物)，而且糞便中細(xì)菌類型數(shù)目繁多，而不同細(xì)菌因其各自獨(dú)特的細(xì)胞壁成分和結(jié)構(gòu)，又對(duì)不同的提取方法的敏感程度有所差異，從而導(dǎo)致了不同方法的提取效率不盡相同，進(jìn)而使得腸道菌群多祥性分析結(jié)果不盡如人意，甚至造成偏差。目前糞便樣品總DNA并沒(méi)有標(biāo)準(zhǔn)、統(tǒng)ー的提取方法，因而，選擇較好的DNA提取方法對(duì)腸道微生態(tài)研究非常關(guān)鍵。目前，國(guó)內(nèi)外常用的DNA提取方法主要包括機(jī)械法，如硅珠法、凍融法等；化學(xué)法，如SDS法、苯酚法等；酶法如溶菌酶、蛋白酶K等和商業(yè)試劑盒法。這幾種類型的DNA提取方法中，機(jī)械法、化學(xué)法及酶或其組合方法是實(shí)驗(yàn)室常規(guī)提取方法。一般都是先用蛋白酶K、SDS、溶菌酶、超聲波或反復(fù)凍融來(lái)裂解細(xì)胞釋放出DNA，再用酚-氯仿、玻珠、_■氧化娃等進(jìn)行DNA的抽提，最后無(wú)水こ醇沉淀。這幾種常規(guī)的提取方法的優(yōu)點(diǎn)是原理清楚，便于分析及查找實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)的問(wèn)題，而不足在于所提取的DNA純度不高或者得率較低，常含有大量的PCR抑制物，除腸道菌基因組外，還摻雜動(dòng)物細(xì)胞、食物殘?jiān)幕蚪MDNA及雜質(zhì)，純度不夠理想，需要進(jìn)ー步純化處理才能用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)操作，如用蛋白酶K裂解糞便的同時(shí)還另外用十六烷基三甲基溴化銨來(lái)除去PCR反應(yīng)抑制物，并且還用酚-氯仿進(jìn)行了多次的抽提才得到較高純度的總DNA ；在用蛋白酶K提取糞便樣品總DNA后，再以聚丙烯酰胺葡聚糖柱子來(lái)純化所得到的總DNA。試劑盒法雖然操作簡(jiǎn)單、快捷、效率高，但所提總DNA濃度、得率低，價(jià)格較昂貴、處理大批樣品的科研成本太高，缺乏實(shí)驗(yàn)室通用性，不適于用于大規(guī)模糞便樣品總DNA提取。另外由于專利等其它原因，試劑盒中具體成分及其含量不是很清楚，如果發(fā)生操作失敗，很難分析找出實(shí)驗(yàn)失敗原因。因此，需要找到ー種新得能快速、高質(zhì)、高效、廉價(jià)及無(wú)害提取具有代表性的腸道菌群總DNA的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之ー在于提供肉鴨糞樣總DNA提取方法，操作簡(jiǎn)單、快速、高效、高質(zhì)且價(jià)格經(jīng)濟(jì)能適于實(shí)驗(yàn)室大規(guī)模提取的新方法。本發(fā)明主要包括糞便樣品的預(yù)處理、樣品DNA提取、PCR及電泳。以采集新鮮糞便樣品或凍存的糞便樣品為材料，先用PBS緩沖液等對(duì)糞便樣品進(jìn)行預(yù)處理，以獲得糞便樣品菌懸液，再以20-50 μ I的Clelex-100和30 μ L的O. 15molEDTA溶液組成的混合液，共同裂解細(xì)胞釋放DNA。為實(shí)現(xiàn)上述技術(shù)目的，本發(fā)明的技術(shù)方案為一種簡(jiǎn)單快速的肉鴨糞樣總DNA提取方法，具體包括以下步驟A預(yù)處理將肉鴨糞樣用緩沖液浸泡不少于5分鐘后，充分震蕩均勻，得肉鴨糞樣混懸液；將肉鴨糞便混懸液通過(guò)離心處理，去除雜質(zhì)并收集沉淀物I ;離心時(shí)，可將細(xì)菌沉淀于Eppendorf管中，并通過(guò)重復(fù)離心，收集細(xì)菌沉淀I入滅菌的離心管中；B 洗滌在步驟A所得沉淀物I中加入緩沖液，離心并去除上清液，重復(fù)離心處理至上清液無(wú)異色，得沉淀物II;C 提取在沉淀物II中加入蒸餾水，重懸并離心，取上清液II，加入蛋白酶K和EDTA溶液的混合液振蕩混勻，45-60°C水浴9-60分鐘；初次離心，棄上清液，得沉淀III ;在沉淀III中加裂解液和EDTA的混合液，并在低溫下使DNA復(fù)性；再次離心，取上清液III，所述上清液 III。進(jìn)ー步，在步驟A中，將肉鴨糞樣用相當(dāng)于其體積10倍的PBS溶液浸泡15分鐘。進(jìn)ー步，在步驟A中，離心處理的條件為4°C，10000轉(zhuǎn)/分鐘，離心至少6分鐘。進(jìn)ー步，在步驟B中，在所述沉淀物I中加入PBS溶液，沉淀物I與PBS溶液的添加比例為每200-300mg沉淀物I添加ImLPBS溶液。進(jìn)ー步，在步驟B中，離心處理的條件為10000轉(zhuǎn)/分鐘離心至少3分鐘。進(jìn)ー步，在步驟C中，在沉淀物II中加入與步驟B所述緩沖溶液等量的蒸餾水，重懸并離心，離心條件為10000轉(zhuǎn)/分鐘離心不少于3分鐘。進(jìn)ー步，在步驟C中，所述混合液中蛋白酶K和EDTA溶液的體積比3 2，所述蛋白酶K的初始濃度為20mg/ml，所述EDTA溶液的初始濃度為O. 15moL。進(jìn)ー步，在步驟C中，所述初次離心的條件是4°C，12000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘。進(jìn)ー步，所述蛋白酶K和所述EDTA溶液的體積比為3 2，所述沉淀物II與所述蛋白酶K的體積比為I 10-20 ;所述裂解液為Clelex-100，Clelex-100與EDTA溶液的體積比為20-50 30，所述沉淀III和所述Clelex-100的體積比為I 10-20，所述EDTA溶液的濃度為O. 15mol/L，所述蛋白酶K的濃度為20mg/mL。進(jìn)一歩，將步驟C所得上清液III中DNA為模板，其上游引物為5’ -aacgcgaagaaccttac-3’，其下游引物為5’ -gcgtgtgtacaagaccc-3’，PCR 的反應(yīng)條件預(yù)變性，94°C，5min ;變性，94°C 45s ;退火，56°C 45s ;延伸，72°C 45s，循壞 33 次；最后 72°C延伸IOrnin0本發(fā)明已進(jìn)行了廣泛的比較研究，通過(guò)分析所得糞便總DNA的濃度、純度、得率及16SrDNA全長(zhǎng)擴(kuò)增結(jié)果表明，本發(fā)明所得的DNA片段較完整、大小約為500bp，濃度、純度、得率高，所得DNA可直接作為PCR擴(kuò)增的模板，以及糞便微生態(tài)學(xué)等方面的研究。本發(fā)明簡(jiǎn)單方便，產(chǎn)量、得率和濃度及純度高且價(jià)格便宜。


圖I為本發(fā)明提取的DNA電泳檢測(cè)圖圖中編號(hào)1-3為重復(fù)3次平行提取的糞便總DNA ;編號(hào)4-6為常規(guī)酚氯仿法提取的糞便總DNA ;編號(hào)7-9為試劑盒法提取的糞便總DNA ；編號(hào)10為標(biāo)準(zhǔn)品；上樣量均為5 μし其中M為Marker DL-2000,分子量標(biāo)準(zhǔn)從下至上依次為 IOObp,250bp,500bp,750bp,IOOObp,2000bp。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明方法提取肉鴨糞便樣品總DNA。實(shí)驗(yàn)所用樣品為采集的麻鴨的糞便，所采集的糞便樣品于_20°C下保存，備用。實(shí)施例II預(yù)處理稱取備用的糞便樣于ー無(wú)菌的離心管A中，用10倍體積的PBS浸泡15分鐘；在實(shí)踐操作中，浸泡時(shí)間在不少于5分鐘，或用其它緩沖液替代PBS，均可實(shí)現(xiàn)除雜質(zhì)及離心分離的功能。浸泡完成后，于漩渦振蕩器上振蕩混勻，充分懸浮清洗菌體；混勻的懸液于4°C，500轉(zhuǎn)/分鐘后，離心10分鐘，去除粗顆粒(低速離心的目的在于去除糞便中的粗顆粒，除了離心之外，也可以采用如過(guò)濾等其它方式去除粗顆粒雜質(zhì))，將去除粗顆粒后的液體于另ー只50mL滅菌離心管內(nèi)B中；之后，4°C，10000轉(zhuǎn)/分鐘，離心6分鐘，收集沉淀物I于Eppendorf管中。通過(guò)重復(fù)離心，從保存的糞便樣品中轉(zhuǎn)移200-300mg離心后的細(xì)菌沉淀入2mL滅菌的離心管中。2 洗滌 在所得沉淀物I加入ImL PBS,振蕩15秒混勻，10000轉(zhuǎn)/分，離心3分鐘，傾去上清，得沉淀物II。重復(fù)此步驟至上清無(wú)異色。在沉淀物I中添加其它的緩沖溶液并通過(guò)其它離心條件也可達(dá)到對(duì)沉淀物的洗滌作用。在沉淀物II中加入蒸餾水，重懸并離心，取上清液II，加入蛋白酶K和EDTA溶液的混合液振蕩混勻，45-60°C水浴9-60分鐘；初次離心，棄上清液，得沉淀III ;在沉淀III中加裂解液和EDTA的混合液，并在低溫下使DNA復(fù)性；再次離心，取上清液III，所述上清液 III。3 提取在沉淀物II中加入ImL雙蒸水，振蕩混勻，10000轉(zhuǎn)/分鐘離心3分鐘，傾去上清，重復(fù)此步驟I次；取出離心管，10000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘后，吸取上清液II 450 μ L至另ー 2mL離心管中；加入30 μ L初始濃度為O. 15moL的EDTA溶液，20 μ L蛋白酶K(初始濃度為20mg/mL)(蛋白酶K和沉淀物II的體積比為10-20 I的范圍內(nèi)均可實(shí)現(xiàn))，振蕩混勻，55°C水浴消化，經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，O. 15-1小時(shí)均可實(shí)現(xiàn)水浴消化的效果；4°C，12000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，棄上清，得沉淀III，沉淀III可用于總DNA的提?。辉诔恋鞩II中加裂解液Clelex-100 (20-50 μ L均可，裂解液Clelex-100與沉淀III的體積比為10-20 I的范圍內(nèi)均可實(shí)現(xiàn)，優(yōu)選15 I)，和30 μ L初始濃度為O. 15moL的EDTA溶液，浸沒(méi)沉淀III。置于冰上3分鐘，使DNA復(fù)性。離心2分鐘，取上清，-20°C保存。測(cè)DNA含量備用。申請(qǐng)人:用本發(fā)明對(duì)同一肉鴨糞便樣品進(jìn)行了 3次的重復(fù)提取實(shí)驗(yàn)，如圖I所示，結(jié)果表明本發(fā)明方法的多次重復(fù)提取的實(shí)驗(yàn)效果基本一致，這說(shuō)明該發(fā)明方法非常地穩(wěn)定，適用于肉鴨糞便總DNA的大規(guī)模提取。實(shí)施例2對(duì)實(shí)施例I提取的DNA進(jìn)行16SrDNA的PCR擴(kuò)增檢測(cè)。應(yīng)用本實(shí)施例2提 取的 DNA 作為模板，以設(shè)計(jì)的引物U968f :5’ -aacgcgaagaaccttac-3 和 L1401r 5’ -gcgtgtgtacaagaccc-3’，擴(kuò)增糞便微生物16SrDNA V3區(qū)。利用常規(guī)方法、試劑盒法和本發(fā)明的方法制備的糞便總DNA IyL作PCR反應(yīng)的模板，分別擴(kuò)增糞便微生物的16SrDNAV3區(qū)。50 μ L PCR反應(yīng)體系組成如下
權(quán)利要求
1.一種簡(jiǎn)單快速的肉鴨糞樣總DNA提取方法，其特征在于，具體包括以下步驟 A預(yù)處理 將肉鴨糞樣用緩沖液浸泡不少于5分鐘后，充分震蕩均勻，得肉鴨糞樣混懸液，將肉鴨糞便混懸液通過(guò)離心處理,去除雜質(zhì)并收集沉淀物I ; B洗滌 在步驟A所得沉淀物I中加入緩沖液，離心并去除上清液，重復(fù)離心處理至上清液無(wú)異色，得沉淀物II ； C提取 在沉淀物II中加入蒸餾水，重懸并離心，取上清液II，加入蛋白酶K和EDTA溶液的混 合液振蕩混勻，45-60°C水浴9-60分鐘；初次離心，棄上清液，得沉淀III ;在沉淀III中加裂解液和EDTA的混合液，并在低溫下使DNA復(fù)性；再次離心，取上清液III，所述上清液111中含有總DNA。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種簡(jiǎn)單快速的肉鴨糞樣總DNA提取方法，其特征在于，在步驟A中，將肉鴨糞樣用相當(dāng)于其體積10倍的PBS溶液浸泡15分鐘。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種簡(jiǎn)單快速的肉鴨糞樣總DNA提取方法，其特征在于，在步驟A中，離心處理的條件為4°C，10000轉(zhuǎn)/分鐘，離心至少6分鐘。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種簡(jiǎn)單快速的肉鴨糞樣總DNA提取方法，其特征在于，在步驟B中，在所述沉淀物I中加入PBS溶液，沉淀物I與PBS溶液的添加比例為每200-300mg沉淀物I添加ImLPBS溶液。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種簡(jiǎn)單快速的肉鴨糞樣總DNA提取方法，其特征在于，在步驟B中，離心處理的條件為10000轉(zhuǎn)/分鐘離心至少3分鐘。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種簡(jiǎn)單快速的肉鴨糞樣總DNA提取方法，其特征在于，在步驟C中，在沉淀物II中加入與步驟B所述緩沖溶液等量的蒸餾水，重懸并離心，離心條件為10000轉(zhuǎn)/分鐘離心不少于3分鐘。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種簡(jiǎn)單快速的肉鴨糞樣總DNA提取方法，其特征在于，在步驟C中，所述混合液中蛋白酶K和EDTA溶液的體積比3 2，所述蛋白酶K的初始濃度為20mg/ml，所述EDTA溶液的初始濃度為0. 15moL。
8.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種簡(jiǎn)單快速的肉鴨糞樣總DNA提取方法，其特征在于，在步驟C中，所述初次離心的條件是4°C，12000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘。
9.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種簡(jiǎn)單快速的肉鴨糞樣總DNA提取方法，其特征在于，在步驟C中，所述蛋白酶K和所述EDTA溶液的體積比為3 2，所述沉淀物II與所述蛋白酶K的體積比為I 10-20 ;所述裂解液為Clelex-100, Clelex-IOO與EDTA溶液的體積比為20-50 30，所述沉淀III和所述Clelex-100的體積比為I 10-20，所述EDTA溶液的濃度為0. 15mol/L，所述蛋白酶K的濃度為20mg/mL。
10.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種簡(jiǎn)單快速的肉鴨糞樣總DNA提取方法，其特征在于，將步驟C所得上清液III中DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其上游引物為.5，_aacgcgaagaaccttac_3，，弓 1. :5，_gcgtgtgtacaagaccc_3，。
全文摘要
本發(fā)明屬于動(dòng)物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，特別涉及動(dòng)物糞便中DNA的提取方法，具體為將肉鴨糞樣用緩沖液浸泡并震蕩均勻，去除雜質(zhì)，收集沉淀物I，加入緩沖液，離心并去除上清液，離心處理至上清液無(wú)異色，得沉淀物II；在沉淀物II中加入蒸餾水，重懸并離心，取上清液II，加入蛋白酶K和EDTA混合液振蕩混勻水??；離心，棄上清液，得沉淀III；在沉淀III中加裂解液和EDTA的混合液，并在低溫下使DNA復(fù)性；離心取上清液III，所述上清液III中含有總DNA；本發(fā)明所得的DNA片段較完整、大小約為500bp，濃度、純度、得率高，所得DNA可直接作為PCR擴(kuò)增的模板，以及糞便微生態(tài)學(xué)等方面的研究。本發(fā)明簡(jiǎn)單方便，產(chǎn)量、得率和濃度及純度高且價(jià)格便宜。
文檔編號(hào)C12N15/10GK102851277SQ20121033008
公開(kāi)日2013年1月2日 申請(qǐng)日期2012年9月7日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月7日
發(fā)明者楊金龍, 劉作華, 黃勇, 付利芝, 彭祥偉, 鄭華, 沈克飛, 楊睿, 張素輝 申請(qǐng)人:重慶市畜牧科學(xué)院