專利名稱：一種糧食和/或其副產(chǎn)物中真菌毒素的生物降解方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種以被真菌毒素污染的小麥、玉米、大麥等糧食和/或其副產(chǎn)物為原料發(fā)酵的同時(shí)降解真菌毒素的方法。
背景技術(shù)：
真菌毒素是產(chǎn)毒真菌在危害過程做產(chǎn)生的一類次生代謝物質(zhì)，主要包括黃曲霉毒素、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(又稱嘔吐毒素，DON)、玉米赤霉烯酮(ZEN)和伏馬毒素(FUM)和赭曲霉毒素等，近幾年，由于我國(guó)極端氣候的頻繁出現(xiàn)，導(dǎo)致了以危害小麥、玉米為主的赤霉病的大流行，真菌產(chǎn)生的DON和ZEN污染加重，污染超標(biāo)的小麥和玉米不斷增加，為保障我國(guó)的人民消費(fèi)安全和畜牧養(yǎng)殖安全，國(guó)家糧食局及有關(guān)部門對(duì)2010年我國(guó)黃淮海地區(qū)小麥?zhǔn)斋@季節(jié)感染嚴(yán)重的赤霉病，DON大面積超標(biāo)毒素超標(biāo)小麥及時(shí)進(jìn)行了封存，共計(jì)174. 5 萬噸。由于缺乏行之有效的安全處理技術(shù)，目前仍處于封存狀態(tài)。2012年的小麥赤霉病大流行，導(dǎo)致我國(guó)安徽、江蘇、河南局部的小麥DON和ZEN毒素含量超標(biāo)嚴(yán)重。研究毒素超標(biāo)糧食的安全利用，不僅可保護(hù)我國(guó)農(nóng)民的種糧利益，同時(shí)防止流入口糧市場(chǎng)維護(hù)國(guó)家糧食食品質(zhì)量安全已迫在眉睫。對(duì)于真菌毒素的清除，目前國(guó)內(nèi)外較為普遍的方法主要有物理去除及吸附、化學(xué)處理等。吸附劑在吸附真菌毒素的同時(shí)還大量吸附了飼料和食品中的微量營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，被黏土吸附后的毒素，無法被分解，會(huì)引起二次污染。生物降解不僅可以高效將毒素轉(zhuǎn)化為無毒產(chǎn)物、環(huán)保安全，而且生物酶催化方法專一性強(qiáng)、轉(zhuǎn)化效率高。已經(jīng)成為當(dāng)前真菌毒素削減技術(shù)中最有發(fā)展前景的處理技術(shù)途徑，其不僅安全、環(huán)保、高效，而且利用現(xiàn)代生物技術(shù)開展研究非常符合當(dāng)前我國(guó)節(jié)能減排的發(fā)展趨勢(shì)。當(dāng)前利用真菌毒素污染糧食作為原料發(fā)酵生產(chǎn)乙醇是最主要的手段之一，但毒素在發(fā)酵生產(chǎn)得到的大量副產(chǎn)物酒糟中被進(jìn)一步濃縮，真菌毒素如DON、ZEN和FUM含量大大超過國(guó)家限量標(biāo)準(zhǔn)而不能利用。DDGS又稱酒糟蛋白，因其高蛋白、高有效磷、低植酸磷、高維生素等優(yōu)點(diǎn)，深受飼料業(yè)歡迎。DDGS作為常規(guī)蛋白質(zhì)飼料的重要替代品，它的使用大大緩解了我國(guó)常規(guī)蛋白質(zhì)資源缺乏現(xiàn)狀，有效降低了生產(chǎn)成本，但真菌毒素含量超標(biāo)嚴(yán)重，DDGS中真菌毒素含量幾乎達(dá)到發(fā)酵糧食原料的3倍，根據(jù)2010年DDGS市場(chǎng)調(diào)查，玉米赤霉烯酮檢出率為73%，嘔吐毒素檢出率為98%。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種糧食和/或其副產(chǎn)物中真菌毒素的生物降解方法，該方法是以被真菌毒素污染的糧食和/或其副產(chǎn)物為原料，通過構(gòu)建含有降解毒素酶基因的工程菌，在生產(chǎn)發(fā)酵產(chǎn)品的同時(shí)，高效降解發(fā)酵產(chǎn)物中真菌毒素含量，使其達(dá)到國(guó)家限量標(biāo)準(zhǔn)以下，無需在發(fā)酵結(jié)束后再對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行再次處理，不僅把真菌毒素含量超標(biāo)的發(fā)酵產(chǎn)物安全利用，而且產(chǎn)生巨大的經(jīng)濟(jì)效益和環(huán)保、社會(huì)效益。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案
本發(fā)明提供一種糧食和/或其副產(chǎn)物中真菌毒素的生物降解方法，該方法包括以下步驟( I)粉碎糧食和/或其副產(chǎn)物；(2)加入水進(jìn)行蒸煮，(3)冷卻，加入糧食和/或其副產(chǎn)物重量的O. 01-1%的糖化酶進(jìn)行糖化，進(jìn)一步地，優(yōu)選糖化酶的用量為O. 05-0. 4% ；(4)加入糧食和/或其副產(chǎn)物重量的O. 001-2%的含有真菌毒素降解酶基因的釀酒酵母工程菌菌株進(jìn)行發(fā)酵，進(jìn)一步地，優(yōu)選工程菌的添加量為0.01-1%，更進(jìn)一步為O. 08-0. 2% ;其中，所述真菌毒素降解酶的基因?yàn)橛衩壮嗝瓜┩到饷富?、脫氧雪腐鐮?菌烯醇降解酶基因和伏馬毒素降解酶基因中的一種或幾種；該步驟中所述玉米赤霉烯酮降解酶基因、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇降解酶基因和伏馬毒素降解酶基因可以是現(xiàn)有技術(shù)中已經(jīng)公開的降解酶基因，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以利用現(xiàn)有分子生物學(xué)方法構(gòu)建工程菌來實(shí)現(xiàn)本發(fā)明。為了詳細(xì)說明本發(fā)明的方法，本發(fā)明在實(shí)施例中也提供一種工程菌的構(gòu)建方法；(5)分別制得乙醇及酒糟；制得的乙醇就是常說的工業(yè)酒精；(6)將酒糟制成酒糟蛋白，并測(cè)定酒糟蛋白中真菌毒素含量，其中，脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的含量=500ug/kg;玉米赤霉烯酮的含量=60ug//kg;伏馬毒素的含量=IOOOug/kg。該步驟可以采用現(xiàn)有技術(shù)中已知的方法來實(shí)現(xiàn)，制成的酒糟蛋白由于真菌毒素含量達(dá)到國(guó)家限量標(biāo)準(zhǔn)以下，可以直接用來進(jìn)行飼料生產(chǎn)。進(jìn)一步地，所述糧食為小麥、玉米、大麥、稻谷或木薯等，糧食副產(chǎn)物是指淀粉、麥麩或玉米漿等。進(jìn)一步地，步驟(2)中，所述糧食和/或其副產(chǎn)物與水的重量比為1:2-1:8，優(yōu)選為1:3-1:4。進(jìn)一步地，步驟(4)中，所述發(fā)酵的條件為溫度保持30°C _35°C，發(fā)酵時(shí)間為60-120h。進(jìn)一步地，所述脫氧雪腐鐮刀菌烯醇降解酶的基因如序列表中SEQ ID NO :1所示，其對(duì)應(yīng)的氣基酸序列如序列表中SEQ ID NO 2所不；所述玉米赤霉稀麗降解酶的基因如序列表中SEQ ID NO :3所示，其對(duì)應(yīng)的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO :4所示；所述伏馬毒素降解酶基因如序列表中SEQ ID NO:5，其對(duì)應(yīng)的氨基酸序列如序列表中SEQ ID N0:6所
/Jn ο采用本方法具有以下優(yōu)點(diǎn)(I)本發(fā)明方法可大規(guī)模處理含有真菌毒素的糧食和/或其加工副產(chǎn)物，解決當(dāng)前缺乏行之有效處理技術(shù)，并產(chǎn)生顯著經(jīng)濟(jì)效益。因?yàn)?，該方法不僅破除了乙醇發(fā)酵副產(chǎn)物DDGS因真菌毒素超標(biāo)的質(zhì)量瓶頸，并且無需在發(fā)酵結(jié)束后再對(duì)包括DDGS等發(fā)酵產(chǎn)物的再次處理，減少能源消耗和環(huán)境污染，可推動(dòng)我國(guó)每年巨量的DDGS的“變廢為寶”的安全、高效和價(jià)值最大化利用。這不僅為我國(guó)大量真菌毒素超標(biāo)的糧食安全處理開辟了一條全新的技術(shù)途徑，而且也有助于大量的DDGS作為蛋白質(zhì)飼料等在畜牧業(yè)上的廣泛應(yīng)用緩解我國(guó)常規(guī)蛋白質(zhì)資源缺乏，降低飼料成本。更有助于節(jié)約、高效用糧、保障國(guó)家糧食食品質(zhì)量安全的目的。
(2)與物理、化學(xué)方法相比，不會(huì)產(chǎn)生二次污染，有利于節(jié)能減排，保護(hù)環(huán)境。(3)該方法可在不改變現(xiàn)有發(fā)酵條件的前提下使用，節(jié)約大量的財(cái)力和人力等成本。


圖I、本發(fā)明的生產(chǎn)工藝流程圖；圖2、發(fā)酵乙醇產(chǎn)生的DDGS中真菌毒素含量變化圖。具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。但這些實(shí)施例僅限于說明本發(fā)明而不 用于限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。下述實(shí)施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法。實(shí)施例I :具有降解能力的釀酒酵母工程菌的構(gòu)建I、從畢赤酵母(pichiapastoris) GSl 15中克隆GAP基因片段引物序列上游引物5-GCACTAGT TTT TTG TAGAAATG-3 (SEQ ID NO. 7 所示)下劃線為Spe I下游引物5-GGGAATCCATAGTT GTT CAATTG-3 (SEQ ID NO. 8 所示)下劃線為EcoRI.更換PYES2載體的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子為組成型GAP啟動(dòng)子(甘油醛磷酸脫氫酶組成型啟動(dòng)子)2、具有外分泌能力釀酒酵母表達(dá)載體的構(gòu)建根據(jù)已報(bào)道的畢赤酵母外分泌表達(dá)載體上編碼外分泌蛋白α交配因子編碼基因白勺序列(GenBank Accession No. HQ398363. 1)，設(shè)計(jì)如下引物，分別引入BamHI和XbaI識(shí)別位點(diǎn)上游引物P7 :5’ -CGCGGATCCATGAGATTTCCTTCAATTTT-3’ (SEQ ID NO. 9 所示)下劃線為Bam HI下游引物P8 :5’ -GCTCTAGATTAATTCGCGGCCGCCCTAG-3’ (SEQ ID NO. 10 所示)下劃線為Xba I用畢赤酵母表達(dá)載體pIC9k的質(zhì)粒DNA作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將得到PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序正確后，經(jīng)BamHI和XbaI雙酶切的處理后插入至pYES2載體上，獲得具有外分泌能力的表達(dá)載體SCWES2。3、降解酶基因表達(dá)載體的構(gòu)建(I)真菌毒素DON降解酶基因DONase的克隆A.將標(biāo)準(zhǔn)菌株尖抱鍵刀菌(Fusarium oxysporum) ACCC No. 36245 (購(gòu)自中國(guó)農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心)活化后接入PDA液體培養(yǎng)基(馬鈴薯200g/L，葡萄糖20g/L，瓊脂20g/L，pH自然)，然后將菌株的懸浮液接入IOOml同樣的培養(yǎng)基，搖床條件為220轉(zhuǎn)/分鐘，30°C，72小時(shí)。培養(yǎng)完成后用離心機(jī)12000轉(zhuǎn)/分鐘離心收集菌體。提取RNA (Trizol法)；B.以RNA為模板逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA序列；再cDNA序列為模板，在引物I和引物2的引導(dǎo)下進(jìn)行PCR反應(yīng)，擴(kuò)增脫氧雪腐鐮刀菌烯醇降解酶基因的序列。
上游引物Pl:5’ -GGAATTCCATATGACTGCACTAAACGTTACAAAC-3'(劃線部分堿基為 NdeI識(shí)別位點(diǎn))(SEQ ID NO. 11所示)上游引物P2 :5’ -CCCAAGCTTCTAGCCAATGAATTGCCCATAC-3’ (劃線部分堿基為Hind III識(shí)別位點(diǎn))(SEQ ID NO. 12 所示)在PCR反應(yīng)中，PCR反應(yīng)條件為94°C，保持5分鐘，接著按以下的溫度變化程序循環(huán)30次升溫至94°C，保持I分鐘，降溫至54°C，保持I分鐘，升溫至68°C，保持2分鐘；然后于68°C，保持10分鐘，最后于4°C保溫10分鐘，結(jié)束擴(kuò)增反應(yīng)。通過瓊脂糖電泳分析獲得約I. 4kb的單一帶，擴(kuò)增之后的PCR產(chǎn)物檢測(cè)之后將目的帶大小的擴(kuò)增產(chǎn)物用DNA凝膠回收試劑盒進(jìn)行回收，并檢測(cè)其濃度?；厥誔CR產(chǎn)物連接pMD19-T Vector轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109,獲得重組質(zhì)粒pMD19-Dasag測(cè)序鑒定。則該脫氧雪腐鐮刀菌烯醇降解酶基因DNA序列為序列表SEQ ID NO :I，其對(duì)應(yīng)的氣基酸序列為序列表SEQ ID NO :2。(2)真菌毒素ZEN降解酶基因ZDase的克隆
以標(biāo)準(zhǔn)菌株粉紅粘帚霉ACCCNo. 31535基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。設(shè)計(jì)如下引物，分別引入EcoRI和NotI識(shí)別位點(diǎn)(用下劃線標(biāo)出)上游引物P3 5' -CCG GAA TTC ATG CGC ACT CGC AGC ACA AT-3，(SEQ ID NO. 13所示)下游引物P4 5' -ATAAGAAT GCG GCC G CA AGA TAC TTC TGC GTAAAT T-3/ (SEQID NO. 14 所示)PCR反應(yīng)在50 μ LPCR反應(yīng)混合液中含有25 μ L KOD酶Mix，12. 5 μ moL/L引物各2μ L，模板10 μ L，加無菌水11 μ L調(diào)整至50 μ L.條件為94°C，變性5min，循環(huán)參數(shù)94°C變性40s ;54°C退火Imin ;68°C延伸Imin ；30個(gè)循環(huán)；68°C延伸IOmin使產(chǎn)物延伸完全。將得到PCR產(chǎn)物進(jìn)行I. 0%的瓊脂糖凝膠電泳，得到一條約O. Skb條帶，其大小與預(yù)期相當(dāng)，具體方法參見中國(guó)專利
發(fā)明者吳子丹, 孫長(zhǎng)坡, 任保中 申請(qǐng)人:國(guó)家糧食局科學(xué)研究院