專(zhuān)利名稱(chēng)：檢測(cè)東部馬腦脊髓炎病毒的核苷酸序列和試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基于MGB短探針的熒光RT-PCR方法檢測(cè)東部馬腦炎病毒的核苷酸序列和試劑盒，尤指快速的基于MGB短探針針對(duì)對(duì)6K和El靶區(qū)域的熒光定量RT-PCR檢測(cè)東部馬腦脊髓炎病毒的核苷酸序列和試劑盒，適用于東部馬腦脊髓炎病毒的快速分子生物學(xué)診斷和檢測(cè)，可用于東部馬腦脊髓炎病毒的檢測(cè)，出入境檢疫等，屬于動(dòng)物檢疫領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
東部馬腦脊髓炎病毒(easternequine encephalomyelitis virus, EEEV)屬于披膜病毒科(Togaviridae)甲病毒屬(Genus Alphavirus)的成員，病毒粒子呈球形,直徑60-65nm。有囊膜，囊膜上有糖蛋白纖突，核衣殼中包裹有單鏈的基因組RNA。是傳染性和致死率很高的人畜共患病，能感染以馬為代表的多種動(dòng)物宿主，存在極大的潛在威脅，是目前 國(guó)際社會(huì)列為防生物恐怖的主要種類(lèi)之一。主要表現(xiàn)為發(fā)病急，持續(xù)高熱，有嚴(yán)重中樞神經(jīng)系統(tǒng)癥狀。人感染后臨床表現(xiàn)與乙型腦炎很相似，對(duì)人致死率最高可達(dá)90%，EEEV為神經(jīng)性甲病毒，可引起人和動(dòng)物腦脊髓炎。自然狀態(tài)下，病毒在鳥(niǎo)類(lèi)和蚊子之間交替感染，人和馬是該病毒的終末宿主。在馬和人群中呈散發(fā)流行。主要發(fā)生于仲夏到秋末期間；主要臨床癥狀為發(fā)熱、厭食和精神高度沉郁，對(duì)于亞臨床感染病例，病癥相對(duì)溫和。在美國(guó)，該病小規(guī)模爆發(fā)幾乎年年都有，在東北部各州及佛羅里達(dá)，大量的馬匹散在發(fā)病，偶爾也有死亡數(shù)百匹馬的嚴(yán)重暴發(fā)。地方性EEEV的十分局限的滋生地可能反映它對(duì)媒介——黑尾賽蚊的嚴(yán)格需求。這種蚊越冬時(shí)成為幼蟲(chóng)，它需要陰暗、富含有機(jī)質(zhì)的潮濕環(huán)境。美國(guó)東部有這樣的環(huán)境。另外成年蚊的群體密度可以反映諸如雨量和溫度等氣候因素的變化。東方型馬腦炎流行的條件是在地方性流行地既需要大量的黑尾賽蚊群及與之相適應(yīng)的易感鳥(niǎo)群，同時(shí)還需要兼有嗜鳥(niǎo)血習(xí)性和嗜人或馬血習(xí)性的其他蚊群作為疫病的傳播媒介。這樣復(fù)雜的條件就限制了東方型馬腦炎的分布與流行范圍，所以該病在動(dòng)物和人群中的發(fā)生概率較低，而且地理上嚴(yán)格地限制在地方性流行區(qū)域。主要呈蚊一鳥(niǎo)傳播方式。蚊是病毒的傳播媒介，鳥(niǎo)是病毒的貯存宿主，該病毒在鳥(niǎo)類(lèi)體內(nèi)大量增值后，可以借助媒介昆蟲(chóng)而擴(kuò)大傳播范圍。蚊在吸食含有病毒的血液后，病毒可在蚊體內(nèi)增值并可達(dá)較高滴度，并持續(xù)終生存在。不同種蚊對(duì)病毒的感染閾(能使1% —5%蚊感染的病毒量)不同。其中，黑尾塞蚊(Culiseta melanura)是鳥(niǎo)類(lèi)中EEEV的主要傳播媒介。鳥(niǎo)類(lèi)對(duì)EEEV十分易感，在病毒傳播過(guò)程中，它們扮演著極為重要的角色，起著擴(kuò)大感染宿主范圍的作用。本病的傳播與蚊和鳥(niǎo)類(lèi)的分布密切相關(guān)。此外，EEEV還存在蚊一蚊傳播方式。其他無(wú)脊椎動(dòng)物如螨、鼠、蛇等嚙齒類(lèi)和爬行類(lèi)動(dòng)物在傳播EEEV上也有一定意義。本病不會(huì)經(jīng)氣溶膠傳播。EEEV為單股正鏈RNA病毒，全長(zhǎng)分別為11. 7kb。它們具有甲病毒屬特征的4個(gè)保守區(qū)，5’端前46nt形成帶柄的環(huán)狀，NSPl編碼區(qū)內(nèi)形成帶柄環(huán)狀，由24nt組成的42S與26S的結(jié)合部，位于3’端后和PolyA尾前19nt組成的區(qū)域?；蚪M編碼4種非結(jié)構(gòu)蛋白(NSP1 4)和5種結(jié)構(gòu)蛋白(衣殼蛋白C，包膜糖蛋白El、E2、E3，6K，基因排列順序?yàn)?’-C-E3-E2-6K-El-3’)。其中26S亞基因組RNA編碼衣殼蛋白、包膜糖蛋白E1\E2和6K信號(hào)肽。E2蛋白是該病的主要保護(hù)性抗原，具有7個(gè)部分重疊的抗原表位，分別與血凝抑制、中和病毒和抗病毒感染活性有關(guān)，而E2-1區(qū)中的C區(qū)是甲病毒屬特異性抗原表位，含病毒與細(xì)胞作用的受體。東部馬腦脊髓炎為我國(guó)一類(lèi)動(dòng)物疫病，國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局將其列為出入境檢驗(yàn)檢疫一類(lèi)動(dòng)物疫病，隨著動(dòng)物國(guó)際貿(mào)易的日益繁榮，特別是各大型國(guó)際體育賽事的日益頻繁，出入境的馬匹越來(lái)越多，同時(shí)由于參賽馬匹來(lái)自不同的國(guó)家和地區(qū)，健康狀況參差不齊，疫情非常復(fù)雜，這些因素都可能危害我國(guó)養(yǎng)馬業(yè)的發(fā)展和馬術(shù)運(yùn)動(dòng)的正常開(kāi)展，因此開(kāi)展東部馬腦脊髓炎的檢測(cè)技術(shù)就顯得尤為重要。根據(jù)臨床癥狀、流行病學(xué)以及組織病理學(xué)可對(duì)本病作出初步診斷。確診必須依靠病毒分離、鑒定，病毒抗原檢測(cè)，核酸快速檢測(cè)方法以及特異性血清學(xué)檢測(cè)方法。病毒分離
材料需要有新鮮的馬和其他發(fā)病動(dòng)物的腦以及媒介昆蟲(chóng)組織?？梢詫⒋龣z材料接種小鼠、豚鼠、雞胚、新生雛雞或倉(cāng)鼠腎原代細(xì)胞、雞胚或鴨胚原代細(xì)胞以及BHK-21細(xì)胞株進(jìn)行病毒分離。3周齡以下小鼠腦內(nèi)接種分離病毒方法最為敏感。病毒鑒定通常采用交叉中和試驗(yàn)進(jìn)行。亞型和抗原變異株的鑒定可以用針對(duì)El或E2糖蛋白的單抗進(jìn)行血凝抑制試驗(yàn)(HI)或者采用寡核苷酸指紋圖譜技術(shù)加以鑒別?？乖瓩z測(cè)方法包括固相反向補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)，免疫電鏡，雙抗體夾心ELISA檢測(cè)方法，間接免疫熒光方法。特異性抗體檢測(cè)方法包括中和試驗(yàn)，血凝抑制試驗(yàn)和ELISA檢測(cè)方法。分子生物學(xué)檢測(cè)方法由于快速簡(jiǎn)便，已經(jīng)開(kāi)始應(yīng)用于東部馬腦脊髓炎的快速診斷和檢測(cè)，特別是熒光RT-PCR檢測(cè)技術(shù)更為快速和特異。本研究為保證方法的通用性，保證探針的匹配性，我們?cè)诖罅啃蛄蟹治龌A(chǔ)上，設(shè)計(jì)特異性引物探針用于檢測(cè)東部馬腦脊髓炎病毒。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一組特異性強(qiáng)、靈敏度高的檢測(cè)東部馬腦脊髓炎病毒核苷酸序列，包括引物序列和MGB探針序列。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供快速、準(zhǔn)確、使用方便的檢測(cè)東部馬腦脊髓炎病毒的檢測(cè)試劑盒。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案選擇東部馬腦脊髓炎病毒特定保守序列作為靶區(qū)域，在多重序列比對(duì)的基礎(chǔ)上，進(jìn)行引物和探針設(shè)計(jì)。引物長(zhǎng)度為23個(gè)堿基左右，GC含量為50% — 60%，引物內(nèi)無(wú)二級(jí)結(jié)構(gòu)和重復(fù)性，引物間和引物內(nèi)無(wú)互補(bǔ)序列，引物間的熔解溫度(Tm值)相差小于5°C。MGB短探針的長(zhǎng)度為18堿基。一組檢測(cè)東部馬腦脊髓炎病毒的核苷酸序列，如下1)5’ -GGG CCG GCT TTT TTA CTT GTC TG-3’ (SEQ ID NO 1)2)5，-GTA CGG GAT CCC CAC CTT GTT C_3，(SEQ ID NO 2)3)5，-[FAM]-CGC CTT GGG CGC CGC ARC-[MGB]-3，(SEQ ID NO 3)其中R代表A或G ;序列I)和2)分別為檢測(cè)東部馬腦脊髓炎病毒的正義引物和反義引物，序列3)為檢測(cè)東部馬腦脊髓炎病毒的熒光探針，探針的5’端標(biāo)記報(bào)告熒光基團(tuán)FAM (6-carboxy-突光素)，3’端標(biāo)記淬滅基團(tuán)MGB。我們采用TaqMan熒光RT-PCR檢測(cè)技術(shù)建立了東部馬腦脊髓炎病毒檢測(cè)方法，對(duì)反應(yīng)的各種條件進(jìn)行了優(yōu)化，其中包括引物探針的篩選，Mg2+使用濃度的優(yōu)化，引物探針濃度的優(yōu)化，得到以下試劑盒。檢測(cè)東部馬腦脊髓炎病毒檢測(cè)試劑盒，由以下組分組成I)裂解液購(gòu)自INVITR0GEN公司；2) RT-PCR反應(yīng)液，表I為反應(yīng)液配方；表I反應(yīng)液配方 組分終濃度
5XRT-緩沖液IX RT-緩沖液
25mM MgCl2I. 5mmol/L
2. 5mM dNTPO. 05mmol/L dNTP~
正義引物0. 3umol/L
反義引物0.3ymol/L
熒光探針O. 3umol/L5 X RT-緩沖液，25mM MgCl2購(gòu)于Promega公司；2· 5mM dNTP購(gòu)自大連寶生物生物工程有限公司，引物和探針均委托上?；瞪锕こ逃邢薰竞铣桑渲?XRT-緩沖液組成為 375mmol/L KCl、15mmol/L MgCl2、50mmol/L DTT、250mmol/LTris-HCl (ρΗ8· 3，25°C )。3)反轉(zhuǎn)錄酶 M-MLV，購(gòu)自 Promega 公司，200U/ μ L。4) RNA 酶抑制劑，購(gòu)自 Promega 公司，40U/ μ L。5) Taq DNA 聚合酶 5U/ μ L,購(gòu)自 Promega 公司。6)DEPC水，用自來(lái)水兩次蒸餾，經(jīng)過(guò)Millipore MILLI-Q PF PLUS純水儀純化，收取電阻率彡18. OM Ω. cm的水，Mi I Iipore-Q純化水加入DEPC至終濃度為O. 1%，37°C攪拌處理 12hr，151bf/in2(1034X105Pa)高壓蒸汽滅菌 15 分鐘。7)陰性對(duì)照東部馬腦脊髓炎病毒陰性組織樣品，用O. Olmol/L pH7. 2PBS緩沖鹽水制成20%懸液，151bf/in2(1034X105Pa)高壓蒸汽滅菌15分鐘。8)陽(yáng)性對(duì)照為體外轉(zhuǎn)錄的非感染性RNA片段?；厥諙|部馬腦脊髓炎病毒ssp.NorthAmerican variant 8765_10185nt RT-PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物，長(zhǎng)度為 1421bp，與 pMD_T20 載體(購(gòu)自TAKARA公司)進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化TOPlO感受態(tài)細(xì)胞，堿裂解法提取質(zhì)粒DNA，經(jīng)PCR和酶切鑒定后獲得陽(yáng)性重組質(zhì)粒，命名為PMD-T20-EEEV-8765-10185。以純化的質(zhì)粒為模板，將質(zhì)粒線性化之后，用Promega公司的Ribo MAXTM Large Scale RNA ProductionSystem-SP6試劑盒進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄；將體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物用DNase除去其中的DNA模板后經(jīng)TRIZOL提取后進(jìn)行測(cè)定后，即得到制備東部馬腦脊髓炎病毒陽(yáng)性對(duì)照品所需的RNA陽(yáng)性對(duì)照品母液。東部馬腦脊髓炎病毒ssp. North American variant 8765_10185nt基因片段如序列表中SEQ ID NO 4所示。對(duì)合成的引物和探針做HPLC分析，如得到單吸收峰圖譜、而且用紫外分光光度計(jì)測(cè)定0D260nm/0D280nm的比值在I. 6 - 2. O之間，即視為合格引物。對(duì)含有IO4拷貝數(shù)的RNA模板進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果顯示本發(fā)明提供的引物對(duì)與探針配合使用，擴(kuò)增的Ct值相對(duì)較低，且升幅較聞。將篩選好的引物濃度從O. 1“11101/1至0.8 4 11101/1以0· I μ mol/L為間距遞增，探針濃度從O. 025 μ mol/L至O. 2 μ mol/L以O(shè). 025 μ mol/L遞增。對(duì)引物和探針不同濃度的配比進(jìn)行了比較，從多次重復(fù)試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)采用表I所列引物濃度和探針濃度時(shí)熒光增幅相對(duì)較高。我們針對(duì)Roche Light Cycler2. O, Roche480 以及 ABI 7900HT 熒光 PCR 檢測(cè)儀， 在42°C /30min,94°C /3min的逆轉(zhuǎn)錄后，對(duì)該實(shí)驗(yàn)中對(duì)變性溫度和時(shí)間、退火和延伸溫度及時(shí)間進(jìn)行了優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。擴(kuò)增時(shí)，采用循環(huán)次數(shù)分別為40、45和50，比較擴(kuò)增結(jié)果的Ct值，進(jìn)而確定擴(kuò)增的循環(huán)次數(shù)為40。最終確定采用擴(kuò)增效果較好的方案為RT-PCR反應(yīng)參數(shù)反應(yīng)條件為 42°C /30min,94°C /3min ；94°C /15s，58°C /5s, 65°C /30s, 40 個(gè)循環(huán)；每次循環(huán)的退火延伸時(shí)收集熒光。研究表明，Mg2+濃度對(duì)熒光PCR擴(kuò)增結(jié)果有一定，故應(yīng)用篩選好的弓丨物探針，將Mg2+的濃度從0. 5mmol/L至5. 0mmol/L以0. 5mmol/L為間距遞增,對(duì)不同Mg2+濃度條件下的擴(kuò)增進(jìn)行了比較。優(yōu)化后的Mg2+為見(jiàn)表I。我們選擇Promega公司生產(chǎn)的Taq酶，一單位的定義74°C作用30分鐘，能將IOnM的dNTPs摻入酸溶性物質(zhì)中所需要的酶量?；钚砸缶逥NA聚合酶活性及5’ 一 3’核酸外切酶活性，無(wú)3’ 一 5’核酸外切酶活性及核酸內(nèi)切酶活性；具熱穩(wěn)定性，94°C I小時(shí)后仍保持50%活性。從多次重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果中選定I. 25U Taq酶作為使用的Taq酶量。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是本發(fā)明選擇東部馬腦脊髓炎病毒核酸6K和El區(qū)作為靶區(qū)域，設(shè)計(jì)引物和探針建立并優(yōu)化了東部馬腦脊髓炎病毒熒光RT-PCR檢測(cè)方法，取得了優(yōu)異的技術(shù)效果I)快速該方法對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控，RT-PCR結(jié)束即可獲得結(jié)果。2)更為靈敏比常規(guī)的PCR方法靈敏度高100倍；對(duì)已知拷貝數(shù)的體外轉(zhuǎn)錄RNA進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，靈敏度均可達(dá)10拷貝/反應(yīng)，重復(fù)性好。3)特異由于不僅采用了特異性的引物，而且采用了特異性的探針，使該方法的特異性高于傳統(tǒng)RT-PCR方法；建立的熒光RT-PCR檢測(cè)方法在檢測(cè)所收集的其他病毒以及相關(guān)彈狀病毒時(shí)，結(jié)果為陰性，未發(fā)現(xiàn)交叉反應(yīng)。方法研究過(guò)程中涉及的病毒核酸見(jiàn)表2。表2方法研究中用到的病毒核酸
權(quán)利要求
1.一組檢測(cè)東部馬腦脊髓炎病毒的核苷酸序列，其特征在于所述核苷酸序列如序列表SEQ ID NO 1至SEQ ID NO 3所示，其中序列SEQ ID NO 1和SEQ IDNO 2分別為檢測(cè)東部馬腦脊髓炎病毒的正義引物和反義引物，序列SEQ ID NO :3為檢測(cè)東部馬腦脊髓炎病毒的熒光探針。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的檢測(cè)東部馬腦脊髓炎病毒的核苷酸序列，其特征在于所述熒光探針序列SEQ ID NO 3的5’端標(biāo)記報(bào)告熒光基團(tuán)FAM，3’端標(biāo)記淬滅熒光基團(tuán)MGB。
3.—種檢測(cè)東部馬腦脊髓炎病毒的試劑盒，其特征在于，由以下組分組成 1)裂解液； 2)熒光RT-PCR反應(yīng)液，其中包括RT緩沖液、MgCL2、dNTP、正義引物、反義引物和熒光探針； 3)反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV； 4)RNA酶抑制劑； 5)Taq DNA聚合酶； 6)DEPC 7jC ； 7)陰性對(duì)照東部馬腦脊髓炎病毒陰性組織樣品； 8)陽(yáng)性對(duì)照為體外轉(zhuǎn)錄的非感染性RNA片段，其對(duì)應(yīng)的DNA序列為序列表SEQIDNo. 4所示的核苷酸序列； 其中，正義引物為序列表SEQ ID No. I所示的核苷酸序列，反義引物為序列表SEQIDNo. 2所示的核苷酸序列，熒光探針為序列表SEQ ID No. 3所示的核苷酸序列，其5’端標(biāo)記報(bào)告熒光基團(tuán)FAM，3’端標(biāo)記淬滅熒光基團(tuán)MGB。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于所述熒光RT-PCR反應(yīng)液包括1XRT緩沖液、I. 5mM MgCL2、0. 05mM dNTP、0. 3 μ M正義引物、O. 3 μ M反義引物和O. 3μ M熒光探針。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了檢測(cè)東部馬腦脊髓炎病毒的核苷酸序列和試劑盒。該檢測(cè)東部馬腦脊髓炎病毒的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO1至SEQ ID NO3所示，其中序列SEQ ID NO1和SEQ ID NO2分別為檢測(cè)東部馬腦脊髓炎病毒的正義引物和反義引物，序列SEQ ID NO3為檢測(cè)東部馬腦脊髓炎病毒的熒光探針。本發(fā)明進(jìn)一步公開(kāi)了含有上述引物的檢測(cè)東部馬腦脊髓炎病毒的試劑盒。本發(fā)明所述的試劑盒具有快速、靈敏、特異、穩(wěn)定、重復(fù)性好、不易污染及操作安全的特點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12Q1/70GK102808043SQ20121033675
公開(kāi)日2012年12月5日 申請(qǐng)日期2012年9月12日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月12日
發(fā)明者高志強(qiáng), 谷強(qiáng), 李海花, 張偉, 張鶴曉, 劉環(huán), 蒲靜, 喬彩霞, 張利峰, 吳亞瓊, 于軍超, 王慧珊 申請(qǐng)人:北京出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心