高產(chǎn)l-賴氨酸的生產(chǎn)菌株及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種天冬氨酸激酶：(a)其氨基酸序列如SEQ?ID?NO:2所示；或(b)包含(a)所限定的序列經(jīng)過一個或多個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的序列，且基本具有(a)所限定多肽功能的由(a)衍生的多肽。本發(fā)明的天冬氨酸激酶能有效生產(chǎn)L-賴氨酸，并且抗L-賴氨酸負反饋抑制的能力高。本發(fā)明還提供包含編碼所述天冬氨酸激酶的基因的重組宿主以及利用所述宿主或天冬氨酸激酶產(chǎn)生L-賴氨酸的方法。本發(fā)明的天冬氨酸激酶或包含本發(fā)明天冬氨酸激酶的宿主細胞還用于產(chǎn)生蘇氨酸、甲硫氨酸、異亮氨酸或纈氨酸。本發(fā)明還提供利用所述天冬氨酸激酶或宿主細胞產(chǎn)生L-天冬氨酰-4-基磷酸的方法。
【專利說明】高產(chǎn)L-賴氨酸的生產(chǎn)菌株及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】[0001]本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】。具體地說，本發(fā)明涉及肺炎鏈球菌(Streptococcuspneumoniae)來源的天冬氨酸激酶(ASK)。
【背景技術(shù)】
[0002]L-賴氨酸是人體必需氨基酸之一，能促進人體發(fā)育、增強免疫功能。由于谷物食品中的L-賴氨酸含量甚低，在加工過程中易被破壞，而人體及動物不能自己合成L-賴氨酸，只能從食物中獲取，故稱為限制性氨基酸。L-賴氨酸主要用于飼料添加劑以補充限制性氨基酸提高飼料的吸收利用率，食品添加劑，醫(yī)藥，化學制劑等。以年產(chǎn)量比較，L-賴氨酸目前是僅次于谷氨酸的世界第二大氨基酸品種，并且以5%-10%的年增長率增加。
[0003]國際上生產(chǎn)L-賴氨酸主要通過微生物發(fā)酵法。許多種類野生型或者誘變微生物都能夠生產(chǎn)L-賴氨酸?；蚬こ檀竽c桿菌和谷氨酸棒桿菌是主要的生產(chǎn)L-賴氨酸的微生物。
[0004]L-賴氨酸的合成途徑在許多微生物中都是從天冬氨酸起始的，包括兩步和甲硫氨酸和蘇氨酸共用的步驟，經(jīng)過九步的酶催化過程，最終產(chǎn)生L-賴氨酸(生物合成途徑如下所示)。其中，天冬氨酸激酶(Aspartate Kinase, ASK)是L_賴氨酸合成途徑中天冬氨酸起始的第一個酶，它的活力決定著代謝流流向L-賴氨酸合成途徑的比例。天冬氨酸激酶的活力在微生物體內(nèi)受復(fù)雜的調(diào)控。在許多L-賴氨酸的生產(chǎn)菌中，天冬氨酸激酶的活力受到終產(chǎn)物L-賴氨酸的負反饋抑制。
[0005]
【權(quán)利要求】
1.一種重組的宿主細胞，其特征在于，所述重組的宿主細胞含有編碼選自下組的天冬氨酸激酶的外源性基因: (a)氨基酸序列如SEQID NO:2所示的天冬氨酸激酶；或 (b)包含(a)所限定的序列經(jīng)過一個或多個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的序列，且基本具有(a)所限定的天冬氨酸激酶功能的由(a)衍生的天冬氨酸激酶。
2.如權(quán)利要求1所述的重組的宿主細胞，其特征在于，所述重組的宿主細胞含有的外源性基因如SEQ ID NO:1所示；或者 所述天冬氨酸激酶的氨基酸序列如SEQ ID NO: 2所示，但其中305位的A取代為N、V或I，或343位的H取代為I或F。
3.如權(quán)利要求1或2所述的重組的宿主細胞，其特征在于，所述宿主細胞來自埃希氏菌屬(Escherichia)、棒狀桿菌屬(Corynebacterium)、短桿菌屬(Brevibacterium sp.)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、沙雷氏菌屬(Serratia)或弧菌屬(Vibrio)。
4.如權(quán)利要求3所述的重組的宿主細胞，其特征在于，所述宿主細胞是大腸桿菌(E.Coli)或谷氨酸棒狀桿菌(Corynebacterium glutamicum)。
5.一種重組的宿主細胞， 其特征在于，所述重組的宿主細胞含有編碼抗賴氨酸負反饋抑制的天冬氨酸激酶的外源性基因，其中所述的天冬氨酸激酶來源于鏈球菌，優(yōu)選地，所述鏈球菌是肺炎鏈球菌。
6.以上權(quán)利要求中任一項所述的重組的宿主細胞在生產(chǎn)L-賴氨酸中的應(yīng)用。
7.—種生產(chǎn)L-賴氨酸的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟: (a)培養(yǎng)權(quán)利要求1-5中任一項所述的宿主細胞,使之產(chǎn)生L-賴氨酸；和 (b)從培養(yǎng)體系中分離L-賴氨酸。
8.一種多肽，其特征在于，所述多肽: (a)包含SEQID N0:2所示序列經(jīng)過一個或多個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的序列，且 (b)基本具有包含SEQID N0:2所示序列的多肽的功能。
9.如權(quán)利要求8所述的多肽，其特征在于，所述多肽包含SEQID N0:2所示序列，但其中305位的A取代為N、V或I，或343位的H取代為I或F。
10.權(quán)利要求8或9所述的多肽或氨基酸序列如SEQID NO: 2所示的多肽在生產(chǎn)L-賴氨酸中的應(yīng)用。
11.如權(quán)利要求6或10所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的重組的宿主細胞或所述的多肽還用于產(chǎn)生蘇氨酸、甲硫氨酸、異亮氨酸或纈氨酸。
12.—種生產(chǎn)L-賴氨酸的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟: (a)利用權(quán)利要求8或9所述的多肽或氨基酸序列如SEQID N0:2所示的多肽作為天冬氨酸激酶(EC 2.7.2.4)，催化從L-天冬氨酸生成L-賴氨酸過程中以下反應(yīng)，進而獲得L-賴氨酸:
13.—種產(chǎn)生L-天冬氨酰-4-基磷酸的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟:(a)培養(yǎng)權(quán)利要求1-5中任一項所述的宿主細胞，從而產(chǎn)生L-天冬氨酰-4-基磷酸；和 (b)從培養(yǎng)體系中分離L-天冬氨酰-4-基磷酸。 或者所述方法包括以下步驟: (al)利用權(quán)利要求8或9所述的多肽或氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示的多肽作為天冬氨酸激酶(EC 2.7.2.4)，催化從L-天冬氨酸生成L-天冬氨酰_4_基磷酸；和(b I)從反應(yīng)體系中分離L-天冬氨酰-4-基磷酸。
14.編碼權(quán)利要求8或9所述多肽的基因。
15.包含權(quán)利要 求14所述基因的載體。
【文檔編號】C12N15/54GK103667165SQ201210337506
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2012年9月12日 優(yōu)先權(quán)日:2012年9月12日
【發(fā)明者】黃鶴, 楊晟 申請人:中國科學院上海生命科學研究院, 上海工業(yè)生物技術(shù)研發(fā)中心