專利名稱：焦磷酸測序法檢測oct2基因多態(tài)性的試劑盒及方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學領(lǐng)域，具體的是涉及焦磷酸測序法檢測0CT2基因多態(tài)性的試劑盒及方法。
背景技術(shù)：
雙胍類藥物常用的有苯乙雙胍(降糖靈)、二甲雙胍(降糖片，美迪康，迪化糖錠，格化止等)、丁二胍，是糖尿病病人有效的一線用藥。其降糖機制是減少肝臟產(chǎn)生葡萄糖，促進肌肉攝取葡萄糖，增加胰島素敏感性。有機陽離子轉(zhuǎn)運蛋白(OCT)屬于溶質(zhì)轉(zhuǎn)運家族，主要包括OCTI、0CT2和0CT33個異構(gòu)體。0CT2多數(shù)分布于腎近端小管基底外側(cè)膜，主要負責臨床常用藥物(如二甲雙胍、順 鉬、西咪替丁等)，常見內(nèi)源性物質(zhì)(如多巴胺、去甲腎上腺素等)以及一些毒物的轉(zhuǎn)運。0CT2對不同種族人群而言，多態(tài)性位點各不相同而且在等位基因頻率上也有很大的種族差異，基因多態(tài)性導致轉(zhuǎn)運功能升高或降低，進而影響雙胍類藥物清除速率，從而影響降糖效應。研究顯示，0CT2變異降低了腎臟對二甲雙胍的清除，使之體內(nèi)藥物濃度升高，從而增強機體對某些藥物或毒物的敏感性。0CT2的轉(zhuǎn)運功能是影響雙胍類藥物代謝動力學特征和毒副反應的關(guān)鍵因素之一，開發(fā)快速、高效、準確、便捷、經(jīng)濟的檢測0CT2基因多態(tài)性的試劑盒將為雙胍類等藥物的臨床個體化治療起到積極的推動作用。焦磷酸測序(Pyro sequencing)技術(shù)是新一代DNA序列分析技術(shù),該技術(shù)無須進行電泳，DNA片段也無須熒光標記，是一種通用型技術(shù)平臺。該技術(shù)具有操作簡便、檢測成本低、所需樣品量小、快捷、準確、高通量等特點，符合臨床大樣本檢測要求。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在提供一種焦磷酸測序法檢測0CT2基因(SEQ ID NO. I)多態(tài)性的試劑盒及方法，以實現(xiàn)快速、簡便、準確、高效、實用、經(jīng)濟的檢測其底物(如雙胍類降糖藥物等)個體化用藥相關(guān)基因SNP。為了達到上述目的，本發(fā)明提供的技術(shù)方案為一種焦磷酸測序法檢測0CT2基因多態(tài)性的試劑盒，包括如下引物(I)擴增引物上游引物5'-TCG GAG AAC AGT GGG GAT TTT T-3' (SEQ ID NO. 2)；下游引物5'-AAT TGG GCT CTT TGT GAA ATG-3' (SEQ ID NO. 3)；其中，下游引物的5'進行生物素標記；(2)測序引物5' -TGG TTG CAG TTC ACA G-3/ (SEQ ID NO. 4)；試劑盒中其他試劑及溶液為PCR和DNA焦磷酸測序的常規(guī)試劑。一種應用上述試劑盒檢測0CT2基因多態(tài)性的方法，包括如下步驟(I) DNA 提?。?br> (2)聚合酶鏈反應配制50μ I PCR擴增體系，包含10XPCR buffer 5. O μ I, dNTP I. 5 μ 1，上游引物0·5μ 1，下游引物 0·5μ l，rTaq0.5y 1，水 41μ 1，模板 1·0μ I ;循環(huán)程序為95° C 5min 預變性；依次在95° C 30S，50° C 30S，72° C 30S，進行40個循環(huán)；72° C保持5min，最終保持在4° C，得擴增產(chǎn)物；(3)焦磷酸測序單鏈樣本純化；(4)焦磷酸測序及結(jié)果分析。本發(fā)明的試劑盒對0CT2RS316019 (G>T)目標序列進行分析和檢測，該目標序列包括野生型 GGTGGTTGCAGTTCACAGTTGCTCTGCCCAACTTCTTCTTCT (SEQ ID NO. 5)和突變型 GGTGGTTGCAGTTCACAGTTTCTCTGCCCAACTTCTTCTTCT (SEQID NO. 6)。由于設計了特異性高的引物，并且選擇了合適的方法，本發(fā)明的試劑盒適用于對0CT2基因多態(tài)性進行快速檢測，可廣泛應用于臨床上芳香化酶抑制劑個體化用藥方案制定的基因檢測。與現(xiàn)有技術(shù)相比，其應用焦磷酸測序技術(shù)可以快速、準確地進行短DNA序列分析，便于構(gòu)建標準化操作流程；具有高通量、低成本等特點；PCR產(chǎn)物即可直接用于測序，不需進行產(chǎn)物純化等二次處理，操作極為簡便，所需樣品量小。



圖I為本發(fā)明0CT2(rs316019)野生型純合子(GG)焦磷酸測序結(jié)果；圖2為本發(fā)明0CT2(rs316019)突變型雜合子(GT)焦磷酸測序結(jié)果；圖3為本發(fā)明0CT2(rs316019)突變型純合子(TT)焦磷酸測序結(jié)果。
具體實施例方式下面結(jié)合實施例對上述試劑盒及檢測方法進行詳細描述。實施例I :0CT2-pyroF (上游引物)5' -TCG GAGAAC AGT GGG GAT TTT T-3' (SEQ IDNO. 2)；0CT2-pyroR (下游引物):5' -AAT TGG GCT CTT TGT GAA ATG-3' (SEQID NO. 3)；測序引物5'-TGG TTG CAG TTC ACA G_3' (SEQ ID NO. 4)；I. DNA 提取I. I實驗前試劑材料準備與檢查工作如下(I)檢查試劑盒保質(zhì)期以及確保Wash Buffer I和2中已添加乙醇，并在瓶上相應標識處打勾V ； (2)異丙醇(如無，可用無水乙醇替代)和75%乙醇；(3)高壓滅菌有效期內(nèi)的I. 5mL Eppendorf管和各類移液槍頭。I. 2從4°C冰箱中取出裝有全血的EDTA抗凝管，上下顛倒數(shù)次混勻；I. 3在I. 5mL Eppendorf管對應標本唯一性標識做好標記；I. 4 分別移取 900uL Cell Lysis Solution 加至滅菌的 I. 5mL Eppendorf 管；I. 5小心移取300uL全血轉(zhuǎn)移至上述加有Cell Lysis Solution的I. 5mL EP管；I. 6 蓋上 Eppendorf 管蓋，室溫孵育 IOmin ；1.713，OOOrpm 室溫離心 20 秒；
I. 8取出Eppendorf管,觀察白色沉淀；I. 9開Eppendorf管蓋，手持管底部，傾斜EP管口棄去部分紅色上清，盡量將紅色上清吸盡；I. 10蓋上Eppendorf管,用手指彈擊EP管底部,使白色沉淀重懸；1.11移取300111^ Nuclei Lysis Solution 入上述Eppendorf 管中，蓋上管，上下顛倒數(shù)次混勻；I. 12 打開 Eppendorf 管，移取 IOOuL Protein Precipitation Solution 入上述Eppendorf管中，蓋上管管，振蕩器上劇烈振蕩20秒；13，OOOrpm室溫離心3min ；I. 13移取上清轉(zhuǎn)移到新的已滅菌I. 5mL Eppendorf管；
I. 14移取300uL異丙醇入EP管，蓋上管蓋，上下顛倒數(shù)次混勻，可見白色絮狀gDNA析出；I. 1513, OOOrpm 室溫離心 Imin ；I. 16打開Eppendorf管，手捏管底部，傾斜管口棄去上清；I. 17移取300uL 75%乙醇加入Eppendorf管，蓋上管蓋，輕柔上下顛倒洗滌沉淀；I. 1813, OOOrpm 室溫離心 Imin ；I. 19打開Eppendorf管，手持管底部，傾斜管口棄去上清；I. 20在實驗臺上放置新濾紙,倒扣Eppendorf管，吸干液體,將Eppendorf管開蓋側(cè)放風干；I. 21 目測沉淀大小，加入 50 IOOul DNA Rehydration Solution 至沉淀；I. 22過夜溶解后用Nano-Space紫外分光光度計進行核酸濃度測定，核酸濃度大于50ng/ul視為合格，如濃度不夠，加入乙醇再次沉淀DNA，然后重新加適量的DNARehydration Solution 溶解 DNA。I. 23在管壁和管蓋上再次標清樣本唯一性編號，并用透明膠帶纏繞保護；I. 24保存核酸標本至4°C冰箱；2.聚合酶鏈反應2. I在試劑準備區(qū)配制50 μ I PCR擴增體系(模板添加除外)，各組分及添加量如下表
IOXPCRbuffer5. Ομ I
dNTPI. 5μ I
0CT2-pyroFO. 5 μ I
0CT2-pyroR (5，-Bio 標記)O. 5μ I
rTaq0. 5 μ I
41. Ομ I
2. 2在標本制備區(qū)對盛有g(shù)DNA模板短暫離心后添加I. Ομ I至擴增體系中，在PCR管壁上標記標本唯一'丨生標識，管蓋上標記檢測項目代號。PCR管震蕩混勻,桌面離心機上短暫離心；2. 3在擴增區(qū)進行PCR擴增反應，按照下面的循環(huán)參數(shù)設置擴增儀
權(quán)利要求
1.一種焦磷酸測序法檢測0CT2基因多態(tài)性的試劑盒，其特征在于，包括如下引物 (1)擴增引物 上游引物5/ -TCG GAG AAC AGT GGG GAT TTT T-3'； 下游引物5' -AAT TGG GCT CTT TGT GAA ATG-3'； 其中，下游引物的5'進行生物素標記； (2)測序引物5/-TGG TTG CAG TTC ACA G-3'。
2.一種應用權(quán)利要求I所述的試劑盒檢測0CT2基因多態(tài)性的方法，包括如下步驟 (1)DNA 提??； (2)聚合酶鏈反應 配制 50 μ I PCR 擴增體系，包含10XPCR buffer 5. O μ I, dNTP I. 5 μ 1，上游引物0·5μ 1，下游引物 0·5μ l，rTaq0.5y 1，水 41μ 1，模板 1·0μ I ;循環(huán)程序為95° C 5min 預變性；依次在95° C 30S，50° C 30S，72° C 30S，進行40個循環(huán)；72° C保持5min，最終保持在4° C，得擴增產(chǎn)物； (3)焦磷酸測序單鏈樣本純化； (4)焦磷酸測序及結(jié)果分析。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種焦磷酸測序法檢測OCT2基因多態(tài)性的試劑盒及方法。所述試劑盒OCT2基因多態(tài)性進行檢查，具體是指rs316019(G>T)單核苷酸多態(tài)性。試劑盒包含如SEQ ID NO.2—4所示的引物。本發(fā)明的試劑盒，可以實現(xiàn)準確、快捷、高通量OCT2基因多態(tài)性的檢測，從而達到對其底物實現(xiàn)安全合理有效的個體化給藥。
文檔編號C12Q1/68GK102876783SQ201210338529
公開日2013年1月16日 申請日期2012年9月13日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月13日
發(fā)明者周宏灝 申請人:周宏灝