與北京油雞五趾性狀相關(guān)的hb9基因及應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及與北京油雞五趾性狀相關(guān)的HB9基因，公開了HB9基因與五趾性狀具有極其顯著的相關(guān)性，表明HB9基因?yàn)楸本┯碗u五趾性狀主效基因，并且公開了用于擴(kuò)增HB9基因的引物，本發(fā)明提供的HB9基因可用于北京五趾油雞的育種，為北京油雞五趾性狀的深入研究和開發(fā)應(yīng)用開辟了新的途徑。
【專利說明】與北京油雞五趾性狀相關(guān)的HB9基因及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，特別是涉及與北京油雞五趾性狀相關(guān)的HB9基因及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]北京油雞是我國一個(gè)珍貴的地方雞種，原產(chǎn)地在北京城北側(cè)安定門和德勝門外的近郊一帶，形成于清朝中期。北京油雞體軀中等，公雞羽毛呈赤褐色，鮮艷光亮，頭部高昂，尾羽多呈黑色。母雞羽毛呈黃色，頭尾微翹，脛部略短，體態(tài)墩實(shí)。鳳頭、毛腿、胡須，少量個(gè)體分生五趾是北京油雞的主要外貌特征。它以肉味鮮美、蛋質(zhì)佳良而著稱。66周產(chǎn)蛋量125枚，90日齡體重1100克，飼料報(bào)酬3.4:1，成活率95%以上。
[0003]雞多趾性狀定位和比較基因組分析都表明雞2號(hào)染色體短臂端與人類7q36同源區(qū)應(yīng)是雞多趾候選基因的關(guān)鍵區(qū)域，人和鼠PPD的候選基因也可作為雞多趾突變的候選基因。人7q36和鼠5號(hào)染色體上，EN2、SHH、Lmbrl、C7orf3、Hlxb9等同源基因以相似的順序排列。目前已知雞肢體發(fā)育重要相關(guān)基因，如EN2、SHH、Lmbrl、Hlxb9、GLI3、Twistl等均落位在這個(gè)區(qū)域。因此參照人類和鼠等物種相似性狀的研究進(jìn)展對(duì)于進(jìn)一步縮小雞多趾性狀候選區(qū)間、確定關(guān)鍵候選基因和進(jìn)行未知基因的克隆就顯得特別重要。
[0004]基因Hlxb9最初被定位到人染色體lq41,后被重新定位到7q36的微衛(wèi)星標(biāo)記D7S559-D7S2423之間。雞的HB9基因位于2號(hào)染色體，mRNA全長1481bp (NCBI序列號(hào)為AF066861)，0FR為1050bp，共有三個(gè)外顯子(538bp，161bp，764bp)，編碼一個(gè)349氨基酸的蛋白。在人、鼠、雞等不同物種間同源性比較結(jié)果顯示，同源一致性達(dá)到80.56%。
[0005]Najfeld V在19 92年利用熒光原位雜交技術(shù)對(duì)于Hlxb9基因進(jìn)行檢測和定位，發(fā)現(xiàn)該基因在淋巴和胰腺組織中表達(dá)，并將其定位在Iq41_q42.1內(nèi)。后來Ross AJ在1998年在有爪蟾蜍的尾芽和胚胎期的薦骨(主要是脊索區(qū))也檢測到Hlxb9的表達(dá)，并發(fā)現(xiàn)Hlxb9的突變與薦骨發(fā)育不全有關(guān)。2000年Belloni E和Hagan DM在Currarino綜合癥中也都發(fā)現(xiàn)了 HB9的特異性突變并導(dǎo)致了部分骶骨發(fā)育不全、便秘或肛門直腸畸形和骶前腫塊的表型。此外，Harrison KA在1999年對(duì)HB9在胰腺的發(fā)育和功能上做了研究，發(fā)現(xiàn)該基因在胰腺的發(fā)育和功能上起著重要作用。但是沒有任何研究表明HB9基因與PPD (preaxialpolydactyly軸前多趾)有關(guān)。
[0006]五趾作為北京油雞的一個(gè)顯著、獨(dú)特、標(biāo)志性的特征，是屠宰后典型包裝性狀之一，因此對(duì)北京油雞五趾性狀的遺傳規(guī)律和基因定位的研究結(jié)果，會(huì)為人類肢體發(fā)育異常遺傳分子機(jī)理的研究提供重要的參考，并且研究五趾性狀的遺傳規(guī)律，選育高純度北京油雞五趾品系，對(duì)優(yōu)質(zhì)雞產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)和產(chǎn)業(yè)品牌具有重要意義。
[0007]目前候選基因分析法是進(jìn)行動(dòng)物性狀基因定位的一個(gè)常用方法。該方法主要是選定一些候選基因，利用分子生物學(xué)技術(shù)研究這些基因和相關(guān)的DNA標(biāo)記對(duì)某種性狀的遺傳效應(yīng)，從而篩選出對(duì)該性狀有影響的主基因和DNA標(biāo)記，估計(jì)出它們對(duì)性狀的效應(yīng)值。
[0008]實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)為在候選基因分析法中進(jìn)行基因定量表達(dá)研究提供了有力的解決辦法，熒光定量PCR技術(shù)是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。其常用機(jī)制包括熒光染料檢測和水解探針檢測。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]本發(fā)明的目的是提供與北京油雞五趾性狀相關(guān)的HB9基因及應(yīng)用。
[0010]為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明通過以五趾油雞和石岐雜雞趾為材料，采用熒光定量PCR方法，檢測了 HB9基因在胚胎發(fā)育第6~10天的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)了 HB9基因與五趾性狀具有極其顯著的相關(guān)性，由此表明HB9基因?yàn)楸本┯碗u五趾性狀主效基因。
[0011]本發(fā)明提供了一種HB9基因，所述的HB9基因與北京油雞五趾性狀相關(guān)，且具有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。 [0012]優(yōu)選地，所述的HB9基因?yàn)楸本┯碗u五趾性狀主效基因。
[0013]本發(fā)明還提供了如前所述的HB9基因在選育具有五趾性狀的北京油雞中的應(yīng)用。
[0014]本發(fā)明還提供了用于擴(kuò)增與北京油雞五趾性狀相關(guān)的HB9基因的引物，所述引物包括:
[0015]上游引物F:5’-CCTTTCAGCTGGACCAGTGG-3’ ；和
[0016]下游引物R:5’ -GCACTTCCCCAGCAGGTTG-3’。
[0017]本發(fā)明還提供了含有上述上游引物和下游引物的檢測試劑盒。
[0018]本發(fā)明進(jìn)一步提供了所述的試劑盒在檢測北京油雞五趾性狀中的應(yīng)用。
[0019]具體方法包括:以北京油雞cDNA為模板，采用含有上述上游引物和下游引物的檢測試劑盒，進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，檢測擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0020]優(yōu)選地，所述的PCR反應(yīng)的退火溫度為61 °C。
[0021]優(yōu)選地，所述PCR反應(yīng)為熒光定量PCR反應(yīng)，其條件包括:95°C預(yù)變性30s，95°C變性3s，61°C退火30s，72°C延伸20s，擴(kuò)增35個(gè)循環(huán)，72°C后延伸IOmin ;4°C終止反應(yīng)。
[0022]本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn):
[0023]1.本發(fā)明首次選用多趾性狀突出并且遺傳表現(xiàn)穩(wěn)定的經(jīng)5個(gè)世代雜交測驗(yàn)和純繁選育的五趾北京油雞和石岐雜雞的胚蛋胚胎作為材料，通過熒光定量PCR方法，發(fā)現(xiàn)了HB9基因與五趾性狀具有極其顯著的相關(guān)性，表明HB9基因?yàn)楸本┯碗u五趾性狀主效基因。
[0024]2.本發(fā)明提供的與北京油雞五趾性狀相關(guān)的HB9基因?yàn)楸本┯碗u五趾性狀的深入研究和開發(fā)應(yīng)用開辟了新的途徑。
【具體實(shí)施方式】
[0025]以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。
[0026]以下實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法:所用的實(shí)驗(yàn)材料，如無特殊說明，均為市售商品；下述實(shí)施例中的％，如無特殊說明，均為質(zhì)量百分含量。
[0027]實(shí)施例1HB9基因在北京油雞和石岐雜雞的趾部組織中的表達(dá)差異
[0028]1、實(shí)驗(yàn)材料
[0029]選用的五趾純系北京油雞和石岐雜雞受精蛋由上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所莊行試驗(yàn)站提供。本方法所用的五趾純系北京油雞，是經(jīng)過5個(gè)世代雜交測驗(yàn)和純繁選育，后代100%表現(xiàn)多趾性狀并表現(xiàn)穩(wěn)定遺傳。選取五趾純系北京油雞和石岐雜雞受精蛋各40枚。
[0030]2、實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備
[0031]小型孵化器ELYE-3型，無錫市萬利畜牧機(jī)械有限公司。
[0032]電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，YLD-2000型，黃礦恒豐醫(yī)療器械有限公司。
[0033]MLS-3750型高壓滅菌鍋，日本三洋。
[0034]-70°C超低溫冰箱，美國熱電集團(tuán)。
[0035]電冰箱，B⑶-196F型，青島海爾股份有限公司。
[0036]T-18型勻漿器，廣州IKA公司。
[0037]電熱恒溫水浴鍋，DK-S24型，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。
[0038]電子天平(BL_220H),日本Shimadzu 公司。
[0039]離心機(jī)5417C,德國 Eppendorf 公司。
[0040]5417R冷凍離心機(jī),德國Eppendorf公司。
[0041]生物分光光度計(jì)，德國Eppendorf公司。
[0042]定量PCR儀,德國Eppendorf公司。
[0043]PTC-200 梯度 PCR 儀`，美國 MJ RESEARCH 公司。
[0044]凈化工作臺(tái)YJ-875S，蘇州凈化設(shè)備公司。
[0045]DYY-6C電泳儀,北京六一儀器廠。
[0046]DYCP-33A型水平電泳槽，北京六一儀器廠。
[0047]凝膠成像系統(tǒng)，GIS-2008型，天能科技(上海)有限公司。
[0048]紫外分析儀，JY03型，北京君意東方電泳設(shè)備有限公司。
[0049]XHF-1高速分散器，上海金達(dá)生化儀器廠。
[0050]電泳儀，JY600C型，北京君意東方電泳設(shè)備有限公司。
[0051]3、實(shí)驗(yàn)試劑及試劑盒
[0052](I) TRIzol 總 RNA 提取試劑盒，Invitroge 公司。
[0053](2) mRNA 純化試劑盒 01igotex?mRNA Kit,荷蘭 Qiagen 公司；
[0054](3) PCR-SeIect?cDNA Subtraction Kit,美國 Clontech 公司；
[0055](4) Advantage?cDNA Polymerase Mix,美國 Clontech 公司；
[0056](5) DEPC (焦碳酸二乙酯)、丙烯酰胺、N，N'-亞甲雙丙烯酰胺，上海博彩生物公司；
[0057](6) rTaq DNA聚合酶；dNTP Mixture (2.5mM) ;AMV反轉(zhuǎn)錄試劑盒,包括反轉(zhuǎn)錄酶(5U/ul)、Rnase Inhibitor(40U/ul)>dNTP Mixture (10mM)、10XRT Buffer>Mgcl2(25mM)>Rnasefree H20、熒光定量試劑盒SYBR1<: Premix Ex Taq?等，TaKaRa公司(大連寶生物工程公司)；
[0058](7)氯仿、異丙醇等其它試劑均為國產(chǎn)分析純；0.1MNaOH ；0.5MEDTA(PH8.0) ；10%SDS ;滅菌雙蒸水；3%H202 ；0.5%SDS ；0.1%的DEPC處理水；75%乙醇；50 X TAE ；1%的瓊脂糖凝膠，按實(shí)驗(yàn)室常規(guī)標(biāo)準(zhǔn)方法配制。
[0059]4、實(shí)驗(yàn)步驟
[0060]( I)雞胚孵化和樣品采集[0061]保證兩種胚胎能正常孵化并同期發(fā)育，使實(shí)驗(yàn)結(jié)果具有可比性。將五趾純系北京油雞和石岐雜雞受精蛋各40枚放入孵化箱中，設(shè)定溫度37.80C，濕度66%，每2小時(shí)翻蛋一次。
[0062]選取同期發(fā)育的兩種胚胎，盡快分割。從孵化后第6天開始至第10天，每隔24h取出胚蛋，將胚蛋內(nèi)容物倒在鋪有一次性塑料手套的表面皿中，用處理好的小鑷子和剪刀小心取出胚胎，在DEPC水中洗去蛋黃，10分鐘之內(nèi)切下趾部組織(骨骼肌肉)放入離心管中，液氮速凍后置于_70°C冰箱保存。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)采集五趾北京油雞和石岐雜樣品各5個(gè)。
[0063](2)總RNA提取和保存
[0064]采用TRIzoI法提取趾部組織總RNA，步驟如下:
[0065]I)用已處理的鑷子取IOOmg液氮凍存趾部組織樣，加入倒有Iml TRIzol的勻漿管中高速勻漿30s左右，樣品量不能超過TRIzoI的10% ；
[0066]2) 4°C 12000 Xg 離心 IOmin ；
[0067]3)吸取上清液，15~30°C溫育5min。加0.2ml氯仿，蓋緊蓋子，用手劇烈震蕩15s，15~3(TC溫育2~3min ；
[0068]4)4。。12000 轉(zhuǎn)離心 15min ；
[0069]5)吸取上清液，加0.5ml異丙醇，混合均勻，15~30°C溫育IOmin ；
[0070]6) 40C 12000轉(zhuǎn)離心lOmin，離心管底部白色沉淀即為RNA ；
[0071]7)倒掉上清，加`Iml 75%乙醇(DEPC處理水配制)洗滌RNA ；
[0072]8) 4°C 7500 X g 離心 5min ;
[0073]9)自然干燥或真空干燥RNA，溶于0.1%DEPC處理水，取I 總RNA在1%瓊脂糖凝膠上電泳，檢測所提總RNA的完整性；
[0074]10)取I ill總RNA溶于79 U 10.1%DEPC處理水中，用生物分光光度計(jì)測定總RNA濃度和OD值，以O(shè)D值處于1.85~2.0之間為高純度總RNA。將部分總RNA稀釋成I y g/U I工作液，于_20°C保存，剩余總RNA原液保存于-70°C冰箱。
[0075](3)熒光定量PCR
[0076]在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行檢索，得出五趾性狀HB9基因cds序列，并保存為序列文件(*.seq)。引物設(shè)計(jì)采用Primer 5.0從cds序列跨外顯子設(shè)計(jì)上游引物(5’ 一 3’)和下游引物(5’ 一 3’)，長度20bp左右，盡量避免錯(cuò)配及引物二聚體，退火溫度50°C~65°C之間，并盡量在60°C以下，引物見表1。
[0077]表1熒光定量PCR引物設(shè)計(jì)
【權(quán)利要求】
1.與北京油雞五趾性狀相關(guān)的HB9基因，其特征在于，所述HB9基因具有如SEQID NO:1所示的核苷酸序列。
2.如權(quán)利要求1所述的HB9基因，其特征在于，所述HB9基因?yàn)楸本┯碗u五趾性狀主效基因。
3.用于擴(kuò)增如權(quán)利要求1或2所述的HB9基因的引物，其特征在于，包括:
上游引物 F:5’ -CCTTTCAGCTGGACCAGTGG-3’；和
下游引物 R:5’ -GCACTTCCCCAGCAGGTTG-3’。
4.如權(quán)利要求1所述的HB9基因在選育具有五趾性狀的北京油雞中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103667266SQ201210342985
【公開日】2014年3月26日 申請(qǐng)日期:2012年9月14日 優(yōu)先權(quán)日:2012年9月14日
【發(fā)明者】湯琳琳, 黃啟忠, 孟和 申請(qǐng)人:上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院