一種由微生物（單細(xì)胞真菌高山被孢霉）產(chǎn)生的富含花生四烯酸的油及其制備工藝的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種能夠大量生產(chǎn)花生四烯酸（或ARA）的高山被孢霉菌株，一種使用該菌株的相關(guān)脂類化合物的生產(chǎn)方法，以及使用該菌株制備的產(chǎn)物和化合物。
【專利說明】—種由微生物(單細(xì)胞真菌高山被孢霉)產(chǎn)生的富含花生四烯酸的油及其制備工藝
[0001]本發(fā)明涉及一種富含花生四烯酸油的新化合物，其是由微生物產(chǎn)生，且最好是被孢霉類的單細(xì)胞真菌(絲狀霉)產(chǎn)生，本文指的是高山被孢霉的特殊菌株。
[0002]脂類、蛋白質(zhì)和碳水化合物是三大營養(yǎng)素。
[0003]脂類中又特別包括甘油三酯和磷脂。
[0004]甘油三酯約占口服食用脂類的95%。在人體內(nèi)，它們主要存在于脂肪組織，是貯存能量的主要形式。
[0005]磷脂是結(jié)構(gòu)性脂類，它們是細(xì)胞膜的組成部分，尤其是保證細(xì)胞膜的流動性。
[0006]甘油三酯和磷脂的主要組成部分是脂肪酸，脂肪酸既可獲自食物，也可以通過人體自身合成。
[0007]從生物化學(xué)角度，脂肪酸可分為(根據(jù)脂肪酸分子包含的雙鍵數(shù)量)飽和脂肪酸(AGS)、單不飽和脂肪酸(AGMI)和多不飽和脂肪酸(AGPI )。
[0008]從生理學(xué)角度，我們將它們分成:
[0009]-必需脂肪酸:人體成長和正常運(yùn)行必需，但又不能自身合成的脂肪酸；
[0010]-“條件性”必需脂肪酸，是保證細(xì)胞正常生長和生理功能的主要物質(zhì)，如果是通過食物獲取的，則可以通過它們的前體化合物獲取。如果沒有它們必需的前體，則為嚴(yán)格必
需脂肪酸。
[0011]-非必需脂肪酸。
[0012]所有必需脂肪酸和“條件性”必需脂肪酸組成了必需脂肪酸。
[0013]其它脂肪酸則未非必需脂肪酸。
[0014]我們將必需脂肪酸分成兩大類:0mega 6脂肪酸(或AGPI n_6)，其前體和主要代表是亞油酸(LA)，以及omega 3脂肪酸(或AGPI n_3)，其前體是α-亞麻酸(ALA)。
[0015]在非必需脂肪酸中，尤其包括:
[0016]-omega 3脂肪酸類的二十碳五烯酸(EPA),
[0017]-油酸、食物中大量存在的單飽和脂肪酸以及
[0018]-飽和脂肪酸。
[0019]除了產(chǎn)自花生、紅花、油菜、玉米、亞麻、核桃、芝麻、大豆、向日葵外，多種不飽和脂肪酸還可以由多種單細(xì)胞生物化合物(藻類、真菌等)產(chǎn)生。
[0020]花生四烯酸(“ARA”)是我們在有些植物油中發(fā)現(xiàn)的一種長鏈脂肪酸。
[0021]這是一種C 20:4 (n-6、n-9、n-12、n-15)多不飽和脂肪酸，比如20個(gè)碳原子和碳原子上的四個(gè)乙烯鍵5(11-15)、8(11-12)、11(11-9)和14(n_6)組成的脂肪酸。
[0022]這種脂肪酸也被稱作“四烯酸”，因?yàn)樗哂?個(gè)不飽和有機(jī)物(4個(gè)碳-碳雙鍵)。
[0023]我們還可在專題著作中發(fā)現(xiàn)把它稱作“全順式-5，8，11,14- 二十碳四烯酸”(其中“順式”定義了雙鍵的構(gòu)型，而且“全部”雙鍵均為“順式”構(gòu)型)。
[0024]AM是人體內(nèi)最豐富的一種C20的AGPI，人體可以通過亞油酸合成。
[0025]機(jī)體、肌肉和血液中都存在花生四烯酸。[0026]ARA是多種生物活性化合物的重要前體，這些生物活性化合物被統(tǒng)稱為“類二十烷酸”，該家族包括前列腺素、凝血氧烷和白細(xì)胞三烯。
[0027]這些類二十烷酸對脂蛋白代謝、血液流變、肌肉緊張、白細(xì)胞功能、血小板激活和細(xì)胞生長具有調(diào)節(jié)作用。
[0028]ARA還是人乳乳脂成分之一，并被視為嬰幼兒神經(jīng)最佳生長必不可少的物質(zhì)?？茖W(xué)家和食品監(jiān)管機(jī)構(gòu)努力獲得與人乳中的長鏈脂肪酸性質(zhì)一致的嬰幼兒制品，他們建議在可在嬰幼兒制品中添加花生四烯酸，尤其是用于給早產(chǎn)兒的配方中。
[0029]用于嬰幼兒制品的含有花生四烯酸的油中最好特別含少量或不含其他AGPI (比如，二十碳五烯酸或EPA)。
[0030]實(shí)際上并不推薦其他AGPI，因?yàn)槠渲杏行┲舅峥赡芘c嬰幼兒制品中使用的花生四烯酸互相干擾，并且/或者可能妨礙含有花生四烯酸的油與其他油類混合，從而損害人乳中脂肪酸的恰當(dāng)比例(重組人乳)或其他希望的應(yīng)用。
[0031]此外，ARA還有多種應(yīng)用，比如不僅用于人類食品的制備，還用于動物的食物中。
[0032]實(shí)際上ARA在動物營養(yǎng)學(xué)方面有許多公認(rèn)的性質(zhì):
[0033]-消炎作用，因?yàn)锳RA是系列2前列腺素和大麻素的前體(主要在豬身上得到證明)，
[0034]-在魚類(鯛魚)身上的抗應(yīng)激性，通過與前列腺素不同的途徑，
[0035]-在豬身上的調(diào)節(jié)免疫性。
[0036]此外還進(jìn)行了傳遞研究，以顯示花生四烯酸在肉體、奶和產(chǎn)出的卵內(nèi)的轉(zhuǎn)移。
[0037]當(dāng)從微生物中被分離出來時(shí)，商業(yè)產(chǎn)物的主要可用形式為通過被孢菌類的絲狀霉發(fā)酵獲得的富含花生四烯酸的油。
[0038]在EP 276541 中描述了米用 alpina, hygrophila, spinosa 被抱菌生產(chǎn) ARA 的工藝。
[0039]國際專利申請WO 94/28913則描述了一種使用高山被孢霉來生產(chǎn)基本上沒有EPA的ARA的發(fā)酵工藝。
[0040]然而，正如EP 726.321中所斷定的，用來測試其生產(chǎn)ARA能力的所有被孢菌(alpina, hygrophila, spinosa, schmuckeri 和 carmagensis),其中生產(chǎn)倉泛力最優(yōu)秀的是被抱菌 schmuckeri 或 carmagensis 的菌株。
[0041]所以，ARA生產(chǎn)領(lǐng)域的專家們承認(rèn)，與M.alpina、hygrophila或spinosa相比,選擇M.Schmuckeri或M.carmagensis菌株,才能保證最佳效率、生產(chǎn)率和重量。
[0042]然而，我們?nèi)耘f需要具備可以生產(chǎn)ARA含量高、并且具有長鏈飽和脂肪酸或長鏈多不飽和脂肪酸全部特性的優(yōu)質(zhì)油。
[0043]此外，對于眾多國家監(jiān)管當(dāng)局而言,嬰兒食品中只允許使用高山被孢霉。
[0044]首先，要由申請公司提供富含花生四烯酸并同時(shí)具有下列成分的油的新配方:
[0045]-含有少量除ARA以外的多不飽和脂肪酸(比如EPA)，
[0046]-含量有限的一些長鏈飽和脂肪酸(比如山崳酸、肉豆蘧酸、棕櫚酸或木焦油酸)。
[0047]此外，申請公司注意到含有少量這些飽和脂肪酸可以獲得在透明度、冷濁度低方面比商品油重量更好的油。
[0048]申請公司還關(guān)注調(diào)試比現(xiàn)有技術(shù)中描述的工藝更高效和更經(jīng)濟(jì)的替代生產(chǎn)工藝，所以在研究中鑒別了具有杰出的生產(chǎn)花生四烯酸的能力的高山被孢霉的新菌株，因?yàn)樗梢陨a(chǎn)50%的花生四烯酸(這里的％表示占全部脂肪酸的重量百分百)。
[0049]因此,與在M.Schmuckeri或M.carmagensis類型的菌株中進(jìn)行研究的技術(shù)先例不同，申請公司找到了生產(chǎn)AM的最佳菌株。
[0050]此外，除了非凡的花生四烯酸生產(chǎn)能力之外，該菌株還可以獲得(這里的％表示占全部脂肪酸的重量百分百):
[0051]-低于0.5%，最好是低于0.2%的EPA，
[0052]-低于0.5%，最好是低于0.2%的肉豆蘧酸(C14:0)，
[0053]-低于9%，最好是低于7%的棕櫚酸(C16:0)，
[0054]-低于3%，最好是低于2.5%的山崳酸(22:0)，以及
[0055]-低于3%，最好是低于2.5%的木焦油酸(C 24:0)。
[0056]2012年6月12日將這種高山被孢霉菌株交存至法國的巴斯德研究所的法國國家微生物保藏中心(CNCM)，編號為CNCM 1-4642，同時(shí)交存至中國的武漢大學(xué)的中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，中華人民共和國武漢市，郵編:430072，編號為M 209116。
[0057]它的特征是:ARN 25S編碼基因Dl - D2部位的順序排列(ID序列號I):
[0058]
【權(quán)利要求】
1.一種高山被孢霉(Mortierella alpina)菌株,其于2012年6月12日在法國國家微生物保藏中心(CNCM)以保藏號1-4642保藏。
2.—種高山被孢霉(Mortierella alpina)菌株，其通過突變或基因工程從權(quán)利要求1的菌株獲得，并且其具有產(chǎn)生以總脂肪酸的重量計(jì)至少50%的花生四烯酸的能力。
3.一種目的脂類化合物的生產(chǎn)方法，包括培養(yǎng)權(quán)利要求1或權(quán)利要求2的菌株，以及回收富含目的脂類化合物的生物質(zhì)，以及任選地，回收目的脂類化合物。
4.權(quán)利要求3的方法，其中目的脂類化合物為花生四烯酸(或ARA)。
5.權(quán)利要求4的方法，其中花生四烯酸(ARA)以油形式存在。
6.權(quán)利要求5的方法，其中包含花生四烯酸的油通過包括下列步驟的方法來制備: -在異養(yǎng)條件下培養(yǎng)菌株，以生產(chǎn)生物質(zhì)，所述生物質(zhì)以重量計(jì)脂類為40到55%，優(yōu)選以重量計(jì)脂類為40到50%，更優(yōu)選以重量計(jì)脂類為約45%，并且具有以總脂肪酸的重量計(jì)50到55%的AM。 -回收所獲得的生物質(zhì)， -干燥所述生物質(zhì)， -用選自己烷和丁烷的溶劑，尤其是用液體丁烷萃取油， -精煉和回收所萃取的油。
7.權(quán)利要求1或權(quán)利要求2 的菌株在生產(chǎn)目的脂類化合物，例如花生四烯酸(ARA)中的應(yīng)用。
8.由權(quán)利要求3的方法產(chǎn)生的脂類化合物，例如花生四烯酸(ARA)在制備食品組合物中的應(yīng)用。
9.一種產(chǎn)物或者組合物，其包含權(quán)利要求1或權(quán)利要求2的菌株，或者其富含目的脂類化合物，例如花生四烯酸(ARA)的細(xì)胞裂解物或者萃取物。
10.權(quán)利要求9的產(chǎn)物或組合物，其中所述產(chǎn)物或組合物富含花生四烯酸(ARA)。
11.權(quán)利要求10的產(chǎn)物或組合物，其中所述產(chǎn)物或組合物包含以總脂肪酸的重量計(jì)50%以上的花生四烯酸(ARA)，并且具有: -低于0.5%，優(yōu)選低于0.2%的二十碳五烯酸(EPA)， -低于0.5%，優(yōu)選低于0.2%的肉豆蘧酸(C14:0)， -低于9%，優(yōu)選低于7%的棕櫚酸(C16:0)， -低于3%，優(yōu)選低于2.5%的山崳酸(C22-.0)，以及 -低于3%，優(yōu)選低于2.5%的木焦油酸(C24:0)。
12.權(quán)利要求9到11任一項(xiàng)的產(chǎn)物或組合物，其中所述產(chǎn)物或組合物是食品或膳食補(bǔ)充劑。
13.—種生產(chǎn)高山被孢霉(Mortierella alpina)菌株的方法,所述高山被孢霉菌株具有產(chǎn)生以總脂肪酸的重量計(jì)至少50%的花生四烯酸，該方法包括權(quán)利要求1的菌株的突變和基因工程。
【文檔編號】C12R1/645GK103667068SQ201210343057
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2012年9月14日 優(yōu)先權(quán)日:2012年9月14日
【發(fā)明者】錢云, 周潔, 伯納德·波拉 申請人:羅蓋特兄弟公司