專利名稱：一種利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的光皮樺轉(zhuǎn)基因方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因光皮樺的方法。2.背景技術(shù)
光皮樺(Betula Iuminifera H. Wink.)為樺木科樺木屬的落葉高大喬木,天然分布于我國秦嶺、淮河流域以南的14個(gè)省區(qū)，是木材材質(zhì)優(yōu)良的闊葉珍貴用材樹種，且具有耐貧瘠、速生、開花早等特性，現(xiàn)已成為中國南方地區(qū)杉木、松樹地更新的最重要珍貴造林樹種，也是良好的林木遺傳學(xué)研究材料。該樹種的育種工作已全面啟動(dòng)，在不同種源區(qū)選擇了優(yōu)良單株，并進(jìn)行雜交創(chuàng)制新種質(zhì)，建立其轉(zhuǎn)基因技術(shù)平臺(tái)對(duì)于開展光皮樺分子育種，創(chuàng)制抗蟲、抗旱新種質(zhì)以及驗(yàn)證已克隆基因的功能等均具有十分重要的作用。
轉(zhuǎn)基因技術(shù)指利用分子生物學(xué)技術(shù)，將某些抗逆、抗病蟲等已知功能性狀的基因， 通過現(xiàn)代科技手段移植到目標(biāo)生物體中，從而對(duì)植物各種性狀進(jìn)行改良的方法。其常用的方法有農(nóng)桿菌介導(dǎo)法；基因槍法；電擊和聚乙二醇(PEG)法和花粉管通道法。迄今為止， 國內(nèi)外已得到60種以上轉(zhuǎn)基因植物，其中棉花、煙草和大豆等已大面積種植。通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)，可以改變光皮樺的遺傳物質(zhì)，提高其抗蟲、抗旱和木材品質(zhì)，從而降低生產(chǎn)成本，提高經(jīng)濟(jì)效益。
CN200910113862. 4公開了諶紅輝的“光皮樺葉芽組織培養(yǎng)快速繁殖技術(shù)”發(fā)明專利技術(shù)，以光皮樺葉芽為外植體，誘導(dǎo)再生植株，這種方法雖然繁殖系數(shù)較高，但選材時(shí)間較難，而采用種子和葉片作為外植體采樣比較方便且可以多次采集。3.發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是建立光皮樺組培體系并利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)培養(yǎng)光皮樺轉(zhuǎn)基因植株。
解決上述技術(shù)問題的技術(shù)方案是按如下步驟進(jìn)行
(I)培養(yǎng)基配方
預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基配方MS+TDZ0.4mg/L+NAA0. 05mg/L+ 蔗糖 30g/L+ 瓊脂 5. 5g/ L (PH5. 9)
共培養(yǎng)培養(yǎng)基配方MS+TDZ0.4mg/L+NAA0. 05mg/L+ 蔗糖 30g/L+ 瓊脂 6g/ L+AS300ymol/L (PH5. 5)
選一培養(yǎng)基配方MS+TDZ0.4mg/L+NAA0. 05mg/L+ 蔗糖 30g/L+ 瓊脂 5. 5g/ L+Carb500mg/L+Hygl0mg/L
(PH5. 9)
選二、選三培養(yǎng)基配方MS+BA0.5mg/L+TDZ0. lmg/L+ 蔗糖 30g/L+ 瓊脂 5. 5g/ L+Carb500mg/L+Hygl0mg/L
(PH5. 9)
生根培養(yǎng)培養(yǎng)基配方l/2MS+IBAlmg/L+蔗糖 20g/L+ 瓊脂 5. 5g/L (PH5. 9)
AS(乙酰丁香酮)、Carb (羧芐青霉素)和Hyg (潮霉素)都在培養(yǎng)基倒板前溫度低于50°C時(shí)再加入，防止失效。
(2)光皮樺組培苗的準(zhǔn)備
A :種子消毒滅菌將收集的光皮樺種子放入50ml無菌離心管中，倒入70%酒精消毒1-2分鐘；倒去酒精，加入40ml O. I %升汞溶液，浸泡5min ;倒去升汞溶液，用無菌蒸餾水清洗種子4-5遍。
B :小苗誘導(dǎo)與繼代培養(yǎng)將滅好菌的種子放在無菌濾紙上吸干水分，置入MS培養(yǎng)基中；操作完畢后用封口膜(MicroporeTM Surgical Tape)封好培養(yǎng)皿，在25°C-28°C下光照培養(yǎng)2周；將發(fā)芽的小苗置入繼代培養(yǎng)基1/2MS，每瓶3-4株，培養(yǎng)2-3個(gè)月(25°C -28°C 下光照培養(yǎng))。
⑶預(yù)培養(yǎng)
選取長勢較好的組培苗的葉片為外植體。選取其前3片較幼嫩的葉片，用剪刀在葉片上剪2-3道傷口(深達(dá)葉脈)，較大的葉片可剪成O. 5cm大小，接入預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基，每皿 40-50片，暗培養(yǎng)7天。
(4)農(nóng)桿菌培養(yǎng)
挑取農(nóng)桿菌單克隆或吸取所保藏的農(nóng)桿菌菌液100 μ I于5mlYEP (含50mg/LKan 和50mg/LStr)培養(yǎng)基中，28°C，250rpm振蕩培養(yǎng)20_36h至飽和，再按O. 2% -O. 3%的比例， 轉(zhuǎn)入含有抗生素的YEP培養(yǎng)基中，相同條件下培養(yǎng)12-16h，當(dāng)0D600的值為O. 8-1. O時(shí)即可用于轉(zhuǎn)化。
(5)轉(zhuǎn)化和共培養(yǎng)
A :取培養(yǎng)好的菌液IOOml分裝于50ml離心管中，4000rpm,離心20-30min,去上清。用含300 μ mo I/LAS的IOOmlMS感菌液(PH5. 5)制成懸浮液，使菌液0D600終濃度為
B :將預(yù)培養(yǎng)過的光皮樺葉片放入農(nóng)桿菌懸浮液中侵染20min ；
C :取出葉片，置于無菌濾紙上浙干10_20min ；
D :將葉片置于共培養(yǎng)培養(yǎng)基上，25°C暗培養(yǎng)5天。
(6)選擇培養(yǎng)
A :將共培養(yǎng)好的葉片轉(zhuǎn)入選一培養(yǎng)基中，每皿10-12片或每瓶4-5片，25°C -28°C 光照培養(yǎng)3-4周；
B :將選一培養(yǎng)基上長出的帶芽原基和微芽的愈傷塊，轉(zhuǎn)入選二培養(yǎng)基，每瓶4-5 塊，光照培養(yǎng)4周；
C :將選二上未達(dá)到生根要求的小苗和愈傷組織繼續(xù)轉(zhuǎn)入選三培養(yǎng)基，每瓶4-5 塊，光照培養(yǎng)4周。
(7)生根培養(yǎng)
將長至Icm以上的小苗，轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)，每瓶接1-2株。
(8)馴化移栽
A、選取長勢較好(根部和莖葉分化的較好)的試管苗，打開蓋子，煉苗1-3天；
B、將幼苗取出，洗凈小苗根部附著的培養(yǎng)基，然后移栽于溫室花盆中(基質(zhì)由泥炭珍珠巖蛭石按I : I : I配制)，再用1000倍液多菌靈澆透，蓋膜一周，每天澆水，保證濕度，促進(jìn)生根。
本發(fā)明的有益效果是(1)利用光皮樺種子和無菌苗葉片作為外植體材料，建立了其較完善的無菌組培快繁體系。(2)在光皮樺組培快繁體系的基礎(chǔ)上，建立了其轉(zhuǎn)基因體系(農(nóng)桿菌介導(dǎo))，為以后轉(zhuǎn)基因植株的選擇創(chuàng)建了基礎(chǔ)。4.


圖I :光皮樺組培苗；圖2 :預(yù)培養(yǎng)7天后的葉片；圖3 :共培養(yǎng)5天后的葉片；圖4 : 選一培養(yǎng)基培養(yǎng)3-4周后長出的愈傷組織；圖5 :選二培養(yǎng)基培養(yǎng)4周后長出的小苗；圖6 : 選三培養(yǎng)基培養(yǎng)4周后長出的小苗；圖7 :小苗生根培養(yǎng)。5.具體實(shí)施方式
下面結(jié)合實(shí)施例作進(jìn)一步詳述
實(shí)施 例I23培養(yǎng)階段選一培養(yǎng)階段選二培養(yǎng)階段生根培養(yǎng)階段培養(yǎng)基MS+TDZO. 4mg/L+NAA0. 05mg/L+ 蔗糖30g/L+瓊脂5. 5 g/L +Carb500mg/L+Hygl0mg/LMS+BAO. 5mg/L+TDZ0. lmg/L+蔗糖 30g/L+瓊脂 5. 5g/L +Carb500mg/L+Hygl0mg/Ll/2MS+IBAlmg/L+蔗糖 20g/L+瓊脂 5. 5g/L培養(yǎng)時(shí)間3-4周4周2周培養(yǎng)材料共培養(yǎng)后的愈傷組織選一培養(yǎng)后帶芽的愈傷組織篩選培養(yǎng)后得到的小苗成功率%46.856. 86100
實(shí)施例I :將共培養(yǎng)5天后的葉片轉(zhuǎn)入選一培養(yǎng)基中，每皿接種10-12片， 250C _28°C下光照培養(yǎng)3-4周，之后統(tǒng)計(jì)有效培養(yǎng)數(shù)并計(jì)算出選一培養(yǎng)階段的再生率；
實(shí)施例2 :選取選一培養(yǎng)基上長出帶芽原基和微芽的愈傷塊，轉(zhuǎn)入選二培養(yǎng)基，每瓶接種4-5塊，25°C _28°C下光照培養(yǎng)4周，之后統(tǒng)計(jì)有效培養(yǎng)數(shù)并計(jì)算出選二培養(yǎng)階段的成苗率；
實(shí)施例3 :將選擇培養(yǎng)得到的高于Icm的小苗轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基中，在相同培養(yǎng)條件下進(jìn)行生根培養(yǎng)，待長有5條健壯根系即可進(jìn)行煉苗移栽。
總之本方法的關(guān)鍵在于接種材料的選擇和處理、培養(yǎng)基的成分含量和培養(yǎng)條件及培養(yǎng)時(shí)間的選擇。
權(quán)利要求
1.ー種利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的光皮樺轉(zhuǎn)基因方法，其技術(shù)方案按如下步驟進(jìn)行 (1)培養(yǎng)基配方 預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基配方MS+TDZO. 4mg/L+NAA0. 05mg/L+ 蔗糖 30g/L+ 瓊脂 5. 5g/L(PH5. 9)共培養(yǎng)培養(yǎng)基配方MS+TDZO. 4mg/L+NAA0. 05mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂6g/L+AS300ymol/L (PH5. 5) 選ー培養(yǎng)基配方MS+TDZO. 4mg/L+NAA0. 05mg/L+蔗糖 30g/L+瓊脂 5. 5g/L+Carb500mg/L+HyglOmg/L (PH5.9) 選 ニ、選三培養(yǎng)基配方MS+BA0. 5mg/L+TDZ0. lmg/L+ 蔗糖 30g/L+ 瓊脂 5. 5g/ L+Carb500mg/L+Hygl0mg/L (PH5.9) 生根培養(yǎng)培養(yǎng)基配方l/2MS+IBAlmg/L+蔗糖20g/L+瓊脂5. 5g/L (PH5. 9) AS(こ酰丁香酮)、Carb (羧芐青霉素)和Hyg (潮霉素)都在培養(yǎng)基倒板前溫度低于50°C時(shí)再加入，防止失效。
(2)光皮樺組培苗的準(zhǔn)備 A :種子消毒滅菌將收集的光皮樺種子放入50ml無菌離心管中，倒入70%酒精消毒1-2分鐘；倒去酒精，加入40ml0. I %升汞溶液，浸泡5min ;倒去升汞溶液，用無菌蒸餾水清洗種子4-5遍。
B :小苗誘導(dǎo)與繼代培養(yǎng)將滅好菌的種子放在無菌濾紙上吸干水分，置入MS培養(yǎng)基中；操作完畢后用封ロ膜(MicroporeTM Surgical Tape)封好培養(yǎng)皿，在25°C-28°C下光照培養(yǎng)2周；將發(fā)芽的小苗置入繼代培養(yǎng)基1/2MS，每瓶3-4株，培養(yǎng)2-3個(gè)月(25°C -28°C下光照培養(yǎng))。
(3)預(yù)培養(yǎng) 選取長勢較好的組培苗的葉片為外植體。選取其前3片較幼嫩的葉片，用剪刀在葉片上剪2-3道傷ロ(深達(dá)葉脈)，較大的葉片可剪成O. 5cm大小，接入預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基，每皿40-50片，暗培養(yǎng)7天。
(4)農(nóng)桿菌培養(yǎng) 挑取農(nóng)桿菌單克隆或吸取所保藏的農(nóng)桿菌菌液IOOy I于5mlYEP(含50mg/LKan和50mg/LStr)培養(yǎng)基中，28°C，250rpm振蕩培養(yǎng)20_36h至飽和，再按O. 2% -O. 3%的比例，轉(zhuǎn)入含有抗生素的YEP培養(yǎng)基中， 相同條件下培養(yǎng)12-16h，當(dāng)0D600的值為O. 8-1. O時(shí)即可用于轉(zhuǎn)化。
(5)轉(zhuǎn)化和共培養(yǎng) A :取培養(yǎng)好的菌液IOOml分裝于50ml離心管中，4000rpm,離心20_30min,去上清。用含300 μ mo I/LAS的IOOmlMS感菌液(PH5. 5)制成懸浮液，使菌液0D600終濃度為I. O ； B :將預(yù)培養(yǎng)過的光皮樺葉片放入農(nóng)桿菌懸浮液中侵染20min ； C :取出葉片，置于無菌濾紙上浙干10-20min ； D :將葉片置于共培養(yǎng)培養(yǎng)基上，25°C暗培養(yǎng)5天。
(6)選擇培養(yǎng) A :將共培養(yǎng)好的葉片轉(zhuǎn)入選ー培養(yǎng)基中，每皿10-12片或每瓶4-5片，25°C _28°C光照培養(yǎng)3-4周； B :將選ー培養(yǎng)基上長出的帶芽原基和微芽的愈傷塊，轉(zhuǎn)入選ニ培養(yǎng)基，每瓶4-5塊，光照培養(yǎng)4周； C :將選ニ上未達(dá)到生根要求的小苗和愈傷繼續(xù)轉(zhuǎn)入選三培養(yǎng)基，每瓶4-5塊，光照培養(yǎng)4周。
(7)生根培養(yǎng) 將長至Icm以上的小苗，轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)，每瓶接1-2株。
(8)馴化移栽 A、選取長勢較好( 根部和莖葉分化的較好)的試管苗，打開蓋子，煉苗1-3天； B、將幼苗取出，洗浄小苗根部附著的培養(yǎng)基，然后移栽于溫室花盆中(基質(zhì)由泥炭珍珠巖蛭石按I : I : I配制)，再用1000倍液多菌靈澆透，蓋膜一周，每天澆水，保證濕度，促進(jìn)生根。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的光皮樺轉(zhuǎn)基因方法，包括下列步驟(1)以光皮樺種子為外植體培養(yǎng)得到組培苗；(2)選取幼嫩的組培苗葉片接入預(yù)培養(yǎng)基中，黑暗培養(yǎng)；(3)用MS培養(yǎng)基重懸培養(yǎng)基重懸離心收集的農(nóng)桿菌菌體制得農(nóng)桿菌菌液；(4)將預(yù)培養(yǎng)的葉片，投入農(nóng)桿菌菌液中侵染一段時(shí)間后取出外植體，轉(zhuǎn)入共培養(yǎng)基培養(yǎng)；(5)共培養(yǎng)后的材料轉(zhuǎn)入篩選培養(yǎng)基中誘導(dǎo)不定芽的再生；(6)生根培養(yǎng)；(7)煉苗移栽。本發(fā)明建立了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的光皮樺遺傳轉(zhuǎn)化體系，為通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)深入研究并發(fā)掘光皮樺的最佳使用價(jià)值奠定了基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)C12N15/82GK102978235SQ20121034386
公開日2013年3月20日 申請(qǐng)日期2012年9月17日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月17日
發(fā)明者童再康, 李美飛, 黃華宏, 樓雄珍, 姜小鳳 申請(qǐng)人:浙江農(nóng)林大學(xué)