嗜肺軍團(tuán)菌快速鑒定方法
【專利摘要】本發(fā)明為一種嗜肺軍團(tuán)菌的快速鑒定方法，它采用一對軍團(tuán)菌特異引物擴(kuò)增16S?rRNA基因上的區(qū)域，在該擴(kuò)增片段內(nèi)針對嗜肺軍團(tuán)菌特異序列設(shè)計一對雜交探針，錨定探針3'端標(biāo)記FAM熒光基團(tuán)，猝滅探針5'端標(biāo)記BHQ1，3'端磷酸化，通過實時熒光PCR熔解曲線分析來檢測樣本中的嗜肺軍團(tuán)菌。該檢測方法主要步驟包括樣本DNA提取、實時熒光PCR反應(yīng)、熔解曲線分析3步。該方法操作簡便快速，結(jié)果直觀，且靈敏度高，特異性好，穩(wěn)定性好，可以廣泛應(yīng)用于臨床及環(huán)境水樣本中嗜肺軍團(tuán)菌的快速鑒定。
【專利說明】嗜肺軍團(tuán)菌快速鑒定方法【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體是一種利用熒光PCR熔解曲線鑒定嗜肺軍團(tuán)菌的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]軍團(tuán)菌是一種兼性胞內(nèi)寄生菌，是引起人類軍團(tuán)菌病的重要病原體。近年來，軍團(tuán)菌病在世界各地時有爆發(fā)流行，我國已將其列入14種新發(fā)傳染病之一。據(jù)國外報道，院內(nèi)不明原因肺炎感染有10%是由軍團(tuán)菌引起。目前已知軍團(tuán)菌有52個種，70多個血清型。但臨床上80%以上軍團(tuán)菌感染是由嗜肺軍團(tuán)菌引起。因此，嗜肺軍團(tuán)菌的鑒定對于軍團(tuán)菌病診斷具有重大價值。
[0003]目前軍團(tuán)菌的檢測鑒定方法主要有分離培養(yǎng)、血清抗體檢測、尿可溶性抗原檢測，此外，還有分子分型檢測技術(shù)，主要包括傳統(tǒng)的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)電泳及探針雜交檢測方法、擴(kuò)增長度多態(tài)性分析(AFLP)、限制性片段長度多態(tài)性分析(RFCP)、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性分析(RAPD)、限制性酶切分析、DNA測序分析等。但以上的檢測方法均存在不足，如直接分離培養(yǎng)，所需時間長達(dá)3~10天，陽性率低，培養(yǎng)基配置復(fù)雜，價格昂貴；尿抗原檢測僅對嗜肺軍團(tuán)菌血清型I型具有特異性；分子分型技術(shù)雖然在很大程度上提高了軍團(tuán)菌檢測的敏感性和特異性，但仍然存在各自的缺點，如傳統(tǒng)的PCR檢測操作繁瑣、耗時長、易污染；基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移原理的雜交探針標(biāo)記技術(shù)價格昂貴、操作復(fù)雜；DNA測序是最為準(zhǔn)確的軍團(tuán)菌種鑒定方法，但耗時較長，分析困難，不能適應(yīng)臨床上的快速要求，其他分子檢測方法均存在各種不足。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移原理，根據(jù)嗜肺軍團(tuán)菌16S rRNA基因保守序列設(shè)計引物和探針，選取一種猝滅熒光基團(tuán)代替原有的雜交探針熒光標(biāo)記物，建立新型的實時熒光PCR熔解曲線法對嗜肺軍團(tuán)菌進(jìn)行鑒定。
[0005]本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的:一種嗜肺軍團(tuán)菌快速鑒定方法，基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移原理，選取一種猝滅熒光基團(tuán)，建立新型的實時熒光PCR熔解曲線法對嗜肺軍團(tuán)菌進(jìn)行鑒定。
[0006]進(jìn)一步地，所述鑒定方法的步驟如下(I)至(4)所列，
[0007](I)實時熒光PCR反應(yīng)建立中所采用的一對引物和一對探針:
[0008]上游引物:5’ -AGGGTTGATAGGTTAAGAGC-3 ’，
[0009]下游引物:5’ -CCAACAGCTAGTTGACATCG-3 ’，
[0010]錨定探針:5’ -CCCATACTCGAGTCAACC (FAM) -3 ’，
[0011]猝滅探針:5’-(BHQl)TATTATCTGACCGTCCCAG(ph)-3’ ；
[0012](2)提取DNA:取痰液標(biāo)本Iml加等量0.1% 二硫蘇糖醇痰消化液處理，37°C下放置30min,離心沉淀，于沉淀物種中加入自配的基因組DNA提取液60 μ 1，充分混勻，55°C水浴30min, 100°C水浴lOmin，上清液即是基因組DNA模板；[0013](3)以上取得的基因組DNA為模板，進(jìn)行實時熒光PCR反應(yīng)程序:先95°C預(yù)變性3min，再95°C變性10s，57。。退火20s，72。。延伸30s，進(jìn)行50個循環(huán)；
[0014](4)檢測結(jié)果判定，熔解曲線分析程序為:95°C Imin ；40°C 2min ;以1°C/5s的速度，從40°C升溫至85°C，嗜肺軍團(tuán)菌的Tm值均為57°C，其它非嗜肺軍團(tuán)菌及非軍團(tuán)菌均無57°C 的 Tm 值。
[0015]所述PCR反應(yīng)體系如下:
[0016]
【權(quán)利要求】
1.一種嗜肺軍團(tuán)菌快速鑒定方法，其特征在于，基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移原理，選取一種猝滅熒光基團(tuán)，建立新型的實時熒光PCR熔解曲線法對嗜肺軍團(tuán)菌進(jìn)行鑒定。
2.權(quán)利要求書I所述的嗜肺軍團(tuán)菌快速鑒定方法，其特征在于，所述鑒定方法的步驟如下所列， (O實時熒光PCR反應(yīng)建立中所采用的一對引物和一對探針: 上游引物:5’ -AGGGTTGATAGGTTAAGAGC-3’， 下游引物:5’ -CCAACAGCTAGTTGACATCG-3’， 錨定探針:5’ -CCCATACTCGAGTCAACC(FAM)-3’， 猝滅探針:5’ -(BHQl)TATTATCTGACCGTCCCAG(ph)-3’ ； (2)提取DNA:取痰液標(biāo)本Iml加等量0.1% 二硫蘇糖醇痰消化液處理，37°C下放置30min,離心沉淀，于沉淀物種中加入自配的基因組DNA提取液60 μ 1，充分混勻，55°C水浴30min, 100°C水浴lOmin，上清液即是基因組DNA模板； (3)以上取得的基因組DNA為模板，進(jìn)行實時熒光PCR反應(yīng)程序:先95°C預(yù)變性3min,再95°C變性10s，57°C退火20s，72°C延伸30s，進(jìn)行50個循環(huán)； (4)檢測結(jié)果判定，熔解曲線分析程序為:95°CImin ；40°C 2min ;以1°C /5s的速度，從40°C升溫至85°C，嗜肺軍團(tuán)菌的Tm值均為57°C，其它非嗜肺軍團(tuán)菌及非軍團(tuán)菌均無57°C 的 Tm 值。
3.如權(quán)利要求2所述`的嗜肺軍團(tuán)菌快速鑒定方法，其特征在于所述PCR反應(yīng)體系如下:
4.如權(quán)利要求2所述的嗜肺軍團(tuán)菌快速鑒定方法，其特征在于所述基因組DNA提取液為:
【文檔編號】C12Q1/04GK103525902SQ201210346366
【公開日】2014年1月22日 申請日期:2012年9月18日 優(yōu)先權(quán)日:2012年9月18日
【發(fā)明者】朱慶義, 胡朝暉, 趙利偉, 戈立秀 申請人:南寧金域醫(yī)學(xué)檢驗所有限公司