專利名稱：通過(guò)在早期胚胎發(fā)育期間生長(zhǎng)和/或發(fā)育相關(guān)基因的轉(zhuǎn)基因過(guò)量表達(dá)來(lái)增加種子大小和 ...的制作方法
通過(guò)在早期胚胎發(fā)育期間生長(zhǎng)和/或發(fā)育相關(guān)基因的轉(zhuǎn)基因過(guò)量表達(dá)來(lái)増加種子大小和種子數(shù)目本申請(qǐng)是申請(qǐng)日為2006年12月15日、申請(qǐng)?zhí)枮?00680052853. 3、發(fā)明名稱為“通
過(guò)在早期胚胎發(fā)育期間生長(zhǎng)和/或發(fā)育相關(guān)基因的轉(zhuǎn)基因過(guò)量表達(dá)來(lái)增加種子大小和種子數(shù)目”的發(fā)明專利申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。與相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用本申請(qǐng)要求于2005年12月15日提交的美國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?0/750,991的優(yōu)先權(quán)，所述專利對(duì)于所有目的通過(guò)提及而整體合并入本文。發(fā)明背景 作為農(nóng)作物改良的目標(biāo)的最重要性狀是產(chǎn)量。通過(guò)開發(fā)新的植物品種來(lái)改善農(nóng)作物產(chǎn)量的努力可以分成2種方法。一種是通過(guò)培育或改造具有増加的對(duì)于非生物應(yīng)激條件例如干旱、寒冷或鹽或者由害蟲或致病病原體引起的生物應(yīng)激條件的抗性的農(nóng)作物品種來(lái)減少農(nóng)作物產(chǎn)量損失。雖然這種方法有價(jià)值，但它在不存在應(yīng)激條件的情況下不提供根本改善的農(nóng)作物產(chǎn)量。第二種方法是培育或改造新的農(nóng)作物品種，其中基本生產(chǎn)能力得到增加。傳統(tǒng)育種程序最初在改善各種農(nóng)作物的產(chǎn)量方面產(chǎn)生了實(shí)質(zhì)的進(jìn)步。通常經(jīng)歷的模式雖然最初在產(chǎn)量方面具有實(shí)質(zhì)進(jìn)步，但隨后為變得更小且更難以獲得的増加的進(jìn)ー步改善。最近開發(fā)的基于分子生物學(xué)技術(shù)的方法原則上已提供了這樣的潛力，即通過(guò)改變?cè)谥参锷L(zhǎng)和/或發(fā)育中起作用的植物基因表達(dá)的時(shí)機(jī)、位置或水平來(lái)達(dá)到農(nóng)作物產(chǎn)量方面的實(shí)質(zhì)改善。在過(guò)去的20年中，在鑒定在植物生長(zhǎng)和/或發(fā)育中起作用的植物基因方面已取得重大進(jìn)展。由于植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)和它最終如何涉及產(chǎn)量性狀的復(fù)雜性，這些基因中的哪ー些(如果有的話)將是改善農(nóng)作物產(chǎn)量的明確候選物仍不明了。為了鑒定具有生長(zhǎng)和/或發(fā)育功能的植物基因而進(jìn)行的許多工作已在模型植物系統(tǒng)擬南芥(Arabidopsis thaliana)中完成。稱為REVOLUTA (REV)的一種此類基因最初被鑒定為擬南芥屬物種(Arabidopsis)中的功能喪失突變,稱為revl (Talbert等人，Development 121:2723-2735,1995)。這種突變對(duì)植物生長(zhǎng)和形態(tài)具有多效效應(yīng)。感興趣的revl突變的ー種表型是明顯更大的種子。這種表型是農(nóng)業(yè)上可能需要的，但不幸的是，它伴隨著不希望的性狀例如減少的花和種子數(shù)目、不育和改變的葉形態(tài)。除了更大的種子夕卜，revl突變體還顯示出更大的葉、莖和花。通過(guò)作圖克隆方法(在WO 01/33944中描述，該文獻(xiàn)通過(guò)提及而整體合并入本文)而鑒定出REV基因，并且它被證明是屬于轉(zhuǎn)錄因子的同源域-亮氨酸拉鏈(homedomain-leucine zipper, HD-ZIP)家族的轉(zhuǎn)錄因子。在植物中，HD-Zip基因參與許多發(fā)育途徑，包括維管組織發(fā)育、毛狀體(trichome)和根毛發(fā)育、以及光調(diào)節(jié)應(yīng)答。因?yàn)閞evl可能是功能喪失突變，所以試圖通過(guò)表達(dá)反向重復(fù)REV (REV-IR)構(gòu)建體或者通過(guò)由REV基因的強(qiáng)過(guò)量表達(dá)所觸發(fā)的共抑制來(lái)敲除轉(zhuǎn)基因擬南芥屬物種中的REV功能(W0 01/33944)。REV-IR構(gòu)建體產(chǎn)生弱的revl表型。revl表型包括更大、更重的種子，這也在REV過(guò)量表達(dá)品系中觀察到，其中REV轉(zhuǎn)基因遍及植物的強(qiáng)組成型表達(dá)由組成型35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)。有趣的是，這種效應(yīng)與增加的REV mRNA水平相關(guān)，這表明這不是由于內(nèi)源性REV基因的共抑制。REV過(guò)量表達(dá)而非抑制導(dǎo)致了増加的種子大小這一事實(shí)是重要的發(fā)現(xiàn)，因?yàn)槭褂胷evl突變體的先前工作這是未曾預(yù)料到的。REV轉(zhuǎn)基因遍及植物的強(qiáng)組成型表達(dá)模擬了 revl突變體的大種子表型，但它還復(fù)制了使用revl突變體時(shí)可見的不希望的表型。盡管通過(guò)REV轉(zhuǎn)基因的組成型過(guò)量表達(dá)的技術(shù)上直捷的方法來(lái)獲得更大的種子大小表型的能力顯示出具有前景，但不希望的表型意味著這種方法對(duì)于商業(yè)化農(nóng)業(yè)應(yīng)用將是不可行的。對(duì)于許多農(nóng)作物種類，農(nóng)業(yè)上相關(guān)的植物部分是種子。如果可以獲得大種子性狀而沒有普遍組成型REV過(guò)量表達(dá)的有害副作用，那么它將具有潛在極大的農(nóng)業(yè)價(jià)值?？朔@個(gè)問(wèn)題的ー種可能途徑是將REV過(guò)量表達(dá)特異地局限于種子。盡管許多種子特異性啟動(dòng) 子是已知的并且具有可以潛在地用于驅(qū)動(dòng)REV轉(zhuǎn)基因表達(dá)的特征，但沒有證據(jù)暗示，原則上，局限于種子的REV過(guò)量表達(dá)將實(shí)際導(dǎo)致増加的種子大小。種子中植物的內(nèi)源性REV基因的天然功能已知是在分生組織起始和近軸細(xì)胞命運(yùn)決定方面(Otsuga等人,Plant J. 25 223-236,2001 ；McConnell 和 Barton, Development 125 :2935-2942 (1998) ；McConnell 等人，Nature 411 :709-713,2001 ;Emery 等人，Curr. Biol. 13 :1768-1774，2003)而不是在細(xì)胞生長(zhǎng)或分裂方面。此外，還不知道，在35S/REV過(guò)量表達(dá)的植物中的大種子大小表型是由于種子中或正在發(fā)育的胚胎中REV的過(guò)量表達(dá)，還是由于由遍及植物組織的REV過(guò)量表達(dá)所引起的對(duì)植物的總體生長(zhǎng)和發(fā)育的影響。除了缺乏REV在種子中對(duì)種子大小決定具有影響的任何己知生物功能外，也沒有信息表明，在種子的哪個(gè)部分中或在種子發(fā)育期間的哪個(gè)階段時(shí)嘗試過(guò)量表達(dá)REV轉(zhuǎn)基因以達(dá)到種子大小的増加可能是最佳的。本發(fā)明提供了在胚胎發(fā)育的早期階段期間生長(zhǎng)和/或發(fā)育相關(guān)基因的胚胎特異性過(guò)量表達(dá)，當(dāng)與不過(guò)量表達(dá)該基因的野生型植物相比較時(shí)，這導(dǎo)致種子大小的増加。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，使用早期胚胎特異性啟動(dòng)子來(lái)過(guò)量表達(dá)REV基因。達(dá)到了増加的種子大小性狀而沒有采用遍及植物的REV組成型過(guò)量表達(dá)時(shí)可見的有害副作用。此外，當(dāng)與野生型植物相比較時(shí)，REV的胚胎特異性過(guò)量表達(dá)產(chǎn)生了關(guān)于“種子總數(shù)目/植物”的増加方面的未預(yù)測(cè)到的結(jié)果。種子總數(shù)目的増加起因于種子數(shù)目/莢的增加、總狀花序數(shù)目/植物的増加、英數(shù)目/總狀花序的増加、種子敗育率的減少，或者這些效應(yīng)的組合?？傊捎赗EV在正在發(fā)育的胚胎中的過(guò)量表達(dá)而引起的増加的種子大小和増加的種子數(shù)目導(dǎo)致與野生型植物相比較而言總產(chǎn)量的大量増加，并且證實(shí)與植物生長(zhǎng)和/或發(fā)育相關(guān)的基因可以與早期胚胎特異性啟動(dòng)子相結(jié)合地過(guò)量表達(dá)，以增加植物產(chǎn)量。發(fā)明概述本發(fā)明提供了用于增加轉(zhuǎn)基因植物中的種子大小和/或種子數(shù)目的方法和組合物。特別地，本發(fā)明涉及與基因有效地結(jié)合的早期特異性胚胎啟動(dòng)子用于在轉(zhuǎn)基因植物的正在發(fā)育的種子中過(guò)量表達(dá)該基因和/或由該基因編碼的蛋白質(zhì)的用途，所述基因與植物生長(zhǎng)和/或發(fā)育相關(guān)。當(dāng)與野生型植物相比較時(shí)，在轉(zhuǎn)基因植物中在種子發(fā)育的這個(gè)早期階段期間所述基因的過(guò)量表達(dá)在轉(zhuǎn)基因植物中提供了増加的種子產(chǎn)生和/或増加的種子大小。在本發(fā)明的ー個(gè)具體實(shí)施方案中，將REV基因與早期特異性胚胎啟動(dòng)子有效地結(jié)合，以提供REV蛋白在轉(zhuǎn)基因植物的正在發(fā)育的種子中的過(guò)量表達(dá)。REV在種子發(fā)育的這個(gè)早期階段期間的過(guò)量表達(dá)令人驚訝地導(dǎo)致在轉(zhuǎn)基因植物中増加的種子大小和増加的種子產(chǎn)生，而沒有當(dāng)遍及植物地過(guò)量表達(dá)REV時(shí)可見的有害副作用。還提供了用于增加植物中的種子大小的方法，其包括在早期胚胎發(fā)育期間在種子中過(guò)量表達(dá)與植物生長(zhǎng)和/或發(fā)育相關(guān)的基因。特別地，該方法包括在早期特異性胚胎啟動(dòng)子的控制下在種子中表達(dá)所述生長(zhǎng)和/或發(fā)育相關(guān)基因。所述早期特異性胚胎啟動(dòng)子對(duì)于所述植物來(lái)說(shuō)可以是異源的或同源的。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，所述啟動(dòng)子是與氨基酸通透酶基因例如AAP1、油酸12-羥化酶去飽和酶基因、2S2白蛋白基因、脂肪酸延長(zhǎng)酶(fatty acid elongase)基因例如 FAEl 或葉狀子葉基因(leafy cotyledon gene)相關(guān)的早期特異性啟動(dòng)子。在本發(fā)明中有用的具體啟動(dòng)子包括來(lái)自擬南芥的AAPl啟動(dòng)子、來(lái)自Lesquerella fendleri的油酸12-羥化酶去飽和酶基因啟動(dòng)子(LFAH12)、來(lái)自擬南芥的2S2基因啟動(dòng)子或葉狀子葉基因LEC2啟動(dòng)子。在本發(fā)明的ー個(gè)具體實(shí)施方案中，REV基因與早期特異性胚胎啟動(dòng)子有效地結(jié)合。在這種方法中，REV基因在種子的早期發(fā)育中過(guò)量表達(dá)，并導(dǎo)致與野生型植物相比較而言種 子大小和種子數(shù)目的増加。本發(fā)明的方法可以用于增加被表征為單子葉植物或雙子葉植物的植物中的種子大小和/或種子數(shù)目。特別地，該方法可以用于増加植物中的種子大小和/或種子數(shù)目，所述植物是十字花科(Brassicacea (Cruciferae))、禾本科(Gramineae)、錦葵科(Malvaceae)或 科-蝶形花亞科(Leguminosae-Papilionoideae)的成員。對(duì)于本發(fā)明方法的使用來(lái)說(shuō)感興趣的具體植物包括卡諾拉油菜(canola)、玉米、亞麻薺、棉花、苜蓿、大豆、小麥、稻或大麥。本發(fā)明還提供了遺傳構(gòu)建體，其包含關(guān)于與一種或多種控制序列有效地連接的與植物生長(zhǎng)和/或發(fā)育相關(guān)的基因的核酸序列，其中所述ー種或多種控制序列能夠促進(jìn)所述基因在胚胎發(fā)育期間的表達(dá)。特別地，本發(fā)明的遺傳構(gòu)建體包含控制序列，所述控制序列包括早期特異性胚胎啟動(dòng)子。早期特異性胚胎啟動(dòng)子可以包括與氨基酸通透酶基因(AAP1)、油酸12-羥化酶去飽和酶基因、2S2白蛋白基因(2S2)、脂肪酸延長(zhǎng)酶基因(FAEl)或葉狀子葉基因(LEC2)相關(guān)的啟動(dòng)子。本發(fā)明的典型遺傳構(gòu)建體包含來(lái)自擬南芥的AAPl啟動(dòng)子、來(lái)自Lesquerella fendleri的油酸12-羥化酶去飽和酶基因啟動(dòng)子(LFAH12)、來(lái)自擬南芥的2S2基因啟動(dòng)子、來(lái)自擬南芥的脂肪酸延長(zhǎng)酶基因啟動(dòng)子、或來(lái)自擬南芥的葉狀子葉基因2啟動(dòng)子。具體的本發(fā)明的遺傳構(gòu)建體包含與來(lái)自擬南芥屬物種的REV基因有效地結(jié)合的早期特異性胚胎啟動(dòng)子。所述遺傳構(gòu)建體還可以包括有效地結(jié)合的PolyA序列。本發(fā)明還提供了用于產(chǎn)生具有増加的種子大小和/或種子數(shù)目的轉(zhuǎn)基因植物的方法，所述方法包括(a)將如上所述的遺傳構(gòu)建體引入植物或植物細(xì)胞內(nèi)，和(b)在促進(jìn)再生和成熟植物生長(zhǎng)的條件下培養(yǎng)包含所述遺傳構(gòu)建體的所述植物或植物細(xì)胞。通常，該方法產(chǎn)生當(dāng)與相應(yīng)的野生型植物相比較時(shí)具有増加的種子大小和/或種子數(shù)目的轉(zhuǎn)基因植物。包含所述遺傳構(gòu)建體的轉(zhuǎn)基因植物可以是單子葉或雙子葉植物，特別地其中所述單子葉植物是禾本科的成員。特別感興趣的來(lái)自禾本科的植物包括稻、燕麥、玉米或小麥。此夕卜，本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物是十字花科、錦葵科或豆科-蝶形花亞科的植物。特別地，其中轉(zhuǎn)基因植物是大豆、棉花、亞麻薺、苜?；蚩ㄖZ拉油菜。
本發(fā)明還提供了用于選擇當(dāng)與早期特異性胚胎啟動(dòng)子功能性地相結(jié)合時(shí)增加植物產(chǎn)量的基因的方法，其包括構(gòu)建表達(dá)載體，所述表達(dá)載體包含與早期特異性胚胎啟動(dòng)子功能性地相結(jié)合的與植物生長(zhǎng)和/或發(fā)育相關(guān)的基因；用所述表達(dá)載體轉(zhuǎn)染植物細(xì)胞以形成轉(zhuǎn)基因植物；培養(yǎng)所述轉(zhuǎn)基因植物；和選擇具有増加的產(chǎn)量的那些轉(zhuǎn)基因植物。選擇出產(chǎn)生具有増加的產(chǎn)量的轉(zhuǎn)基因植物的基因以用于轉(zhuǎn)基因植物的進(jìn)ー步開發(fā)?？梢栽诒痉椒ㄖ惺褂玫幕虬?，例如但不限干，CAP (環(huán)化酶相關(guān)蛋白)基因、稻組蛋白脫こ酰酶I基因、E2Fc基因、BKI基因、BRII基因、ARL (Argos-Like)基因、bril (油菜素類固醇激素感受(brassinosteroid hormone perception))基因、FATB 基因、Pepino 基因、RGS (G 蛋白信號(hào)傳導(dǎo)調(diào)節(jié)劑(regulator of G protein signaling))基因、TIPl 基因、BB (Big Brother)基因、RHD2基因、INCW2基因、MNl基因、WAK2基因、WAK4基因、AP2基因等。附圖
簡(jiǎn)述圖I描述了胚胎特異性啟動(dòng)子在早期胚胎發(fā)育期間的表達(dá)譜。擬南芥屬物種胚胎 發(fā)育中的近似階段早期球狀=2天的授粉后天數(shù)(days after pollination,DAP)、心形=4DAP、魚雷形=6 DAP、手杖形=7 DAP、早期成熟胚胎=8 DAP。圖2描述了 REVOLUTA和非REVOLUTA HD-ZIPI11類轉(zhuǎn)錄因子的區(qū)域的氨基酸序列的比對(duì)。氨基酸序列的這個(gè)區(qū)域包含有在氨基酸序列中的特征性差異，所述特征性差異將HD-ZIPIII蛋白質(zhì)定義為屬于REVOLUTA或非REVOLUTA類蛋白質(zhì)。所述序列的加框部分標(biāo)明了定義非REVOLUTA HD-ZIPIII蛋白質(zhì)的氨基酸序列插入的位點(diǎn)。通過(guò)缺乏氨基酸序列插入來(lái)定義REVOLUTA蛋白質(zhì)。Athb-9 (擬南芥屬物種；SEQ ID NO 2) ；Athb-14 (擬南芥屬物種；SEQ ID NO 3) ；REV (擬南芥屬物種；SEQ ID NO 4) ；BnLfREV (歐洲油菜(Bassicanapis)；SEQ ID NO 5)；0sREVl (水稻(Oryza sativa)；SEQ ID NO 6)；ZmRLDl (玉蜀黍(Zeamayes)；SEQ ID NO 7)；0sREV2 (水稻；SEQ ID NO 8)；Athb-15 (擬南芥屬物種；SEQ ID NO 9);和 Athb-8 (擬南芥屬物種；SEQ ID NO :10)。發(fā)明詳述本發(fā)明提供了用于產(chǎn)生當(dāng)與野生型植物相比較時(shí)具有増加的種子大小和/或增加的種子數(shù)目的植物的方法和組合物。特別地，所述方法包括在植物的胚胎中過(guò)量表達(dá)參與植物生長(zhǎng)和/或發(fā)育的基因，其中轉(zhuǎn)基因的過(guò)量表達(dá)導(dǎo)致植物中的種子大小的増加和/或増加的種子數(shù)目。在ー個(gè)具體實(shí)施方案中，過(guò)量表達(dá)REVOLUTA (REV)基因。在本發(fā)明的方法中的REV轉(zhuǎn)基因處于啟動(dòng)子的調(diào)節(jié)下，所述啟動(dòng)子在胚胎發(fā)育期間起始表達(dá)，并且特別地在早期特異性胚胎發(fā)育期間起始表達(dá)。出乎意料地，在早期階段胚胎發(fā)育中REV轉(zhuǎn)基因的過(guò)量表達(dá)導(dǎo)致更大的和/或更多的種子。作為確定是否能夠通過(guò)參與植物生長(zhǎng)和/或發(fā)育的基因的過(guò)量表達(dá)來(lái)增加種子大小的第一種嘗試，將REV基因靶向種子，測(cè)試包含驅(qū)動(dòng)REV表達(dá)的胚胎特異性啟動(dòng)子的REV轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體。在擬南芥屬物種胚胎發(fā)育期間具有經(jīng)良好表征的表達(dá)譜的許多胚胎特異性啟動(dòng)子的可用性使得能夠制備轉(zhuǎn)基因植物，其中REV過(guò)量表達(dá)被靶向幾個(gè)不同但重疊的胚胎發(fā)育階段。將擬南芥屬物種REV轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體引入卡諾拉油菜中以用于測(cè)試。關(guān)于直接轉(zhuǎn)到卡諾拉油菜的根本原因是擬南芥屬物種基因組與卡諾拉油菜非常緊密相關(guān)，因此在擬南芥屬物種中測(cè)定的啟動(dòng)子的已知表達(dá)特征將可能延續(xù)至卡諾拉油菜，并且卡諾拉油菜是農(nóng)作物種類?？ㄖZ拉油菜中對(duì)種子大小的影響的證實(shí)將具有直接的農(nóng)業(yè)關(guān)聯(lián)性。在第ニ個(gè)例子中，擬南芥屬物種REV如本文所使用的，植物生長(zhǎng)和/或發(fā)育相關(guān)基因是這樣的基因，其在決定植物的生長(zhǎng)率、總體大小、組織大小或組織數(shù)目中起作用，或者在植物發(fā)育程序中起作用，導(dǎo)致組織身份和形態(tài)的決定。當(dāng)通過(guò)突變、過(guò)量表達(dá)、或表達(dá)的抑制來(lái)修飾其功能而導(dǎo)致改變的植物生長(zhǎng)率、總體植物大小、組織大小或數(shù)目、或改變的發(fā)育時(shí)，這樣的生長(zhǎng)和發(fā)育相關(guān)基因得到鑒定。植物和生長(zhǎng)相關(guān)基因可以通過(guò)許多機(jī)制發(fā)揮其效應(yīng)，其中ー些包括細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)、植物激素合成/分解途徑、對(duì)植物激素的敏感性、細(xì)胞壁生物合成、細(xì)胞身份決定等。通過(guò)過(guò)量表達(dá)或抑制分析，許多植物基因已顯示在生長(zhǎng)和/或發(fā)育中起作用。已知參與生長(zhǎng)和/或發(fā)育并且可以在本發(fā)明的方法中使用或測(cè)試的基因的一些但并非所有例子在下文中討論。擬南芥屬物種CAP基因編碼參與Ras-cAMP信號(hào)傳導(dǎo)和肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的調(diào)節(jié)的環(huán)化酶相關(guān)蛋白。由于表皮和葉肉細(xì)胞的延伸減少，CAP在糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)型啟動(dòng)子下的過(guò)量表達(dá)引起肌動(dòng)蛋白絲的喪失和葉大小的減少(Barrero等人，Annals ofBotany 91 :599_603，2003)。棉花中的蔗糖合酶基因表達(dá)的抑制導(dǎo)致減少的細(xì)胞纖維長(zhǎng)度以及更小和更少的纖維細(xì)胞(Yong-Ling Ruan等人，Plant Cell 15:952-964,2003)。使用ABA誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的稻組蛋白脫こ酰酶I基因在轉(zhuǎn)基因稻中的過(guò)量表達(dá)導(dǎo)致獲得與野生型相比較而言具有生長(zhǎng)率的増加以及異常的枝條和根組織發(fā)育的植物(In-Cheol Jang等人，Plant J. 33 :531_541，2003)。在擬南芥屬物種中經(jīng)由RNAi對(duì)于E2Fc的抑制增加了葉、分生組織和中柱鞘細(xì)胞中的増殖活性。器官中的細(xì)胞比野生型更小但更眾多，并且在葉中存在減少的倍性水平(del Pozo等人，Plant Cell 18 :2224_2235，2006)。經(jīng)由RNAi對(duì)于BKI基因的抑制導(dǎo)致具有増加的下胚軸長(zhǎng)度的幼苗，并且BKI的過(guò)量表達(dá)產(chǎn)生矮化植物(Xuelu和Chory，Science 313:1118-1122,2006)。表達(dá)部分地組成性的類固醇受體BRIl的轉(zhuǎn)基因植物具有更長(zhǎng)的下胚軸(Wang等人，Dev. Cell 8 :855_865，2005)。擬南芥屬物種 中Argos-Like (ARL)的抑制產(chǎn)生更小的子葉、葉和其他側(cè)生器官，而過(guò)量表達(dá)產(chǎn)生相反的效應(yīng)。器官大小的變化可以歸因于細(xì)胞大小而不是細(xì)胞數(shù)目(Hu等人，Plant J. 47:1-9，
2006)ο對(duì)于具有導(dǎo)致改變的生長(zhǎng)和/或發(fā)育表型的突變的植物所進(jìn)行的分析已鑒定出了許多在植物生長(zhǎng)和發(fā)育中起作用的基因。影響油菜素類固醇激素感受bril-5的突變導(dǎo)致矮化植物(Wang等人，Dev. Cell 8 :855_865，2005)。在編碼?；??；d體蛋白硫酯酶的擬南芥屬物種FATB基因中的T-DNA插入(敲除)導(dǎo)致減少的生長(zhǎng)率、減少的鮮重和低種子活力(Bonaventure 等人，Plant Cell 15 1020-1033, 2003)o Pepino (推定的抗-憐酸酶)中的功能喪失突變?cè)谥l頂端分生組織處顯示出腫瘤樣細(xì)胞増殖并且產(chǎn)生多余的異常葉(Haberer 等人，Dev. Genes Evol. 212 :542_550，2002)。擬南芥屬物種 RGS 基因(G 蛋白信號(hào)傳導(dǎo)調(diào)節(jié)劑)具有G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)的結(jié)構(gòu)并且包含RGS盒。RGS蛋白質(zhì)加速Ga亞基的失活并因此降低GPCR信號(hào)傳導(dǎo)。無(wú)效rgs突變體在黑暗中生長(zhǎng)時(shí)在下胚軸中具有增加的細(xì)胞延長(zhǎng)，和在光中生長(zhǎng)時(shí)在根中具有增加的細(xì)胞產(chǎn)生(Chen等人，Science301 :1728-1731, 2003)。擬南芥屬物種TIPl基因在根毛發(fā)育中以及還在細(xì)胞生長(zhǎng)中起作用。tipl-2突變體具有更小的蓮座型葉叢、減少的高度和更短的節(jié)間(Ryan等人，NewPhytol. 138 :49-58,1998 ;和 Hemsley 等人，Plant Cell 17 :2554_2563，2005)。產(chǎn)生極少或不產(chǎn)生Big Brother mRNA的Big Brother (BB)基因的突變體(染色體重排或T-DNA插入)發(fā)育出更大的花器官、更多的花生物量和更粗的莖。相反地，Big Brother的過(guò)量表達(dá)導(dǎo)致更小的花器官、更少的花生物量、更細(xì)的莖和減少的葉大小。BB可以改變細(xì)胞數(shù)目(Disch等人，Curr. Biol. 16 :272_279，2006)。RHD2基因編碼對(duì)于活性氧種類在根毛中的積聚和鈣通道的隨后活化而言重要的NADPH氧化酶。rhd2突變體在根的尖端生長(zhǎng)細(xì)胞的細(xì)胞擴(kuò)展方面具有缺陷(Foreman等人,Nature 422:442-446,2003)。玉米中的微小突變引起由INCM2基因表達(dá)的細(xì)胞壁轉(zhuǎn)化酶的喪失。mnl突變體的細(xì)胞比野生型更小，和mnl種子突變體僅具有野生型種子的胚乳重量的20%。擴(kuò)展可以在mnl胚乳的周圍層的細(xì)胞中受到損害，并且可以導(dǎo)致這些細(xì)胞的減少的有絲分裂活性(Vilhar等人，Plant Physiol. 129 :23-30,
2002)。WAK2的T-DNA插入突變體，wak2_l，在根中具有減少的細(xì)胞延長(zhǎng)。WAK2可以通過(guò)調(diào)節(jié)液泡的轉(zhuǎn)化酶活性來(lái)控制細(xì)胞擴(kuò)展。在植物中WAK2或WAK4的可誘導(dǎo)反義的表達(dá)阻止了細(xì)胞延長(zhǎng)并產(chǎn)生矮化植物(Wagner 和 Kohorn，Plant Cell 13 :303_318，2001 ;Lally 等人，Plant Celll3 :1317-1331,2001 ;和 Kohorn 等人，Plant. J. 46 :307_316，2006)。擬南芥屬物種基因AP2在花器官身份中和在花分生組織身份的建立中起作用。與野生型相比較，AP2中的功能喪失突變產(chǎn)生增加的種子質(zhì)量(Masa-Ohto等人，Proc. Nat' I. Acad. Sci. USA 102 :3123-3128，2005)。teb突變體具有短小的根、鋸齒狀的葉和扁化。它們顯示出在細(xì)胞分裂方面的缺陷，這可能是由于在G2/M細(xì)胞周期進(jìn)展方面的缺陷而引起的(Inagaki等人，Plant Cell 18:879-892,2006)。術(shù)語(yǔ)“生長(zhǎng)和/或發(fā)育基因”或“生長(zhǎng)和/或發(fā)育轉(zhuǎn)基因”在本文中用于指任何這樣的多核苷酸序列，所述多核苷酸序列編碼或促進(jìn)由該基因編碼的核苷酸或蛋白質(zhì)的表達(dá)和/或產(chǎn)生。因此，術(shù)語(yǔ)“生長(zhǎng)和/或發(fā)育基因”或“生長(zhǎng)和/或發(fā)育轉(zhuǎn)基因”可以包括位于核苷酸和/或蛋白質(zhì)編碼序列側(cè)翼的序列。例如，所述序列可以包括那些核苷酸序列，所述核苷酸序列為蛋白質(zhì)編碼序列(外顯子)、間插序列(內(nèi)含子)、包含對(duì)于該基因正常表達(dá)而言所需的序列的側(cè)翼5'和3' DNA區(qū)域(S卩，分別為啟動(dòng)子和polyA添加區(qū)，以及任何增強(qiáng)子序列)。術(shù)語(yǔ)“生長(zhǎng)和/或發(fā)育蛋白質(zhì)”、“生長(zhǎng)和/或發(fā)育同系物”或“生長(zhǎng)和/或發(fā)育相關(guān)直向同源物”在本文中用于指這樣的蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)具有調(diào)節(jié)植物的生長(zhǎng)率、總體大小、組織大小或組織數(shù)目或者調(diào)節(jié)植物發(fā)育程序(其導(dǎo)致組織身份和形態(tài)的決定)的能力(當(dāng)在本發(fā)明方法的實(shí)踐中使用吋)，并且具有與對(duì)于該基因而言的氨基酸序列有著至少約70%同一性、更通常地至少約75%同一性、和更通常地至少約80%同一性的氨基酸序列。如本文所使用的，“胚胎特異性基因”是在植物中的胚胎發(fā)育期間優(yōu)先表達(dá)的基因。對(duì)本公開內(nèi)容而言，胚胎發(fā)育從合子中的第一次細(xì)胞分裂開始，并繼續(xù)至胚胎發(fā)育的晚期(特征在于成熟、干燥、休眠)，并且以產(chǎn)生成熟且干燥的種子作為結(jié)束。胚胎特異性基因可以進(jìn)一歩分類為“早期特異性的”和“晩期特異性的”。早期特異性基因是直至胚胎形態(tài)發(fā)生結(jié)束時(shí)在胚胎中表達(dá)的那些基因。晩期特異性基因是在從成熟直到產(chǎn)生成熟且干燥的種子這ー過(guò)程中表達(dá)的那些基因。在早期胚胎發(fā)育期間起始表達(dá)并且為早期特異性的胚胎特異性基因的例子呈現(xiàn)于圖I中。“異源序列”是來(lái)源于不同物種的寡核苷酸序列，或者如果來(lái)自相同物種，則由其最初形式在實(shí)質(zhì)上進(jìn)行了修飾。例如，與結(jié)構(gòu)基因有效地連接的異源啟動(dòng)子來(lái)自與該結(jié)構(gòu)基因所源自的物種不同的物種，或者如果來(lái)自相同物種，則由其最初形式在實(shí)質(zhì)上進(jìn)行了修飾。術(shù)語(yǔ)“載體”指通常為雙鏈的DNA片段，其可以在其內(nèi)插入外源DNA片段。載體或復(fù)制子可以例如具有質(zhì)?；虿《緛?lái)源。載體包含有助于載體在宿主細(xì)胞中自主復(fù)制的“復(fù)制子”多核苷酸序列。在本公開內(nèi)容的情況下，術(shù)語(yǔ)“復(fù)制子”還包括靶向或者以其他方式促進(jìn)載體序列重組入宿主染色體中的多核苷酸序列區(qū)域。此外，雖然可以在最初時(shí)將外源DNA插入到例如DNA病毒載體中吋，但是將病毒載體DNA轉(zhuǎn)化到宿主細(xì)胞中可以導(dǎo)致病毒DNA轉(zhuǎn)化成病毒RNA載體分子。外源DNA被定義為異源DNA，其是在宿主細(xì)胞中未天然發(fā)現(xiàn)的DNA，其例如復(fù)制載體分子、編碼可選擇或可篩選標(biāo)記或者轉(zhuǎn)基因。載體用于將外源或異源DNA運(yùn)輸?shù)胶线m的宿主細(xì)胞內(nèi)。一旦在宿主細(xì)胞中，載體就可以獨(dú)立于宿主染色體DNA或與宿主染色體DNA同時(shí)進(jìn)行復(fù)制，并且可以產(chǎn)生載體及其插入的DNA的幾個(gè)拷貝。備選地，載體可以將外源或異源DNA靶向插入至宿主染色體中。此外，載體還可以包含必需元件，所述元件允許所插入的DNA轉(zhuǎn)錄成mRNA分子，或者以其他方式引起所插入的DNA復(fù)制成多個(gè)拷貝的RNA。某些表達(dá)載體另外還包含與所插入的DNA鄰近的序列元件，其允許mRNA翻譯成蛋白質(zhì)分子。因此，可以快速合成許多由所插入的DNA編碼的mRNA和多肽分子。 術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)基因載體”指包含所插入的DNA區(qū)段(即“轉(zhuǎn)基因”)的載體，所述DNA區(qū)段在宿主細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄成mRNA或復(fù)制為RNA。術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)基因”不僅指所插入的DNA的被轉(zhuǎn)化成RNA的那個(gè)部分，還指載體的對(duì)于RNA的轉(zhuǎn)錄或復(fù)制而言所必需的那些部分。此外，轉(zhuǎn)基因不一定包含這樣的多核苷酸序列，所述多核苷酸序列包含能夠產(chǎn)生蛋白質(zhì)的開放讀碼框。術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞”、“轉(zhuǎn)化的”和“轉(zhuǎn)化”指將DNA引入細(xì)胞中。該細(xì)胞稱為“宿主細(xì)胞”，并且它可以是原核或真核細(xì)胞。典型的原核宿主細(xì)胞包括大腸桿菌(E. coli)的各種菌株。典型的真核宿主細(xì)胞是植物細(xì)胞(例如，卡諾拉油菜、棉花、亞麻薺、苜蓿、大豆、稻、燕麥、小麥、大麥或玉米細(xì)胞等)、酵母細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞或動(dòng)物細(xì)胞。引入的DNA通常為包含插入的DNA片段的載體形式。引入的DNA序列可以來(lái)自與宿主細(xì)胞相同的物種或者來(lái)自與宿主細(xì)胞不同的物種，或者它可以是包含一些外源DNA和一些源自宿主物種的DNA的雜合DNA序列。術(shù)語(yǔ)“植物”包括全植物、植物器官(例如，葉、莖、花、根等)、種子和植物細(xì)胞(包括組織培養(yǎng)細(xì)胞)及其后代?？梢栽诒景l(fā)明方法中使用的植物類別一般與順應(yīng)于轉(zhuǎn)化技術(shù)的高等植物類別ー樣廣泛，包括單子葉和雙子葉植物，以及某些低等植物如藻類。它包括各種倍性水平的植物，包括多倍體、二倍體和單倍體?！爱愒葱蛄小笔莵?lái)源于外來(lái)物種的序列，或者如果來(lái)自相同物種，則由其最初形式在實(shí)質(zhì)上進(jìn)行了修飾。例如，與結(jié)構(gòu)基因有效地連接的異源啟動(dòng)子來(lái)自與該結(jié)構(gòu)基因所源自的物種不同的物種，或者如果來(lái)自相同物種，則由其最初形式在實(shí)質(zhì)上進(jìn)行了修飾。術(shù)語(yǔ)“REVOLUTA基因”或“REVOLUTA轉(zhuǎn)基因”在本文中用于指編碼或促進(jìn)REVOLUTA蛋白質(zhì)的表達(dá)和/或產(chǎn)生的任何多核苷酸序列。因此，術(shù)語(yǔ)“REVOLUTA基因”或“REVOLUTA轉(zhuǎn)基因”可以包括位于REVOLUTA蛋白質(zhì)編碼序列側(cè)翼的序列。例如，所述序列可以包括那些核苷酸序列，所述核苷酸序列為蛋白質(zhì)編碼序列(外顯子)、間插序列(內(nèi)含子)、包含對(duì)于REVOLUTA基因正常表達(dá)而言所需的序列的側(cè)翼5'和3' DNA區(qū)域(B卩，分別為啟動(dòng)子和PoIyA添加區(qū)，和任何增強(qiáng)子序列)。術(shù)語(yǔ)“REVOLUTA蛋白質(zhì)”、“REVOLUTA同系物”或“REVOLUTA直向同源物”在本文中用于指這樣的蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)具有調(diào)節(jié)植物細(xì)胞分裂的能力(當(dāng)在本發(fā)明方法的實(shí)踐中使用吋)，并且具有與在WO 01/33944(通過(guò)提及而整體合并入本文)中所描述的REVOLUTA的氨基酸序列有著至少約70%同一性、更通常地至少約75%同一性、和更通常地至少約80%同一性的氨基酸序列。備選地，術(shù)語(yǔ)“REVOLUTA蛋白質(zhì)”、“REVOLUTA同系物”或“REVOLUTA直向同源物”在本文中用于指被鑒定為與HD-ZIPIII類別的植物轉(zhuǎn)錄因子的非REVOLUTA成員不同的REVOLUTA蛋白質(zhì)。HD-ZIPIII類別的蛋白質(zhì)的REVOLUTA成員的特征在于，在TO 01/33944中描述且如圖2中所示的REVOLUTA氨基酸序列的氨基酸殘基146和147之間缺乏或不存在特征性的氨基酸序列插入，其存在于非REVOLUTA HD-ZIPIII蛋白質(zhì)中。在圖2中，命名為athb-8、athb-9、athb-14和athb-15的來(lái)自擬南芥的同源異型框轉(zhuǎn)錄因子是非REVOLUTAHD-ZIPIII蛋白質(zhì)，并且全部在REVOLUTA氨基酸序列的氨基酸殘基146和147之間具有特征性的氨基酸序列插入。圖2中的5個(gè)REVOLUTA序列全部在REVOLUTA氨基酸序列中的這 個(gè)位置處缺乏氨基酸插入。這個(gè)氨基酸序列插入的缺乏是REVOLUTA蛋白質(zhì)的區(qū)別性和定義性的特征。術(shù)語(yǔ)“同一性百分比”是指當(dāng)使用計(jì)算機(jī)程序例如下文鑒定的程序來(lái)并排比對(duì)2個(gè)氨基酸序列或2個(gè)核酸序列時(shí)，占據(jù)相同的相對(duì)位置的氨基酸或核苷酸的百分比。術(shù)語(yǔ)“相似性百分比”是2個(gè)所比較的蛋白質(zhì)序列的親緣關(guān)系程度的統(tǒng)計(jì)學(xué)量度。相似性百分比通過(guò)計(jì)算機(jī)程序來(lái)進(jìn)行計(jì)算，所述計(jì)算機(jī)程序基于化學(xué)相似性(例如，所比較的氨基酸是否是酸性的、堿性的、親水性的、芳香族的等)和/或進(jìn)化距離(如通過(guò)對(duì)于使編碼所比較的氨基酸對(duì)的ー個(gè)成員的密碼子轉(zhuǎn)變成編碼該對(duì)的另一個(gè)成員的密碼子而言所需的最低數(shù)目的堿基對(duì)改變所測(cè)量的)對(duì)每個(gè)所比較的氨基酸對(duì)分派ー個(gè)數(shù)值。在已通過(guò)迭代比較所有可能的比對(duì)而憑經(jīng)驗(yàn)進(jìn)行2個(gè)序列的最佳擬合比對(duì)后，進(jìn)行計(jì)算(參見例如，Henikoff等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 :10915-10919，1992)。多核苷酸序列的“基本同一'丨生(substantial identity)”這ー術(shù)語(yǔ)是指，當(dāng)使用下文描述的程序并使用標(biāo)準(zhǔn)參數(shù)與參考序列相比較時(shí)，多核苷酸包含具有至少60%序列同一性、通常地至少70%同一性、更通常地至少80%同一性和最通常地至少90%同一性的序列。技術(shù)人員應(yīng)認(rèn)識(shí)到，這些值可以進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整以確定由2個(gè)核苷酸序列編碼的蛋白質(zhì)的相應(yīng)同一性，其中考慮了密碼子簡(jiǎn)并性、氨基酸相似性、讀碼框定位等。氨基酸序列同一性可以例如以下述方式進(jìn)行測(cè)定。由生長(zhǎng)和/或發(fā)育相關(guān)基因例如REVOLUTA編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列的部分，可以用于搜索核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)，例如GenBanka 數(shù)據(jù)庫(kù)，其中使用程序 BLASTP 版本 2. O. 9(Atschul 等人，Nucl. Acids Res. 25 3389-3402,1997)。2個(gè)(或更多)多核苷酸或多肽之間的序列比較通常通過(guò)在“比較窗”上比較2個(gè)序列的序列來(lái)進(jìn)行，以鑒定并比較序列相似性的局部區(qū)域。如本文所使用的，“比較窗”指至少約20個(gè)鄰接位置、通常地約50-約200個(gè)鄰接位置、更通常地約100-約150個(gè)鄰接位置的區(qū)段，其中在2個(gè)序列進(jìn)行最佳比對(duì)后，可以將序列與具有相同數(shù)目的鄰接位置的參考序列相比較。用于比較的序列最佳比對(duì)可以通過(guò)下述方式來(lái)進(jìn)行局部同一性或相似性算法例如在 Smith 等人，Adv. Appl. Math. 2 :482,1981 中描述的那些；Needleman 等人，J. Mol.Biol. 48 :443-453,1970 的同源性比對(duì)算法；Pearson 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA85 :2444-2448,1988的相似性搜索法；這些算法的計(jì)算機(jī)化實(shí)現(xiàn)(Wisconsin GeneticsSoftware Package, Genetics Computer Group,575Science Drive, Madison, WI 中的 GAP、BESTFIT、FASTA 和 TFASTA);或目視檢查。有用的算法的ー個(gè)例子是PILEUP。PILEUP使用漸進(jìn)的成對(duì)比對(duì)而由ー組相關(guān)序列產(chǎn)生多重序列比對(duì)，以顯示相互關(guān)系和序列同一性百分比。它還繪制顯示出用于產(chǎn)生比對(duì)的聚類關(guān)系的樹或樹狀圖。PILEUP使用簡(jiǎn)化的Feng等人，J. Mol. Evol. 35 =351-360,1987的漸進(jìn)比對(duì)方法。所使用的方法類似于由Higgins等人，CABIOS 5 :151-153，1989描述的方法。該程序可以比對(duì)高達(dá)300個(gè)序列，每個(gè)序列的最大長(zhǎng)度為5，000個(gè)核苷酸或氨基酸。多重比對(duì)過(guò)程從2個(gè)最相關(guān)序列的成對(duì)比對(duì)開始。這個(gè)聚簇(cluster)隨后與下一個(gè)最相關(guān)序列或經(jīng)比對(duì)的序列的聚簇進(jìn)行比對(duì)。2個(gè)序列聚簇可以通過(guò)2個(gè)獨(dú)個(gè)序列的成對(duì)比對(duì)的簡(jiǎn)單延伸來(lái)進(jìn)行比對(duì)。最終比對(duì)通過(guò)一系列漸進(jìn)的成對(duì)比對(duì)來(lái)完成。該程序通過(guò)指定序列比較區(qū)域的特定序列及其核苷酸或氨基酸坐標(biāo)(coordinate)和通過(guò)指定程序參數(shù)來(lái)運(yùn)行。例如，可以將參考序列與其他測(cè)試序列進(jìn)行比較以測(cè)定序列同一性百分比 關(guān)系，使用下述參數(shù)缺省缺ロ權(quán)重(3. 00)、缺省缺ロ長(zhǎng)度權(quán)重(O. 10)、和加權(quán)末端缺ロ。適合于測(cè)定序列同一性和序列相似性百分比的算法的另ー個(gè)例子是BLAST算法，其在Altschul等人，J. Mol. Biol. 215 =403-410,1990中得到描述。用于進(jìn)行BLAST分析的軟件可通過(guò)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information)公開獲得。這種算法包括，首先通過(guò)在查詢序列中鑒定長(zhǎng)度W的短字(word)來(lái)鑒定高得分序列對(duì)(HSPs)，當(dāng)與數(shù)據(jù)庫(kù)序列中相同長(zhǎng)度的字進(jìn)行比對(duì)時(shí)，所述HSPs匹配或滿足某一正值閾值得分 T。T 稱為鄰近字得分閾值(neighborhood word score threshold) (Altschul等人，同上)。這些最初鄰近字的命中用作起始搜索的種子，以找到包含它們的更長(zhǎng)HSPs。隨后，字命中(word hits)沿著每個(gè)序列在2個(gè)方向上進(jìn)行延伸，遠(yuǎn)至可以增加累積比對(duì)得分。在下列情況時(shí)，停止字命中在每個(gè)方向上的延伸累積比對(duì)得分比其達(dá)到的最大值減少X量；由于ー個(gè)或多個(gè)負(fù)得分殘基比對(duì)的積聚，累積得分變成零或零以下；或達(dá)到任一序列的末端。BLAST算法參數(shù)W、T和X決定比對(duì)的靈敏度和速度。BLAST程序使用使用下列作為缺省值字長(zhǎng)(W)為11、BL0SUM62評(píng)分矩陣(參見，Henikoff等人，Proc. Natl. Acad. Sci.USA 89 :10915-10919,1992)比對(duì)(B)為 50、期望值(E)為 10、M=5、N=_4 以及 2 條鏈的比較。除了計(jì)算序列同一性百分比外，BLAST算法還進(jìn)行兩個(gè)序列之間的相似性的統(tǒng)計(jì)分析(參見，例如 Karlin 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877,1993)。由 BLAST算法提供的相似性的ー種量度是最小加和概率(P(N))，它提供了對(duì)兩個(gè)核苷酸或氨基酸序列之間的匹配偶然發(fā)生的概率指示。例如，如果比較測(cè)試中的最小加和概率小于約O. I、更優(yōu)選地小于約O. 01、和最優(yōu)選地小于約O. 001，那么核酸被視為與參考序列類似。用于序列比對(duì)和序列相似性分析的另外方法和算法是技術(shù)人員眾所周知的。在所插入的多核苷酸序列進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和翻譯以產(chǎn)生功能性多肽的情況下，技術(shù)人員會(huì)認(rèn)識(shí)到，由于密碼子簡(jiǎn)并性，許多多核苷酸序列將編碼相同的多肽。這些變體特別地由術(shù)語(yǔ)“生長(zhǎng)和/或發(fā)育基因”和“生長(zhǎng)和/或發(fā)育轉(zhuǎn)基因”，以及具體地由“REVOLUTA基因”和“REVOLUTA轉(zhuǎn)基因”所包括。此外，這些術(shù)語(yǔ)特別地包括那些全長(zhǎng)序列，所述序列與基因序列基本上同一并且編碼保留了該基因產(chǎn)物例如REVOLUTA的功能的蛋白質(zhì)。如果如上所述就最大一致進(jìn)行比對(duì)時(shí)，兩個(gè)序列中的核苷酸或氨基酸殘基的序列分別相同時(shí)，那么這兩個(gè)核酸序列或多核苷酸被說(shuō)成是“同一的”。術(shù)語(yǔ)“與……互補(bǔ)”在本文中用于指，互補(bǔ)序列與參考多核苷酸序列的全部或部分是同一的。生長(zhǎng)和/或發(fā)育相關(guān)基因和生長(zhǎng)和/或發(fā)育相關(guān)蛋白質(zhì)，例如REVOLUTA基因和REVOLUTA蛋白質(zhì)序列的氨基酸序列中的變異和改變?cè)赪O 01/33944中得到描述，所述專利通過(guò)提及而合并入本文。目的基因例如REVOLUTA基因、多核苷酸或多核苷酸序列可以從任何植物物種中進(jìn)行分離或獲得。在本發(fā)明的ー個(gè)具體實(shí)施方案中，所使用的REVOLUTA基因序列是來(lái)自擬南芥的那種，但也可以使用來(lái)自其他感興趣物種的REVOLUTA基因。例如，來(lái)自玉米(玉蜀黍(Zea mays))的REVOLUTA的核苷酸序列和氨基酸序列在WO 2004/063379(通過(guò)提及而整體合并入本文)中得到描述。術(shù)語(yǔ)“生物學(xué)活性”、“生物學(xué)上具有活性的”、“活性”、“具有活性的”、“生物學(xué)功能”、“ REV生物學(xué)活性”和“功能上具有活性的”指目的蛋白質(zhì)例如REVOLUTA蛋白質(zhì)進(jìn)行ニ聚化(或以其他方式裝配成蛋白質(zhì)寡聚體)的能力，或者調(diào)節(jié)或以其他方式影響天然野生型 (例如，內(nèi)源的)REVOLUTA蛋白質(zhì)ニ聚化的能力。然而，所述術(shù)語(yǔ)還意欲包括目的蛋白質(zhì)例如REVOLUTA蛋白質(zhì)與其他分子結(jié)合和/或相互作用的能力，所述其他分子包括例如但不限于，包含由該蛋白質(zhì)例如REVOLUTA蛋白質(zhì)所識(shí)別的在啟動(dòng)子區(qū)中的特異性核苷酸序列的DNA，所述結(jié)合和/或相互作用事件介導(dǎo)植物細(xì)胞分裂并最終賦予表型；或者包括調(diào)節(jié)或以其他方式影響其他分子與天然野生型蛋白質(zhì)結(jié)合和/或相互作用的能力，所述結(jié)合和/或相互作用事件介導(dǎo)植物細(xì)胞分裂并最終賦予與該目的基因相關(guān)的表型。如本文所使用的，REV表型意指由REV核酸或蛋白質(zhì)所賦予的表型，并且特別包括其中展示出種子大小或種子數(shù)目的特性。通常，REV表型通過(guò)檢查在早期特異性胚胎發(fā)育期間過(guò)量表達(dá)REV的植物來(lái)確定，其中可以將來(lái)自所述植物的種子數(shù)目和大小與在親本或野生型植物的相應(yīng)組織中的種子數(shù)目和大小進(jìn)行比較。在具有代表性的數(shù)目的植物群體內(nèi)，具有REV表型的植物在種子數(shù)目和/或大小方面具有統(tǒng)計(jì)上顯著的變化。適合于與植物生長(zhǎng)和/或發(fā)育相關(guān)基因有效地連接并使用所描述的本發(fā)明方法表達(dá)的啟動(dòng)子通常在胚胎中具有更大的表達(dá)，和在其他植物組織中具有更低的表達(dá)或無(wú)表達(dá)。特別感興趣的是在早期特異性胚胎發(fā)育中起始表達(dá)的那些啟動(dòng)子序列。早期特異性啟動(dòng)子是在擬南芥屬物種中在授粉后第7天(手杖形)前或者在另ー個(gè)植物物種中的等價(jià)階段起始蛋白質(zhì)表達(dá)的啟動(dòng)子。特別感興趣的啟動(dòng)子序列的例子包括用于氨基酸通透酶基因(APPl)的啟動(dòng)子(例如，來(lái)自擬南芥的AAPl啟動(dòng)子)(Hirner等人，Plant J. 14 =535-544,1998),用于油酸12-輕化酶去飽和酶基因的啟動(dòng)子(例如,來(lái)自Lesquerella fendleri的被命名為L(zhǎng)FAH12的啟動(dòng)子)(Broun等人，Plant J. 13 :201_210，1998)，用于2S2白蛋白基因的啟動(dòng)子(例如，來(lái)自擬南芥的2S2啟動(dòng)子)(Guerche等人，Plant cell 2 =469-478,1990),脂肪酸延長(zhǎng)酶基因啟動(dòng)子(FAEl)(例如，來(lái)自擬南芥的FAEl啟動(dòng)子)(Ros sak等人，PlantMol. Biol. 46 :717-715, 2001)，和葉狀子葉基因啟動(dòng)子(LEC2)(例如，來(lái)自擬南芥的LEC2啟動(dòng)子)(Kroj等人，Development 130 :6065_6073，2003)。其他感興趣的早期胚胎特異性啟動(dòng)子包括但不限于，Seedstick (Pinyopich 等人,Nature 424 :85-88, 2003),Fbp7 和 Fbpll(矮牽牛 Seedstick) (Colombo 等人，Plant Cell. 9 :703-715,1997), Banyuls (Devic 等A, Plant J. 19 :387-398,1999)，agl_15 和 agl-18 (Lehti-Shiu 等人，Plant Mol. Biol. 58 89-107,2005),Phel (Kohler 等人，Genes Develop. 17 :1540-1553,2003),Perl (Haslekas等人，Plant Mol Biol. 36 :833-845,1998 ；Haslekas 等人，Plant Mol. Biol. 53 :313-326,
2003)，embl75 (Cushing 等人，Planta 221 :424-436, 2005), Lll (Kwong 等人，Plant Cell15 :5-18,2003), Lecl (Lotan 等人，Cell 93 :1195-1205,1998), Fusca3 (Kroj 等人，Development 130 :6065-6073,2003), ttl2 (Debeaujon 等人，Plant Cell 13:853-871,2001)，ttl6 (Nesi 等人，Plant Cell 14 :2463-2479,2002), A-RZf (Zou 和 Taylor，Gene196 :291-295,1997)，TtGl(Walker 等人，Plant Cell 11 :1337-1350，1999 ;Tsuchiya 等人，Plant J. 37 :73-81,2004),Ttl (Sagasser 等人，Genes Dev. 16 :138-149，2002)，TT8 (Nesi等人，Plant Cell 12 :1863-1878，2000)，Gea_8 (胡蘿卜)(Lin 和 Zimmerman, J. Exp. Botany50 :1139-1147,1999), Knox (稻)(Postma-Haarsma 等人，Plant Mol. Biol. 39 :257-271,1999),OleosinCPlant 等人，Plant Mol. Biol. 25 :193-205,1994 ；Keddie 等人，Plant Mol.Biol. 24 :327-340,1994)，ABI3 (Ng 等人，Plant Mol. Biol. 54 :25-38, 2004 ；Parcy 等人，Plant Cell 6 :1567-1582，1994)，等等。
適合于在本發(fā)明中使用的啟動(dòng)子可以來(lái)自與待轉(zhuǎn)化的植物相同的物種或可以來(lái)自異源物種。此外，啟動(dòng)子可以來(lái)自與對(duì)于待使用的REV轉(zhuǎn)基因而言相同的物種，或者它可以來(lái)自異源物種。在本發(fā)明的方法中使用的啟動(dòng)子還可以包括嵌合啟動(dòng)子，其可以包括與上述那些中的ー種或多種具有相同的表達(dá)譜的啟動(dòng)子組合。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，將來(lái)自擬南芥的AAPl基因啟動(dòng)子與擬南芥REV基因相組合，并用于構(gòu)建轉(zhuǎn)基因卡諾拉油菜(歐洲油菜)。此外，在本發(fā)明的另外ー個(gè)實(shí)施方案中，來(lái)自Lesquerella fendleri的油酸12-羥化酶去飽和酶基因啟動(dòng)子LFAH12與擬南芥REV基因有效地連接，并用于構(gòu)建轉(zhuǎn)基因卡諾拉油菜(歐洲油菜)。上述轉(zhuǎn)基因植物中的每ー種顯示了本發(fā)明方法的REV表型特征，其中REV在早期胚胎發(fā)育中過(guò)量表達(dá)，從而導(dǎo)致増加的種子大小和/或種子數(shù)目。應(yīng)當(dāng)指出，上述的早期特異性啟動(dòng)子僅僅是可以在本發(fā)明的方法中使用的代表性啟動(dòng)子。用于鑒定和表征植物基因組DNA中的啟動(dòng)子區(qū)的方法是技術(shù)人員眾所周知的，并且包括例如，由 Jordano 等人，Plant Cell I :855-866,1989 ；Bustos 等人，Plant Cell
I:839-854,1989 ；Green 等人，EMBO J. 7 :4035-4044,1988 ；Meier 等人，Plant Cell 3 309-316，1991 ;和 Zhang 等人，Plant Physiol. 110 :1069-1079,1996 描述的那些。在早期胚中過(guò)量表達(dá)REV的轉(zhuǎn)基因植物可以例如通過(guò)將轉(zhuǎn)基因載體(例如，質(zhì)粒、病毒等)轉(zhuǎn)移至植物中來(lái)獲得，所述轉(zhuǎn)基因載體編碼與編碼REVOLUTA的基因有效地連接的早期特異性胚胎啟動(dòng)子。通常，當(dāng)載體是質(zhì)粒時(shí)，載體還包括選擇標(biāo)記基因，例如編碼對(duì)于卡那霉素的抗性的卡那霉素基因。如Hoeckeme等人(Nature 303 :179-181,1983)中所描述的，最常見的植物轉(zhuǎn)化方法通過(guò)下列方式來(lái)進(jìn)行將靶轉(zhuǎn)基因克隆到植物轉(zhuǎn)化載體中，隨后將所述植物轉(zhuǎn)化載體轉(zhuǎn)化到包含輔助Ti-質(zhì)粒的根瘤土壤桿菌(Agrobacteriumtumifaciens)中。另外的方法例如描述在 Maloney 等人，Plant Cell Reports 8 :238,1989 中。如由 An 等人(Plant Physiol. 81 :301-305,1986 ；Hooykaas,Plant Mol. Biol. 13 327-336，1989)所描述的，可以將包含轉(zhuǎn)基因載體的土壤桿菌細(xì)胞與待轉(zhuǎn)化的植物的葉切片一起溫育。如上所述，培養(yǎng)的植物宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)化通常通過(guò)根瘤土壤桿菌來(lái)完成。通常使用磷酸鈣法來(lái)轉(zhuǎn)化不具有堅(jiān)硬的細(xì)胞膜屏障的宿主細(xì)胞的培養(yǎng)物，所述磷酸鈣法由Graham等人(Virology 52 :546,1978)最初描述，并如 Sambrook等人(Molecular Cloning A Laboratory Manual (第 2 版，1989 Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York,NY )中所述進(jìn)行修改。然而，也可以使用用于將DNA引入細(xì)胞內(nèi)的其他方法，例如Po I ybrene(Kawai 等人，Mol. Cell. Biol. 4 :1172,1984)，原生質(zhì)體融合(Schaffner, Proc. Natl. Acad.Sci. USA 77 2163,1980)，電穿孔(Neumann 等人，EMBO J. I :841，1982)，和直接顯微注射到核內(nèi)(Capecchi，Cell 22:479,1980)。可以通過(guò)選擇標(biāo)記經(jīng)由在培養(yǎng)基上生長(zhǎng)細(xì)胞來(lái)選擇出經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物愈傷組織，所述培養(yǎng)基包含例如卡那霉素以及合適量的植物激素例如萘こ酸和芐基腺嘌呤以用于愈傷組織和幼芽誘導(dǎo)。隨后，可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的技術(shù)來(lái)再生植物細(xì)胞，并將所得到的植物轉(zhuǎn)移至土壌中。除了上述方法外，大量關(guān)于將經(jīng)克隆的DNA轉(zhuǎn)移到廣泛多樣的植物物種內(nèi)的方法是本領(lǐng)域眾所周知的，所述植物物種包括裸子植物、被子植物、單子葉植物和雙子葉植物(參見例如 Glick 和 Thompson,編輯，Methods in Plant Molecular Biology andBiotechnology, CRC Press, Boca Raton, Florida, 1993 ；Vasil, Plant Mol. Biol. ,25 925-937，1994 ;和 Komai 等人，Current Opinions Plant Biol. I : 161-165，1998 (綜合性 的綜述)；Loopstra 等人，Plant Mol. Biol. 15 1-9,1990 ;和 Brasileiro 等人，Plant Mol.Biol. 17 :441-452,1990 (樹的轉(zhuǎn)化)；Eimert 等人，Plant Mol. Biol. 19 :485-490,1992(蕓苔的轉(zhuǎn)化)；Hiei 等人，Plant J. 6 :271-282,1994 ；Hiei 等人，Plant Mol. Biol. 35 205-218，1997 ；Chan 等人，Plant Mol. Biol. 22 :491-506,1993 ;美國(guó)專利號(hào) 5，516，668 和5，824，857 (稻的轉(zhuǎn)化)；以及美國(guó)專利號(hào)5，955，362 (小麥的轉(zhuǎn)化);5，969，213 (單子葉植物的轉(zhuǎn)化)；5, 780，798 (玉米的轉(zhuǎn)化);5，959，179和5，914，451 (大豆的轉(zhuǎn)化)。代表性的例子包括由電穿孔促進(jìn)的原生質(zhì)體對(duì)于DNA的攝取(Rhodes等人，Science 240 :204-207,1988 ；Bates, Meth. Mol. Biol. Ill :359-366,1999 ;D' Halluin 等人，Meth. Mol. Biol. Ill 367-373,1999 ;美國(guó)專利號(hào)5,914, 451);用聚こニ醇處理原生質(zhì)體(Lyznik等人，PlantMol. Biol. 13 :151-161,1989 ；Datta 等人，Meth. Mol. Biol.，111 :335-334,1999);和用裝載有 DNA 的微粒轟擊細(xì)胞(Klein 等人，Plant Physiol. 91 :440-444,1989 ；Boynton 等人，Science 240 :1534-1538,1988 !Register 等人，Plant Mol.Biol. 25 :951-961,1994 ；Barcelo 等人，Plant J. 5 :583-592,1994 ；Vasil 等人，Meth. Mol. Biol. Ill :349-358,1999 ；Christou, Plant Mol. Biol. 35 :197-203,1997 ;Finer 等人,Curr. Top. Microbiol.Tmmunol. 240 :59-80,1999)。另外,植物轉(zhuǎn)化策略和技術(shù)在 Birch, Ann. Rev. Plant Phys.Plant Mol. Biol. 48 :297,1997 ;Forester 等人，Exp. Agric. 33 :15-33，1997 中進(jìn)行了綜述。較小的變化使得這些技術(shù)可應(yīng)用于廣泛范圍的植物物種。在單子葉植物轉(zhuǎn)化的情況下，粒子轟擊通常是所選擇的方法。然而，單子葉植物例如玉米也可以通過(guò)使用在美國(guó)專利5，591，616中所述的土壌桿菌轉(zhuǎn)化法來(lái)進(jìn)行轉(zhuǎn)化。實(shí)現(xiàn)單子葉植物例如玉米的轉(zhuǎn)化的另ー種方法將來(lái)自胚胎發(fā)生懸浮培養(yǎng)物的細(xì)胞與纖維(5%w/v, SilarSC-9須晶)和質(zhì)粒DNA (I μ g/μ I)的懸浮液相混合,并且隨后垂直置于VortexGENIE II 潤(rùn)旋混合器(Scientific Industries, Inc.，Bohemia, NY, USA)上的多樣品頭中，或水平置于 MIXOMAT 牙科萊合金混合器(Degussa Canada Ltd. , Burlington, Ontario,Canada)的固定器中。然后,可以通過(guò)以全速混合約60秒(例如,用Vortex GENIE II)或以固定速度振蕩I秒(ΜΙΧ0ΜΑΤ)來(lái)進(jìn)行轉(zhuǎn)化。這個(gè)過(guò)程導(dǎo)致產(chǎn)生可以從其中選擇出穩(wěn)定轉(zhuǎn)化體的細(xì)胞群體。從經(jīng)穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的愈傷組織中再生出植物，并且這些植物及其后代可以通過(guò)Southern雜交分析顯示為轉(zhuǎn)基因的。該方法的主要優(yōu)點(diǎn)是其簡(jiǎn)單性和低成本。與粒子轟擊不同，不需要昂貴的設(shè)備和供應(yīng)。對(duì)于轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞特別是玉米而使用須晶例如在美國(guó)專利5，464，765中得到描述。美國(guó)專利5，968，830描述了用于轉(zhuǎn)化和再生大豆的方法。美國(guó)專利5，969，215描述了用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)化的甜菜(Beta vulgaris)植物例如糖用甜菜的轉(zhuǎn)化技術(shù)。上述轉(zhuǎn)化技術(shù)中的每ー種均具有優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)。在每種技術(shù)中，對(duì)來(lái)自質(zhì)粒的DNA進(jìn)行遺傳改造，從而使得它不僅包含目的基因，還包含可選擇和可篩選標(biāo)記基因。可選擇標(biāo)記基因用于僅選擇出具有該質(zhì)粒的整合拷貝的那些細(xì)胞(構(gòu)建是這樣的，即使得目的基因以及可選擇和可篩選基因作為ー個(gè)単元進(jìn)行轉(zhuǎn)移)?？珊Y選基因?qū)τ趦H成功培養(yǎng)攜帶目的基因的那些細(xì)胞提供了另ー種檢查。具有抗生素抗性選擇標(biāo)記的常規(guī)的土壌桿菌轉(zhuǎn)化可能是有問(wèn)題的，因?yàn)閷?duì)于此類植物引起將抗生素抗性散布至動(dòng)物和人的過(guò)度風(fēng)險(xiǎn)存在著公眾反對(duì)意見。此類抗生素標(biāo)記可以通過(guò)使用類似于在美國(guó)專利5，731，179中描述的那些的土壤桿菌技術(shù)轉(zhuǎn)化植物而從 植物中消除?？股乜剐詥?wèn)題還可以通過(guò)使用bar或pat編碼序列而有效地避免，例如在美國(guó)專利號(hào)5，712，135中所描述的。這些優(yōu)選的標(biāo)記DNAs編碼第二種蛋白質(zhì)或多肽，所述第二種蛋白質(zhì)或多肽抑制或中和谷氨酰胺合成酶抑制性除草劑膦絲菌素(草銨膦)和草銨膦鹽(Basta, Ignite)的作用。通過(guò)任何前述技術(shù)將包含一種或多種這些基因的質(zhì)粒引入植物原生質(zhì)體或愈傷組織細(xì)胞中。如果標(biāo)記基因是可選擇基因，那么只有已合并入了所述DNA包的那些細(xì)胞在使用合適的植物毒性試劑進(jìn)行選擇的條件下存活。一旦合適的細(xì)胞得到鑒定并繁殖后，就再生出植物。來(lái)自轉(zhuǎn)化的植物的后代必須進(jìn)行測(cè)試，以確保所述DNA包已成功地整合到植物基因組中。存在影響轉(zhuǎn)化的成功的許多因素。外源基因構(gòu)建體及其調(diào)節(jié)元件的設(shè)計(jì)和構(gòu)建影響外源序列整合到植物細(xì)胞核的染色體DNA內(nèi)，和轉(zhuǎn)基因被細(xì)胞表達(dá)的能力。用于以非致死方式將外源基因構(gòu)建體引入植物細(xì)胞核內(nèi)的合適方法是必需的。重要的是，如果待恢復(fù)全植物，那么將構(gòu)建體引入其中的細(xì)胞的類型必須是順應(yīng)于再生的類型，其中考慮了合適的再生方案。原生生物也可以用作宿主細(xì)胞以用于本發(fā)明的初始克隆步驟?？梢杂糜谶@些初始克隆和擴(kuò)展步驟的方法、載體、質(zhì)粒和宿主細(xì)胞系統(tǒng)是技術(shù)人員眾所周知的，并且在本文中不進(jìn)行描述。在本發(fā)明的另ー個(gè)實(shí)施方案中，可以使用技術(shù)人員眾所周知的方法插入早期特異性胚胎啟動(dòng)子，以便在待轉(zhuǎn)化的植物中與編碼植物生長(zhǎng)和/或發(fā)育相關(guān)基因例如REV的基因有效地連接。啟動(dòng)子的插入將允許基因例如REV在轉(zhuǎn)基因植物的正在發(fā)育的種子中的早期胚胎表達(dá)。在本發(fā)明的方法中特別感興趣的轉(zhuǎn)基因植物包括但不限于，特別是來(lái)自十字花科、禾本科、錦葵科或豆科-蝶形花亞科的單子葉植物和雙子葉植物。在這些科中特別感興趣的植物包括但不限干，卡諾拉油菜、玉米、亞麻薺、棉花、小麥、稻、大豆、大麥及其他產(chǎn)生種子的植物，以及具有農(nóng)業(yè)利益的其他植物，包括但不限于苜蓿等，其在本發(fā)明的ー個(gè)具體實(shí)施方案中包含有在早期特異性胚胎啟動(dòng)子的控制下的REV轉(zhuǎn)基因。轉(zhuǎn)基因可以來(lái)自與轉(zhuǎn)基因植物相同的物種，或者轉(zhuǎn)基因可以來(lái)自異源植物。特別感興趣的是包含來(lái)自擬南芥的REV轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因植物。早期特異性胚胎啟動(dòng)子也可以來(lái)自與轉(zhuǎn)基因植物相同的物種，或者來(lái)自異源植物。例如，早期特異性胚胎啟動(dòng)子可以來(lái)自與REV轉(zhuǎn)基因相同的植物物種，或甚至來(lái)自另ー個(gè)植物物種。特別感興趣的是來(lái)自擬南芥屬物種或Lesquerella fendleri的早期特異性胚胎啟動(dòng)子，但早期特異性啟動(dòng)子可以得自另ー個(gè)植物物種。已發(fā)現(xiàn)適合于本發(fā)明方法的早期特異性啟動(dòng)子和REV轉(zhuǎn)基因的特定組合包括但不限干，(a)LeSqUerellafendleri LFAHl2啟動(dòng)子/擬南芥屬物種REV ； (b)擬南芥屬物種AAPl啟動(dòng)子/擬南芥屬物種REV ; (c)擬南芥屬物種LEC2啟動(dòng)子/擬南芥屬物種REV ;和(d)擬南芥屬物種2S2啟動(dòng)子/擬南芥屬物種REV。在本發(fā)明的ー個(gè)具體實(shí)施方案中，這些轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體已用于轉(zhuǎn)化卡諾拉油菜，但可以用于轉(zhuǎn)化其他植物物種。特別地，它們可以用于在大豆、玉米、棉花、亞麻薺、稻、小麥、大麥、苜蓿和其他具有農(nóng)業(yè)利益的農(nóng)作物中產(chǎn)生具有增加的種子大小和/或種子數(shù)目的轉(zhuǎn)基因植物。本發(fā)明還提供了用于選擇増加植物產(chǎn)量的生長(zhǎng)和/或發(fā)育相關(guān)基因的方法。在該方法中，目的基因在表達(dá)質(zhì)?；蜉d體中與早期特異性胚胎啟動(dòng)子功能性地結(jié)合。 使用本領(lǐng)域已知的方法將包含目的基因的表達(dá)質(zhì)?；蜉d體轉(zhuǎn)染到植物細(xì)胞中，以形成轉(zhuǎn)基因細(xì)胞。通過(guò)已知方法(包括上文公開的那些)使包含轉(zhuǎn)基因的細(xì)胞長(zhǎng)大并再生成轉(zhuǎn)基因植物，直至獲得轉(zhuǎn)基因植物。就與野生型植物相比較而言増加的產(chǎn)量來(lái)觀察轉(zhuǎn)基因植物，并選擇用于獲得具有増加的產(chǎn)量的轉(zhuǎn)基因植物的那些生長(zhǎng)和/或發(fā)育相關(guān)基因以用于進(jìn)ー步發(fā)展。包含所選擇的生長(zhǎng)和/或發(fā)育相關(guān)基因的轉(zhuǎn)基因植物可以進(jìn)一歩發(fā)展，以提供具有比野生型植物更高的產(chǎn)量的具有農(nóng)業(yè)重要性的植物。僅作為本發(fā)明的各個(gè)方面的舉例說(shuō)明提供了下述實(shí)施例，它們不應(yīng)解釋為以任何方式限制了本發(fā)明。
實(shí)施例下述實(shí)施例描述了各種表達(dá)載體的構(gòu)建，所述表達(dá)載體包含早期特異性胚胎啟動(dòng)子和在植物生長(zhǎng)和/或發(fā)育中具有作用的基因。特別地，將胚胎特異性啟動(dòng)子(a)Lesquerella fendleri LFAH12 ； (b)擬南芥屬物種 AAPl ； (C)擬南芥屬物種 LEC2 ; (d)擬南芥屬物種2S2 ;和(e)擬南芥屬物種FAE1，與擬南芥屬物種REVOLUTA (REV)基因有效地結(jié)合，并用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因卡諾拉油菜植物。實(shí)施例I :轉(zhuǎn)基因卡諾拉油菜植物，其表達(dá)被設(shè)計(jì)為賦予REVOLUTA的胚胎特異性表達(dá)的轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體。相對(duì)于非轉(zhuǎn)基因野生型擬南芥屬物種植物，擬南芥屬物種REV基因在轉(zhuǎn)基因擬南芥屬物種植物中的組成型過(guò)量表達(dá)導(dǎo)致増加的種子大小，但這個(gè)性狀伴隨著負(fù)面的多效性效應(yīng)。這些效應(yīng)包括擬南芥屬物種中改變的葉形態(tài)和減少的腋生枝形成。改變的葉形態(tài)和總體遲緩的植物生長(zhǎng)是在以高組成性水平遍及植物地過(guò)量表達(dá)REV基因的轉(zhuǎn)基因卡諾拉油菜中觀察到的負(fù)面效應(yīng)。為了獲得増加的種子大小性狀并同時(shí)避免在非種子組織中的不希望的效應(yīng)，可以采取將REV轉(zhuǎn)基因的過(guò)量表達(dá)特異性地靶向種子中的正在發(fā)育的胚胎這樣的策略。這可以通過(guò)使用轉(zhuǎn)基因表達(dá)構(gòu)建體來(lái)完成，其中胚胎特異性啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)REV基因的表達(dá)。還可以合理地預(yù)期，參與植物發(fā)育和生長(zhǎng)過(guò)程的其他植物基因如REV的組成型過(guò)量表達(dá)將會(huì)對(duì)轉(zhuǎn)基因植物具有負(fù)面的多效性效應(yīng)。胚胎特異性啟動(dòng)子用于評(píng)估在發(fā)育和生長(zhǎng)中具有作用的植物基因例如可能的產(chǎn)量增加基因的應(yīng)用提供了就在增加農(nóng)作物產(chǎn)量方面的功效來(lái)評(píng)估此類植物基因的一般方法。選擇賦予胚胎特異性表達(dá)的5種啟動(dòng)子以用于在表達(dá)構(gòu)建體中使用，所述表達(dá)構(gòu)建體被設(shè)計(jì)為在早期胚胎發(fā)育期間在卡諾拉油菜胚胎(歐洲油菜)中產(chǎn)生REV的轉(zhuǎn)基因表達(dá)。這些啟動(dòng)子包括AAPl (來(lái)自擬南芥的氨基酸通透酶基因)(Hirner等人，Plant J. 14 535-544，1998)，GGTTGCATCT TTGAATACCT TTTTCTCATTTAGGCATAACAATATAATAATTTGTTTTTT GTTTTCATTT TCTTTTGGTGTCATCTTCAAAAATCTGTAAACCCAAAAGT TTGTATAACT TGTTTATTAAGATATTTTTAATTAAATTTTTTTTTTTGAC ATTTTTAAAA AATTATAAAGTGTTTTATGAATTTAAGGAG TAAATAATAT TTATTTAGAA CACTATAAATTAGTTTTACAAGTTCTTAGAAATGTATCTG TAAATTTCAA AAAGGAAAAATATAGCATTTAATTTTGAAGATTTTTTTCT ACATTATATA TATGATAAAAATATTGTATTTTGTACTTTGTAGTTACAAA AAGTCATTAT ATCAACAAATCTAAATATAAAATATTTTTCTATATATTAC TCCAAATTAA CTGTCAGAATAAAAAAGAAGAATAATTATTACAGAATCTG AACATTAAAA TCGTCCCTCCATATGTGGTCTCTGTCTAGTCCAAAAGCAA TTTACACATC CCAAGCCGAAACTATATTAAATAAACATTTTTTTTTCTTT AACTAAAACA TTTATAACATTTAACAATAAAAGTTAAAAATCGAACACGT ATAACGTATT TTTTTACGTATACGTCTTGTTGGCATATATGCTTAAAAAC TTCATTACAT ACATATACAAGTATGTCTATATATATGATATTATGCAAAC ACAAATCTGT TGACTATAATTAGACTTCTTCATTTACTCTCTCTCTGACT TAAAACATTT ATTTTATCTTCTTCTTGTTCTCTCTTTCTCTTTCTCTCA (SEQ ID NO:11);LFAH12(來(lái)自 Lesquerella fendleri 的油酸 12-輕化酶去飽和酶基因)(Broun等人，Plant J. 13 :201-210,1998)，TCAGGAAGAT TAAGTCTTTG CTTGTTGTCTGATTTTCTTTAAATACATTAAGAAATCGGT TATGAAGCTT CGTTTTTTGTGTTTTGGGATTATGAAGCTGTCTTTGGATA TTAGTTGCGG TTATTAGCATGCTTCTCTTTTGTGTTTTGGGGATGATGAA GCAGGGTCTC TCTATGTAATGCATTTTGTTTGAAAACTCAGCTAATGCTA ATGCAATTTC TTTTGAAACCTTTGTTATGTTTTCAAAAATATTGAATAGG TTCTGTTATG GATTTATTTGCAAAAGCCATTGATTAAATCAAACCATTAC ATAAGAACAA CATTCATTATTAACTAATTAGAGATGCAAAACACAACATT ACATACAACA TCAGTGACTAATTATTGAGACAAAACAACATCACAGACAC AAACATTCAT CTCATACATCACTTAGAGAGACACAAAAAGCAACCAAACA CAACTATTCC GCCAACAACAATTAGCTTCATACGTTTTGCTTCTCCTTTC AAGCCTTCAA TCATCTTCTCACAGCCACGAATCTGAGCCTTCAATAATAA CATTTCTTCA TCGTGACACTTCTCACGGTTATGAATGCAAGCCTTTATGT CCTCTACTTC TTCTACTAAAGACACATCGGTCCACTTCCA
GGTGTGGAATCCTCCTCTTTTGAAATTTTTCTCACAGGTATGGAATAATCTACCTGGGTTTTTTGGAGTTCTTGAGGTTCTGATCACAACACGGCATCCA CATCGACAGGTCTTAGGAAA ACCACGAAGGTTATGATCTTCAAGCTCACTGTCAAAAGATAAAAACGAGTTTGAAGAAGAAGAAGGCATTATCAATTTCAGAGAATTTTGGAGAATTTTG AGAGATTGAGAATTGGGAAATAAGAACCCTAATCCCCAATTTATGAGATTGAAAATATATCCGTTAGAGAAGAAACATAATGTTGTGCGTTTTAATTAGA AAAAATAGAGATGGGCTTTATCTTTTGTTAAGAGTTTTGGGCTTGGGCTTGGGTTTTTGATAAAAAAATTAATTAAACCAAAACGACGTCGTTTGGTTTA ATTGTTGTTAAAAAAAAATTAAAACACCAAAACGACGTCGTTTTGGTGTTATTAACGGCCTTAAAACGGATTAAATCCATAATCCGTCAGTCAACTAGGG TTACGGATGGTCAACGGCGTTTTTGCATAACGGAGGCACAGTTCAGGCTTAACGGAGTGGACGGAATGGCTTTTTAGGAAGTTTGTAACCGGGGTCTTTTGTTTATGATGTATTTGTCCCCGTCGGCTATTGTTCAGGCCGTTTAGGCCTTTTTCCTATATACTGGAAATAACTATTGTCCAGACGAGTTACTTCTCCAA CATATCAAGAAGTGTTACAAAGATGTGTTACGAAGCCATAAAACTCAAAA CCCTAAGCCTAAACCCTAGAACTTTCTAGCACGTTTATACCTTCTCCTTTCTTTAGTTTCCTTTAAAGGCCTTCGTATCATAAGTTTTATTTTTGCTTAA TACTAACACTAGAAAAAAACAATAATCAACATAAACTAGGTTAAGTCGTG GATCTAATTTTATTGTGAAAATGTAATTGCTTCTCTTAAGAAAAGATTCA TAGCAAAATATTCGCATCTTTCTTGTGAATCATCTTTTGTTTTTGGGGCTATTAAAGAAAAATTGAACTCATGAAATGGTGACAACTTTATTCTAGAGGTAACAGAACAAAAATATAGGAACAACACGTGTTGTTCATAAACTACACGTA TAATACTCAAGAAGATGAATCTTTATAAGAATTTAGTTTTCTCATGAAAA CATAAAAAGTTTTGTCAATTGAAAGTGACAGTTGAAGCAAAGGAACAAAA GGATGGTTGGTGATGATGCTGAAATGAAAATGTGTCATTCATCAAATACTAAATACTACATTACTTGTCACTGCCTACTTCTCCTCTTTCCTCCGCCACC CATTTTGGACCCACGAGCCTTCCATTTAAACCCTCTCTCGTGCTATTCAC CAGAATAGAAGCCAAGAGAGAGAGAGAGATTGTGCTGAGGATCATTGTCTTCTTCATCGTTATTAACGTAAGTTTTTTTTTGACCACTTATATCTAAAATCTAGTACATGCAATAGATTAATGACTGTTCCTTCTTTTGATATTTTCAGC(SEQ I D NO:12);2S2 (來(lái)自擬南芥的 2S2 白蛋白基因)(Guerche 等人，Plant Cell 2:469-478，1990)，F(xiàn)AEl (來(lái)自擬南芥的脂肪酸延長(zhǎng)酶基因)(Rossak等人，Plant Mol. Biol. 46 717-725，2001)，和LEC2 (來(lái)自擬南芥的葉狀子葉基因)(Kroj等人，Development 130 6065-6073,2003)。CTTTGTTTTGTAGAGTGTTC TATGGGTTATGATTTCGAAAAGAAAAAAAATTGTGAGACACTTAATAAAA TTATTTCGACAAAAAAAGTAGCTTGTATAAAAAAATCAGATTTTAATTTA TGTAAGAACAAATTCCAATATCCAATAGTTAAAAATAATTATTTGTTCCG ATTAATCGAGTTTTGCAAAATATGCACAAA
ATCTATCAT GTACCATTTC TAAGACTATA TATTTGGTTA TATATTTTATGCCGTGTGTT CTGATTCCAA TAAATTTTAG CGCATAGTAA ATTTTCTAAAAAGCAAAATT TTCTCAAAAG TGTACTAATG ACAATTAATT GAGTTTCTACAAAATAAGAA TAACTATTGA CTCGATTTTC ACAAAACTAG TATGCTAAATATCACATTAC TTTTAAAATT AAATGGAATT ATCTTTTTCA ATATTGGATACGAATAATTT TTACACTAAA GTTATTTTAA TAAAATAACC GTTTATTCAAAATATGTAAA GACGACAAAA ATATATATTA AATGGAAAAA CGACTAACTTAGTTTTTGCA AAATTAAATG GATTTGTCCT TTTCAATGTT TGAATACAAA AAAAAATCTA TAATAAGTTT ATTATATTAA AATAACCCGT TTTTTCAGAATACGCAAAAA CGACAAAAAA ATATTAATTA CAAAGAAATT TAGTTTATACAAAAATATG AATGGCTATT AATGGTGTTT ACTCTAAATT TAATTATTATGCATTTATGC TAAATCTTTC TAAAGGTACA AAGATTCGTT TTTTCAATGTTTGAACTGC ATATTAAGGT ATAGATTTGG ACCTTAACAG AGTTAATATATAAGGAAGAG AGCCAAGGAA CTCCAAAATA AAATAAAGAG CCTTCTCTCTCTCTCTCTGA GAAAAAACAC ATATAGCCAA TGACCTTCTC GTGGTCTTCTGTGCCATAAA AGCCATTATA TACATTCAAA CACAATCTGG CGCCACATATACACATGTAC TAGTGTATGT ATATGTCCTA ACCTCTGTAT TCATATCTCTCTCCTTGTCT GAGTGGTGCG ATGGGTATCC CCATAAGCTG CAAACATTGAACCATCTGCA ACATTTTGAC TCGTTTTCTT TTGTGTTTTT CCAACATCTGTCTCTTCTTC ACTCGCTCTC TCCTAATCAA TCTCCCCAAC GACCTCTCTTTTTTTTTGTT TCTTCACTCA GATCTCTCTC CCTCTCTCTC TCTCTCTCTCCGGGAAAA (SEQ ID NO:13)所有5種啟動(dòng)子在擬南芥屬物種中產(chǎn)生早期胚胎表達(dá)。這5種啟動(dòng)子在早期胚胎發(fā)育期間的表達(dá)譜在圖I中示意性地顯示。AAP1、LFAH12、2S2和FAEl啟動(dòng)子在胚胎發(fā)育的最早階段中是不工作的。它們?cè)诎l(fā)育中漸進(jìn)地在更晚階段時(shí)變得具有轉(zhuǎn)錄活性，從AAPl開始，隨后為L(zhǎng)FAH12、2S2，再隨后為FAE1。然后，所有這4種啟動(dòng)子保持具有活性直至更遲的胚胎發(fā)育階段。LEC2啟動(dòng)子具有相反的表達(dá)譜，在非常早期胚胎發(fā)育中是具有活性的，隨后活性逐漸降低直至更遲的階段。將AAPI、LFAHl2、2S2、FAEI和LEC2啟動(dòng)子在REV轉(zhuǎn)基因表達(dá)構(gòu)建體中與REV編碼區(qū)序列的2種構(gòu)造之任ー相組合。將AAPI、LFAHl2、2S2、FAEI和LEC2啟動(dòng)子與REV基因編碼序列(包括存在于REV基因中的所有內(nèi)含子)相組合。還將AAPl和LFAH12啟動(dòng)子與衍生自缺乏內(nèi)含子的REV cDNA的REV編碼區(qū)序列相組合。擬南芥REV (At Rev) cDNAATGGAGATGG CGGTGGCTAA CCACCGTGAG AGAAGCAGTG ACAGTATGAATAGACATTTA GATAGTAGCG GTAAGTACGT TAGGTACACA GCTGAGCAAGTCGAGGCTCT TGAGCGTGTC TACGCTGAGT GTCCTAAGCC TAGCTCTCTCCGTCGACAAC AATTGATCCG TGAATGTTCC ATTTTGGCCA ATATTGAGCCTAAGCAGATC AAAGTCTGGT TTCAGAACCG CAGGTGTCGA GATAAGCAGAGGAAAGAGGC GTCGAGGCTC CAGAGCGTAA ACCGGAAGCT CTCTGCGATGV6
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VOOVXXVOOXVXOXOVXOVV0X00XVVX3X0V0VV3330VXXVV300V3X[6810]
VXVX0030XX03033XXXV33V0XVVVVVV3V30XX03X0VVV33XV3X0[8810]
V0XVXXX3333V03XX30X0XV0033XX0X0V00XX300V0XX3XVVXX3[Z.810]
3V3XV03X0XXV3V3XXVXXVX3XX00X00XOOXVOXOXX3300VVXVVX[9810]
XXVXOOOXOVX3XXX30XVVV0V30V0V0X0XXX0V3X3XX30V3XX30X[9810]
30XVVX33000X30V00X3X300X3XVX303X00V0V0X0XXXOOXOXXX[1^810]
X0V000XVV3V03X330V03VV3V3VXV0V0X333V00X3XXXV030333
0X33X300X3X3V03VV33V30XVX03V0V30XVXVXXX0XX30V03XVV[2810]
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3VV0VXX30VXX0XX3X00X0X330V03X30V300X0V00XVV30XV0VV[6Z.10]
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VXX0XX0X3VX3VVX30V30V3VVV0XVXVXVOOXVVVVO30X3X0XX30[VL10]
ΛΤ/-\ τ r\ τ T Tr\r\TTr\T ΤΛ Τ ~\Λ T/-\ r\ T Tr\r\i T T λ rr\ T λ ΤΛ rr\λ rr\ r\i rr\ r\ τ λ rr\ ττ r\ τ γ\λ τλ τλ τ τ λ τλ τΓλ # ι λ
AGCTGGTCTA GACATGCTAG AGACAACACT TGTAGCCTTA CAAGATATAACACTCGAAAA GATATTCGAT GAATCGGGTC GTAAGGCTAT CTGTTCGGACTTCGCCAAGC TAATGCAACA GGGATTTGCT TGCTTGCCTT CAGGAATCTGTGTGTCAACG ATGGGAAGAC ATGTGAGTTA TGAACAAGCT GTTGCTTGGAAAGTGTTTGC TGCATCTGAA GAAAACAAC AACAATCTGC ATTGTCTTGCCTTCTCCTTT GTAAACTGGT CTTTTGTGTG A(SEQ ID NO:I)。REV轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體LFAHl2-At REV 基因-rev 3’ UTR 用EcoRI-LFAH12 (GAATTCTCAGGAAGATTAAGTCTTTGCTTG ；SEQ ID NO :14)和SacI-LFAH12 (GAGCTCGCTGAAAATATCAAAAGAAGGAACA ；SEQ ID NO : 15)引物從 Lesquerellafendleri基因組DNA中擴(kuò)增出LFAH12啟動(dòng)子的2170堿基對(duì)(bp)區(qū)域。這些引物分別從離公開的 LFAH12 序列((GeilBank 標(biāo)號(hào) AF016103. I 或 Gl 3452128)(Broun 等人，Plant.J. 13 :201-210(1998))的5'和3'末端24個(gè)核苷酸和15個(gè)核苷酸處開始。將幾個(gè)獨(dú)立的PCR反應(yīng)產(chǎn)物克隆到pCR-Blunt (Invitrogen)中并進(jìn)行測(cè)序。所有序列彼此相同(SEQ IDNO :12)，并且與公開的LFAH12序列具有97%同一性。差異可能是由于用于取回啟動(dòng)子的L. fendleri的特定的添加物。用EcoRI將LFAH12移至pBluescript質(zhì)粒，并且將啟動(dòng)子在pBluescript中的定向確定為KpnI在啟動(dòng)子的5'側(cè)和SaeI在啟動(dòng)子的3'側(cè)(pTG143)。作為來(lái)自 PTG95 (在 pCGN1547 中的 35S-At REV 基因-rev 3’UTR，專利 WO 01/33944A1)的SaeI-KpnI片段獲取At REV基因-rev 3’UTR盒，并連同LFAH12啟動(dòng)子(來(lái)自pTG143的KpnI-SaeI片段)一起以三路連接(three-way ligation)方式連接到已用KpnI進(jìn)行切割的 pCGN1547 ニ元載體(McBride 等人，Plant Mol. Biol. 14 :269-276,1990)中，以形成與植物NPTII表達(dá)盒處于尾對(duì)尾定向的LFAH12啟動(dòng)子-At REV基因-rev 3’ UTR0AAPl-At REV 基因-rev 3’ UTR用EcoRI-AAPl(GAATTCGGTTGCATCTTTGAATACCTTTTT ;SEQ ID NO : 16)和 SacI-AAPl(GAGCTCTGAGAGAAAGAGAAAGAGAGAACAA ；SEQ ID NO :17)引物從擬南芥(哥倫比亞生態(tài)型)基因組DNA中擴(kuò)增出AAPI啟動(dòng)子的809堿基對(duì)(bp )區(qū)域。SacI-AAPI引物從離公開的AAPI序列(GenBankw保存號(hào) X95622. I ；GI :1566687) (Hirner 等人，Plant J. 14 :535-544,1998)的3'末端6個(gè)核苷酸處開始。所有PCR產(chǎn)物的序列彼此相同，與公開的C24生態(tài)型AAPl序列具有98%同一性，和與經(jīng)注釋的Coi生態(tài)型AAPI序列(GenBank 名稱AC008051. 3 ；gi 7462019) (SEQ ID NO :11)具有 100% 同一性。用 EcoRI 將 AAPl 移至質(zhì)粒 pBluescript，并且將啟動(dòng)子在pBluescript中的定向確定為KpnI在啟動(dòng)子的5'側(cè)和SaeI在啟動(dòng)子的3'側(cè)(pTG145)。作為來(lái)自 pTG95 (在 pCGN1547 中的 35S_At REV 基因-rev 3’UTR，參見專利W001/33944A1)的SaeI-KpnI片段獲取At REV基因-rev 3，UTR盒，并連同AAPl啟動(dòng)子(來(lái)自PTG145的KpnI-SaeI片段)一起以三路連接方式連接到已用KpnI進(jìn)行切割的PCGN1547 ニ元載體(McBride 等人，Plant Mol. Biol. 14 :269-276,1990)中，以形成與植物NPTII表達(dá)盒處于頭對(duì)尾定向的AAPl啟動(dòng)子-At REV基因-rev 3’ UTR0LFAHl2-At REV cDNA-rev 3’ UTR從合成自總RNA的cDNA中擴(kuò)增出At REV cDNA,所述總RNA分離自Columbia生態(tài)型的擬南芥屬物種的葉。所使用的引物在ATG處摻入NcoI位點(diǎn)和在終止密碼子后摻入BamHI 位點(diǎn)NcoI_ATG rev CCATGGAGATGGCGGTGGCTAAC (SEQ ID NO : 18)和 BamHI-TGA revGGATCCTCACACAAAAGACCAGTTTACAAAGGA (SEQ ID NO: 19)。將所得到的 At REV cDNA PCR產(chǎn)物克隆到質(zhì)粒pCR-Blunt中并進(jìn)行測(cè)序(pTG230)。使用pTG95作為模板，用引物擴(kuò)增Rev 3’UTR，所述引物在5'末端處摻入EcoRV位點(diǎn)，和在3'位點(diǎn)處摻入Notl/Kpnl :EcoRVrevUTR GATATCTTCGATTGACAGAAAAAG (SEQ ID NO :20)和 Not/Kpn revUTR GCGGCCGCGGTACCCTCAACCAACCACATGGAACCA (SEQ ID NO :21 )。將所得到的 At REV 3' UTR 克隆到質(zhì)粒PCR-BIunt中并進(jìn)行測(cè)序。使用EcoRV和NotI位點(diǎn)將Rev 3' UTR移至質(zhì)粒pBluescript(PTG234)。然后使用EcoRV和NotI位點(diǎn)從pTG234中獲取Rev 3，UTR,并連接到pTG230中(pTG239)。作為來(lái)自 pTG239 的 SpeI-KpnI 片段獲取 At REVcDNA_rev3’ UTR 盒，并連同LFAHl2啟動(dòng)子(來(lái)自pTG143的KpnI-SpeI片段)一起以三路連接方式連接到pCGN1547 ニ元載體中，以形成與植物NPTII表達(dá)盒處于頭對(duì)尾定向的LFAH12-At REV cDNA-rev 3’UTR(pTG241)。AAPl-At REV cDNA-rev 3’ UTR
作為來(lái)自pTG239 的 SpeI-KpnI 片段獲取 At REVcDNA-rev 3’UTR 盒，并連同 AAPl啟動(dòng)子(來(lái)自PTG145的KpnI-SpeI片段)一起以三路連接方式連接到pCGN1547 ニ元載體中，以形成與植物NPTII表達(dá)盒處于頭對(duì)尾定向的AAPl-At REV cDNA-rev 3’UTR (pTG242)。FAEl-At REV 基因-rev 3’ UTR使用KpnI和SpeI位點(diǎn)從⑶載體中擴(kuò)增出933 bp FAEl啟動(dòng)子，克隆到質(zhì)粒PCR-BIunt中，并進(jìn)行測(cè)序(pTG238)。然后,用EcoRI將FAEl啟動(dòng)子移至質(zhì)粒pBluescript中(PTG243)。作為來(lái)自pTG95的SpeI-KpnI片段獲取At REV基因-rev 3’UTR盒，并連同F(xiàn)AEl啟動(dòng)子(來(lái)自PTG243的KpnI-SpeI片段)一起以三路連接方式連接到已用KpnI進(jìn)行切割的 PCGN1547 ニ元載體(McBride 等人，Plant Mol. Biol. 14 :269-276,1990)中，以形成與植物NPTII表達(dá)盒處于頭對(duì)尾定向的FAEl啟動(dòng)子-At REV基因-rev 3’ UTR02S2-At REV 基因-rev 3’ UTR從CD 質(zhì)粒 p4163(2S2_At REV SwaI 片段)中切出 1379 bp 2S2 啟動(dòng)子，并在 EcoRV位點(diǎn)處連接到pBluescript中。啟動(dòng)子在pBluescript中的定向被確定為KpnI在啟動(dòng)子的5'側(cè)和BamHI在啟動(dòng)子的:V側(cè)(pTG251)。作為來(lái)自pTG138(在TOPO中的35S_At REV基因-rev 3’ UTR)的BamHI-KpnI片段獲取At REV基因-rev 3’ UTR盒，并連同2S2啟動(dòng)子(來(lái)自PTG251的KpnI-BamHI片段)一起以三路連接方式連接到已用KpnI進(jìn)行切割的PCGN1547 ニ元載體(McBride 等人，Plant Mol. Biol. 14 :269-276,1990)中，以形成與植物NPTII表達(dá)盒處于頭對(duì)尾定向的2S2啟動(dòng)子-At REV基因-rev 3’ UTR0LEC2-At REV 基因-rev 3，UTR用ApaI和PstI從CD質(zhì)粒p5217中切出1256 bp LEC2啟動(dòng)子，并且在相同位點(diǎn)處克隆到質(zhì)粒pBluescript中(pTG252)。然后，作為KpnI-BamHI片段將該啟動(dòng)子置于在相同位點(diǎn)處線性化的PTG112 (在質(zhì)粒pCR-Blunt中的At REV基因)中以產(chǎn)生pTG280，這是在pCR-Blunt質(zhì)粒中的LEC2-At REV基因。使用pTG234作為模板，用引物擴(kuò)增出Rev 3' UTR,所述引物在Y末端處摻入NotI位點(diǎn)，和在:V末端處摻入Notl/Kpnl :Not REV UTR startGCGGCCGCTTCGATTGACAGAAAAAG (SEQ ID NO :22)和 NotKpn Rev UTRGCGGCCGCGGTACCCTCAACCAACCACATGGAACCA (SEQ ID NO :23)。將所得到的 At REV 3’UTR 克隆到質(zhì)粒 pCR-Blunt中并進(jìn)行測(cè)序(PTG281)。然后，使用NotI位點(diǎn)將Rev 3’UTR移至pTG280，并就正確定向進(jìn)行篩選。所得到的質(zhì)粒是在質(zhì)粒pCR-Blunt中的LEC2-At REV基因-rev 3’UTR(pTG283)。作為KpnI片段將LEC2-At REV基因-rev 3’ UTR移至用KpnI線性化的pCGN1547質(zhì)粒，并就與植物NPTII表達(dá)盒的頭對(duì)尾定向進(jìn)行篩選(PTG288)?？ㄖZ拉油菜(歐洲油菜)的轉(zhuǎn)化用REV轉(zhuǎn)基因表達(dá)構(gòu)建體轉(zhuǎn)化雙單倍體卡諾拉油菜變種DH12075，其中使用基于Maloney 等人(Maloney 等人,Plant Cell Reports 8 :238,1989)的那種的土壤桿菌介導(dǎo)的
轉(zhuǎn)化方法。 使經(jīng)滅菌的種子在15 X 60mm培養(yǎng)皿中在含有1%蔗糖的1/2MS (Murashige &Skoog)培養(yǎng)基上發(fā)芽5天,其中姆個(gè)平板大約40-大約60粒種子。對(duì)于姆個(gè)轉(zhuǎn)化構(gòu)建體，使總共約1500粒種子發(fā)芽。種子并不完全浸入發(fā)芽培養(yǎng)基中。使發(fā)芽的幼苗在組織培養(yǎng)室中于25°C進(jìn)行生長(zhǎng)，采用16小時(shí)光/8小時(shí)暗循環(huán)。正好在頂端分生組織上切割子葉，而不獲得任何分生組織。這通過(guò)用鑷子緊在頂端分生組織區(qū)域上輕輕夾住2個(gè)葉柄來(lái)完成。小心不要用鑷子壓碎葉柄。使用鑷子的尖端作為引導(dǎo)，使用具有鋒利號(hào)(sharp No.)為12的刀片的解剖刀切割葉柄。將子葉放到15mmX IOOmm的共培養(yǎng)培養(yǎng)基平板上。經(jīng)正確切割的子葉容易地分開。如果它們不是這樣，那么非?？赡芤勋@得了分生組織，并且不使用這樣的子葉。每個(gè)平板容納約20片子葉。在每制備少數(shù)平板后用土壤桿菌接種子葉外植體以避免萎蔫，所述萎蔫將對(duì)該方案的隨后階段產(chǎn)生負(fù)面影響。通過(guò)電穿孔將REV轉(zhuǎn)化構(gòu)建體引入根瘤土壤桿菌中。具有REV轉(zhuǎn)化構(gòu)建體的土壤桿菌在含有合適抗生素的AB培養(yǎng)基中于28°C搖動(dòng)生長(zhǎng)2天。為了接種子葉外植體，將少量土壤桿菌培養(yǎng)物加入至10_ X 35mm培養(yǎng)皿中。將姆個(gè)外植體的葉柄浸泡在土壤桿菌培養(yǎng)物中，并且將切割末端放入培養(yǎng)皿中的共培養(yǎng)培養(yǎng)基內(nèi)。將平板密封，并在組織培養(yǎng)室中于250C ,16小時(shí)光/8小時(shí)暗下放置3天。3天后，將外植體以每組10個(gè)的方式轉(zhuǎn)移到包含幼芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基的新鮮的25mm xIOOmm培養(yǎng)皿。這種培養(yǎng)基包含選擇試劑(20mg/l卡那霉素)和激素(4. 5mg/l油菜素類固醇(BA))。只轉(zhuǎn)移看上去健康的外植體。使外植體在幼芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上保持14-21天。在這時(shí)，可能能夠觀察到緑色的愈傷組織和可能地某些幼芽形成以及某些未轉(zhuǎn)化的幼芽。通過(guò)其白色和紫色而容易地識(shí)別出未轉(zhuǎn)化的幼芽?？敲顾孛舾行杂籽客ㄟ^(guò)將其切掉來(lái)去除，并且將所有看上去健康的愈傷組織轉(zhuǎn)移至新鮮的幼芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基平板中。使外植體在這些平板上再保持14-21天。2-3周后，將顏色為深緑色的幼芽轉(zhuǎn)移至包含幼芽伸長(zhǎng)培養(yǎng)基的平板。這種培養(yǎng)基包含選擇試劑(20mg/l卡那霉素)，但不包含任何激素。每個(gè)平板轉(zhuǎn)移5個(gè)幼芽。將平板密封并送回組織培養(yǎng)室。將看起來(lái)有活力的轉(zhuǎn)化的幼芽轉(zhuǎn)移至包含間苯三酚(150mg/l)的幼芽伸長(zhǎng)培養(yǎng)基。將變得健康和緑色的幼芽返回至幼芽伸長(zhǎng)培養(yǎng)基平板。在某些情況下需要進(jìn)行有活力的幼芽至相同培養(yǎng)基的新鮮平板的反復(fù)轉(zhuǎn)移，以獲得外表正常的幼芽。將具有正常形態(tài)的幼芽轉(zhuǎn)移到具有生根培養(yǎng)基的4盎司嬰兒食品罐中，所述生根培養(yǎng)基含有0.5mg/l吲哚丁酸。當(dāng)將幼芽轉(zhuǎn)移至罐時(shí)，將任何多余的愈傷組織切棹。通過(guò)大約每6周將其轉(zhuǎn)移至包含O. 2mg/l吲哚丁酸的新鮮罐中，可以將幼芽無(wú)限期地維持在罐中。一旦形成了良好的根系，就將Ttl代幼芽從罐中取出，將瓊脂從根上除去，并且將小植物轉(zhuǎn)移至盆栽土壌中。每個(gè)獨(dú)立的Ttl小植物代表了轉(zhuǎn)基因插入至卡諾拉油菜基因組中的獨(dú)立發(fā)生，并被稱為事件。將透明杯置于小植物上數(shù)日，以允許植物適應(yīng)新環(huán)境。一旦植物已變硬，就移去杯。然后，使Ttl轉(zhuǎn)基因事件在溫室中生長(zhǎng)至成熟，并且收集T1種子。T0事件的表征通過(guò)Southern分析來(lái)測(cè)定每個(gè)事件中轉(zhuǎn)基因插入位點(diǎn)基因座的數(shù)目。通過(guò)Northern分析或終點(diǎn)RT-PCR來(lái)驗(yàn)證在Ttl事件中的REV轉(zhuǎn)基因表達(dá)。在19天的授粉后天數(shù)(DAP )，對(duì)于胚胎發(fā)育中的單個(gè)時(shí)間點(diǎn)，獲得REV表達(dá)數(shù)據(jù)。從這些數(shù)據(jù)中得出結(jié)論，在這個(gè)發(fā)育時(shí)間點(diǎn)時(shí)，LFAHl2和2S2白蛋白啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)比AAPI啟動(dòng)子更高水平的REVRNA產(chǎn)生。2S2/REV構(gòu)建體在許多事件中產(chǎn)生中等至高水平的表達(dá)。所述表達(dá)數(shù)據(jù)證實(shí)，所有5種啟動(dòng)子在轉(zhuǎn)基因卡諾拉油菜植物中驅(qū)動(dòng)REV轉(zhuǎn)基因表達(dá)方面具有功能。
對(duì)于所有7種REV轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體成功地產(chǎn)生了 Ttl植物。所測(cè)試的構(gòu)建體包括(a)AAP1/REV 基因；(b) AAPI/REVcDNA ；(c) LFAH12/REV 基因；(d) LFAHl 2/REVcDNA ；(e) 2S2/REV 基因；(f)FAEl/REV 基因；和(g) LEC2/REV 基因。實(shí)施例2 :在重復(fù)田間試驗(yàn)中評(píng)估在胚胎發(fā)育期間REV轉(zhuǎn)基因的表達(dá)對(duì)于卡諾拉油菜產(chǎn)量的影響。在這個(gè)實(shí)施例中，將包含有在各種胚胎特異性啟動(dòng)子控制下的擬南芥屬物種REV轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因卡諾拉油菜植物在田間試驗(yàn)中進(jìn)行測(cè)試。轉(zhuǎn)基因REV事件進(jìn)展至田間試驗(yàn)基于轉(zhuǎn)基因表達(dá)和轉(zhuǎn)基因插入基因座數(shù)目的組合來(lái)選擇Ttl事件以用于進(jìn)展至田間試驗(yàn)。將具有經(jīng)驗(yàn)證的轉(zhuǎn)基因表達(dá)和單個(gè)轉(zhuǎn)基因插入基因座的事件指定為最高優(yōu)先級(jí)以推進(jìn)至田間測(cè)試。在某些情況下，如果多個(gè)基因的存在由于基因劑量而產(chǎn)生高的總體轉(zhuǎn)基因表達(dá)水平，那么選擇具有多個(gè)插入基因座的事件。使來(lái)自所選事件的T1種子在田間地塊中作為分離性T1群體(segregating T1populations)進(jìn)行生長(zhǎng)。將每個(gè)事件種植為2行、24個(gè)植物的地塊。對(duì)于具有單個(gè)轉(zhuǎn)基因插入基因座的事件，在所述24個(gè)T1植物中的轉(zhuǎn)基因分離將產(chǎn)生大約6個(gè)缺乏轉(zhuǎn)基因的無(wú)效植物、12個(gè)雜合子植物和6個(gè)純合子植物的分布。在開花前將每個(gè)T1植物獨(dú)個(gè)地裝入袋中，以防止異型雜交。分開地收獲來(lái)自所述24個(gè)T1植物中每ー個(gè)的T2種子。將T2種子原種用于鑒定所述24個(gè)親本T1植物中的哪些是無(wú)效的、雜合子的或純合子的。使來(lái)自每個(gè)T1植物的大約30粒T2種子在培養(yǎng)皿中的濾紙上進(jìn)行發(fā)芽，所述培養(yǎng)皿具有包含抗生素G418 (卡那霉素的類似物)的溶液。因?yàn)槭褂胣ptll抗性基因作為選擇標(biāo)記來(lái)共轉(zhuǎn)化植物，所以只有攜帶轉(zhuǎn)基因的那些種子將發(fā)芽并繼續(xù)生長(zhǎng)。如果平板上的所有種子被證實(shí)對(duì)于G418敏感，那么該T1親本被鑒定為無(wú)效品系。如果平板上的所有種子對(duì)于G418具有抗性，那么該T1親本被鑒定為純合子品系。如果平板上大約四分之ー的種子是敏感的和其余的種子具有抗性，那么該T1親本被鑒定為雜合子品系。將從來(lái)自相同轉(zhuǎn)化事件的純合子T1親本獲得的'種子混合在一起，以產(chǎn)生用于田間試驗(yàn)測(cè)試的純合子種子原種。將從來(lái)自相同轉(zhuǎn)化事件的無(wú)效T1親本獲得的T2種子混合在一起，以產(chǎn)生用于田間試驗(yàn)測(cè)試的無(wú)效同胞種子原種。
田間試驗(yàn)設(shè)計(jì)通過(guò)在大規(guī)模重復(fù)試驗(yàn)中在田間使每種轉(zhuǎn)基因品系直接與其無(wú)效同胞進(jìn)行比較，在轉(zhuǎn)基因卡諾拉油菜品系中測(cè)試胚胎特異性啟動(dòng)子用于評(píng)估REV轉(zhuǎn)基因作為產(chǎn)量増加基因的潛力的用途。因?yàn)闊o(wú)效同胞由于T1代中轉(zhuǎn)基因的分離而產(chǎn)生，所以無(wú)效和純合子同胞在遺傳上幾乎是相同的。唯一的顯著差異是REV轉(zhuǎn)基因的存在或不存在。這種緊密的遺傳同一性使得無(wú)效同胞成為用于評(píng)估REV轉(zhuǎn)基因的效應(yīng)的最佳對(duì)照。因?yàn)樵囼?yàn)的主要目的是比較來(lái)自事件的轉(zhuǎn)基因品系與其無(wú)效分離子，所以選擇裂區(qū)(split plot)設(shè)計(jì)。這種設(shè)計(jì)使得能夠高水平地評(píng)估轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因分項(xiàng)之間的相互作用以及事件間的轉(zhuǎn)基因副區(qū)之間的差異(副區(qū)(subplot)和主區(qū)(main plot)的相互作用),并且較低水平地評(píng)估總體事件或主區(qū)之間的差異。
田間試驗(yàn)在跨越草原環(huán)境的多個(gè)位置處進(jìn)行，以在卡諾拉油菜所通常在其中進(jìn)行生長(zhǎng)的環(huán)境條件范圍下評(píng)估產(chǎn)量表型。在所有位置處，每個(gè)轉(zhuǎn)基因事件與在鄰近區(qū)塊中的其無(wú)效同胞進(jìn)行物理配對(duì)。純合子和無(wú)效同胞的每個(gè)區(qū)塊對(duì)在每個(gè)試驗(yàn)位置處重復(fù)4次。將在每次實(shí)驗(yàn)中的4個(gè)重復(fù)區(qū)塊對(duì)的位置在每個(gè)試驗(yàn)位置處進(jìn)行隨機(jī)分布。區(qū)塊為I. 6m X6m，并且以約142粒種子/平方米的密度進(jìn)行種植。使用對(duì)于卡諾拉油菜的商業(yè)生產(chǎn)而言典型的標(biāo)準(zhǔn)農(nóng)學(xué)實(shí)踐來(lái)使植物生長(zhǎng)至成熟。實(shí)施例3 :從胚胎特異性啟動(dòng)子表達(dá)REV轉(zhuǎn)基因以增加轉(zhuǎn)基因卡諾拉油菜中的種
子產(chǎn)量。在每個(gè)產(chǎn)量田間試驗(yàn)位置處的所有區(qū)塊用聯(lián)合收割機(jī)獨(dú)個(gè)地進(jìn)行收割。作為來(lái)自每個(gè)區(qū)塊的就水份含量進(jìn)行了調(diào)整的種子總重量，收集種子總產(chǎn)量數(shù)據(jù)。對(duì)于每次試驗(yàn)中的每個(gè)轉(zhuǎn)基因事件，將來(lái)自每個(gè)純合子品系的4個(gè)重復(fù)區(qū)塊的總產(chǎn)量平均值與來(lái)自相關(guān)的無(wú)效同胞品系的4個(gè)重復(fù)區(qū)塊的總產(chǎn)量平均值進(jìn)行比較。這種比較用于評(píng)估REV轉(zhuǎn)基因?qū)τ诜N子總產(chǎn)量的影響。將來(lái)自多個(gè)試驗(yàn)位置中每ー個(gè)位置的結(jié)果相組合，以產(chǎn)生REV轉(zhuǎn)基因?qū)ΨN子總產(chǎn)量的影響的交叉試驗(yàn)分析。在每個(gè)試驗(yàn)位置處的統(tǒng)計(jì)學(xué)方差分析允許對(duì)純合子轉(zhuǎn)基因品系與其無(wú)效同胞之間的種子總產(chǎn)量中的差異指定顯著性閾值(P = O. 05)。在種子總產(chǎn)量方面顯示出統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著增加的轉(zhuǎn)基因REV卡諾拉油菜品系概括在表I中。對(duì)于所有7種啟動(dòng)子/REV轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體鑒定出在總產(chǎn)量方面顯示出統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著増加的轉(zhuǎn)基因品系。這些結(jié)果證實(shí)，使用胚胎特異性啟動(dòng)子過(guò)量表達(dá)REV導(dǎo)致增加的種子產(chǎn)量。用LEC2啟動(dòng)子獲得了對(duì)產(chǎn)量的最大影響，這暗示REV的過(guò)量表達(dá)在胚胎發(fā)育的最早階段中可能是最有效的，因?yàn)長(zhǎng)EC2啟動(dòng)子在發(fā)育中非常早地具有最大活性，并逐漸降低轉(zhuǎn)錄活性直至胚胎發(fā)育的更遲階段。AAP1、LFAH12和2S2啟動(dòng)子在胚胎發(fā)育中的漸進(jìn)地更遲的階段時(shí)開始具有轉(zhuǎn)錄活性，但在增加產(chǎn)量方面也是有效的。就所回收的獨(dú)立事件的數(shù)目而言LFAH12啟動(dòng)子是突出的，所述獨(dú)立事件顯示出顯著增加的產(chǎn)量，這表明使用這種啟動(dòng)子獲得了性狀的高度外顯率。對(duì)于FAEl啟動(dòng)子只回收了 I個(gè)在產(chǎn)量方面具有中等増加的事件，這可能暗示在胚胎發(fā)育的較早階段中開始具有轉(zhuǎn)錄活性的啟動(dòng)子提供了用于產(chǎn)量增加的最佳手段，并證實(shí)基因的早期胚胎過(guò)量表達(dá)可以用于評(píng)估參與植物生長(zhǎng)和/或發(fā)育的基因是否具有在轉(zhuǎn)基因植物中增加農(nóng)作物產(chǎn)量的潛力。表I.相對(duì)于其無(wú)效同胞而言純合子REV植物中種子總產(chǎn)量的變化。所有值都是統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的(P=O. 05)。
權(quán)利要求
1.用于增加植物中的種子大小的方法，其包括在早期胚胎發(fā)育期間在種子中過(guò)量表達(dá)植物生長(zhǎng)和發(fā)育相關(guān)基因。
2.根據(jù)權(quán)利要求I的方法，其中在所述種子中的所述生長(zhǎng)和/或發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)處于早期特異性胚胎啟動(dòng)子的控制下。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中所述早期特異性胚胎啟動(dòng)子對(duì)于所述植物來(lái)說(shuō)是異源的。
4.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中所述早期特異性胚胎啟動(dòng)子對(duì)于所述植物來(lái)說(shuō)是同源的。
5.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中所述早期特異性啟動(dòng)子是與氨基酸通透酶基因(AAP1)、油酸12-羥化酶去飽和酶基因、2S2白蛋白基因(2S2)、脂肪酸延長(zhǎng)酶基因(FAEl)或葉狀子葉基因(LEC2)相關(guān)的啟動(dòng)子。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中所述AAPl啟動(dòng)子是來(lái)自擬南芥的AAPl啟動(dòng)子，所述油酸12-輕化酶去飽和酶啟動(dòng)子是來(lái)自Lesquerella fendleri的油酸12-輕化酶去飽和酶基因啟動(dòng)子(LFAH12)，所述2S2基因啟動(dòng)子來(lái)自擬南芥，所述脂肪酸延長(zhǎng)酶基因啟動(dòng)子來(lái)自擬南芥，或所述葉狀子葉基因啟動(dòng)子來(lái)自擬南芥。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的方法，其中所述植物生長(zhǎng)和/或發(fā)育相關(guān)基因是REV基因、CAP (環(huán)化酶相關(guān)蛋白)基因、稻組蛋白脫乙酰酶I基因、E2Fc基因、BKI基因、BRIl基因、ARL (Argos-Like)基因、bril (油菜素類固醇激素感受)基因、FATB基因、P印ino基因、RGS (G蛋白信號(hào)傳導(dǎo)調(diào)節(jié)劑)基因、TIPl基因、BB (BigBrother)基因、RHD2基因、INCW2基因、MNl基因、WAK2基因、WAK4基因或AP2基因。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中所述生長(zhǎng)和/或發(fā)育相關(guān)基因是REV。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中所述REV基因來(lái)源于擬南芥。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)的方法，其中所述植物是單子葉植物或雙子葉植物。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其中所述植物是十字花科、禾本科、錦葵科或豆科-蝶形花亞科的成員。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中所述植物是卡諾拉油菜、玉米、亞麻薺、棉花、苜蓿、大豆、小麥、稻或大麥。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其中所述植物是卡諾拉油菜或大豆，所述植物生長(zhǎng)和/或發(fā)育相關(guān)基因是REV，和所述早期特異性啟動(dòng)子是與氨基酸通透酶基因(AAP1)、油酸12-羥化酶去飽和酶基因、2S2白蛋白基因(2S2)、脂肪酸延長(zhǎng)酶基因(FAEl)或葉狀子葉基因(LEC2)相關(guān)的啟動(dòng)子。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的方法，其中所述AAPl啟動(dòng)子是來(lái)自擬南芥的AAPl啟動(dòng)子，所述油酸12-輕化酶去飽和酶啟動(dòng)子是來(lái)自Lesquerella fendleri的油酸12-輕化酶去飽和酶基因啟動(dòng)子(LFAH12)，所述2S2基因啟動(dòng)子來(lái)自擬南芥，所述脂肪酸延長(zhǎng)酶基因啟動(dòng)子來(lái)自擬南芥，或所述葉狀子葉基因啟動(dòng)子來(lái)自擬南芥。
15.用于增加可從植物獲得的種子數(shù)目的方法，其包括在早期胚胎發(fā)育期間在種子中過(guò)量表達(dá)植物生長(zhǎng)和發(fā)育相關(guān)基因。
16.根據(jù)權(quán)利要求15的方法，其中在所述種子中的所述生長(zhǎng)和/或發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)處于早期特異性胚胎啟動(dòng)子的控制下。
17.根據(jù)權(quán)利要求16的方法，其中所述早期特異性胚胎啟動(dòng)子對(duì)于所述植物來(lái)說(shuō)是異源的。
18.根據(jù)權(quán)利要求16的方法，其中所述早期特異性胚胎啟動(dòng)子對(duì)于所述植物來(lái)說(shuō)是同源的。
19.根據(jù)權(quán)利要求16-18中任一項(xiàng)的方法，其中所述早期特異性啟動(dòng)子是與氨基酸通透酶基因(AAP1)、油酸12-羥化酶去飽和酶基因、2S2白蛋白基因(2S2)、脂肪酸延長(zhǎng)酶基因(FAEl)或葉狀子葉基因(LEC2)相關(guān)的啟動(dòng)子。
20.根據(jù)權(quán)利要求19的方法，其中所述AAPl啟動(dòng)子是來(lái)自擬南芥的AAPl啟動(dòng)子，所述油酸12-輕化酶去飽和酶啟動(dòng)子是來(lái)自Lesquerella fendleri的油酸12-輕化酶去飽和酶基因啟動(dòng)子(LFAH12)，所述2S2基因啟動(dòng)子來(lái)自擬南芥，所述脂肪酸延長(zhǎng)酶基因啟動(dòng)子來(lái)自擬南芥，或所述葉狀子葉基因啟動(dòng)子來(lái)自擬南芥。
21.根據(jù)權(quán)利要求15-20中任一項(xiàng)的方法，其中所述植物生長(zhǎng)和/或發(fā)育相關(guān)基因是REV基因、CAP (環(huán)化酶相關(guān)蛋白)基因、稻組蛋白脫乙酰酶I基因、E2Fc基因、BKI基因、BRIl基因、ARL (Argos-Like)基因、bril (油菜素類固醇激素感受)基因、FATB基因、P印ino基因、RGS (G蛋白信號(hào)傳導(dǎo)調(diào)節(jié)劑)基因、TIPl基因、BB (Big Brother)基因、RHD2基因、INCW2基因、MNl基因、WAK2基因、WAK4基因或AP2基因。
22.根據(jù)權(quán)利要求21的方法，其中所述生長(zhǎng)和/或發(fā)育相關(guān)基因是REV。
23.根據(jù)權(quán)利要求22的方法，其中所述REV基因來(lái)源于擬南芥。
24.根據(jù)權(quán)利要求15-23中任一項(xiàng)的方法，其中所述植物是單子葉植物或雙子葉植物。
25.根據(jù)權(quán)利要求24的方法，其中所述植物是十字花科、禾本科、錦葵科或豆科-蝶形花亞科的成員。
26.根據(jù)權(quán)利要求25的方法，其中所述植物是卡諾拉油菜、玉米、亞麻薺、棉花、苜蓿、大豆、小麥、稻或大麥。
27.根據(jù)權(quán)利要求26的方法，其中所述植物是卡諾拉油菜或大豆，所述植物生長(zhǎng)和/或發(fā)育相關(guān)基因是REV，和所述早期特異性啟動(dòng)子是與氨基酸通透酶基因(AAP1)、油酸12-羥化酶去飽和酶基因、2S2白蛋白基因(2S2)、脂肪酸延長(zhǎng)酶基因(FAEl)或葉狀子葉基因(LEC2)相關(guān)的啟動(dòng)子。
28.根據(jù)權(quán)利要求27的方法，其中所述AAPl啟動(dòng)子是來(lái)自擬南芥的AAPl啟動(dòng)子，所述油酸12-輕化酶去飽和酶啟動(dòng)子是來(lái)自Lesquerella fendleri的油酸12-輕化酶去飽和酶基因啟動(dòng)子(LFAH12)，所述2S2基因啟動(dòng)子來(lái)自擬南芥，所述脂肪酸延長(zhǎng)酶基因啟動(dòng)子來(lái)自擬南芥，或所述葉狀子葉基因啟動(dòng)子來(lái)自擬南芥。
29.遺傳構(gòu)建體，其包含編碼與一種或多種控制序列有效地連接的植物生長(zhǎng)和/或發(fā)育相關(guān)基因的核酸序列，其中所述一種或多種控制序列能夠在胚胎發(fā)育期間促進(jìn)所述植物生長(zhǎng)和/或發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)。
30.根據(jù)權(quán)利要求29的遺傳構(gòu)建體，其中所述控制序列是早期特異性胚胎啟動(dòng)子。
31.根據(jù)權(quán)利要求30的遺傳構(gòu)建體，其中所述早期特異性胚胎啟動(dòng)子是與氨基酸通透酶基因(AAP1)、油酸12-羥化酶去飽和酶基因、2S2白蛋白基因(2S2)、脂肪酸延長(zhǎng)酶基因(FAEl)或葉狀子葉基因(LEC2)相關(guān)的啟動(dòng)子。
32.根據(jù)權(quán)利要求31的遺傳構(gòu)建體，其中所述AAPl啟動(dòng)子是來(lái)自擬南芥的AAPl啟動(dòng)子，所述油酸12-輕化酶去飽和酶啟動(dòng)子是來(lái)自Lesquerella fendleri的油酸12-輕化酶去飽和酶基因啟動(dòng)子(LFAH12)，所述2S2基因啟動(dòng)子來(lái)自擬南芥，所述脂肪酸延長(zhǎng)酶基因啟動(dòng)子來(lái)自擬南芥，或所述葉狀子葉基因啟動(dòng)子來(lái)自擬南芥。
33.根據(jù)權(quán)利要求29-32中任一項(xiàng)的遺傳構(gòu)建體，其中所述植物生長(zhǎng)和/或發(fā)育相關(guān)基因是REV基因、CAP (環(huán)化酶相關(guān)蛋白)基因、稻組蛋白脫乙酰酶I基因、E2Fc基因、BKI基因、BRIl基因、ARL (Argos-Like)基因、bril (油菜素類固醇激素感受)基因、FATB基因、P印ino基因、RGS (G蛋白信號(hào)傳導(dǎo)調(diào)節(jié)劑)基因、TIPl基因、BB (Big fcother)基因、RHD2基因、INCW2基因、MNl基因、WAK2基因、WAK4基因或AP2基因。
34.根據(jù)權(quán)利要求33的遺傳構(gòu)建體，其中所述植物生長(zhǎng)和/或發(fā)育相關(guān)基因是REV基因。
35.根據(jù)權(quán)利要求34的遺傳構(gòu)建體，其中所述REV基因是擬南芥REV基因。
36.根據(jù)權(quán)利要求29-35中任一項(xiàng)的遺傳構(gòu)建體，其中所述構(gòu)建體進(jìn)一步包含polyA序列。
37.用于產(chǎn)生具有增加的種子大小的轉(zhuǎn)基因植物的方法，所述方法包括(a)將根據(jù)權(quán)利要求29-36中任一項(xiàng)的遺傳構(gòu)建體引入植物或植物細(xì)胞內(nèi)jP(b)在促進(jìn)再生和成熟植物生長(zhǎng)的條件下培養(yǎng)包含所述遺傳構(gòu)建體的所述植物或植物細(xì)胞。
38.根據(jù)權(quán)利要求37的方法，其中所述植物或植物細(xì)胞來(lái)源于為單子葉植物或雙子葉植物的植物。
39.根據(jù)權(quán)利要求38的方法，其中所述植物是十字花科、禾本科、錦葵科或豆科-蝶形花亞科的成員。
40.根據(jù)權(quán)利要求39的方法，其中所述植物是卡諾拉油菜、玉米、亞麻薺、棉花、苜蓿、大豆、小麥、稻或大麥。
41.根據(jù)權(quán)利要求40的方法，其中所述植物是卡諾拉油菜或大豆。
42.用于產(chǎn)生具有增加的種子數(shù)目的轉(zhuǎn)基因植物的方法，所述方法包括(a)將根據(jù)權(quán)利要求29-36中任一項(xiàng)的遺傳構(gòu)建體引入植物或植物細(xì)胞內(nèi)jP(b)在促進(jìn)再生和成熟植物生長(zhǎng)的條件下培養(yǎng)包含所述遺傳構(gòu)建體的所述植物或植物細(xì)胞。
43.根據(jù)權(quán)利要求42的方法，其中所述植物或植物細(xì)胞來(lái)源于為單子葉植物或雙子葉植物的植物。
44.根據(jù)權(quán)利要求43的方法，其中所述植物是十字花科、禾本科、錦葵科或豆科-蝶形花亞科的成員。
45.根據(jù)權(quán)利要求44的方法，其中所述植物是卡諾拉油菜、玉米、亞麻薺、棉花、苜蓿、大豆、小麥、稻或大麥。
46.根據(jù)權(quán)利要求45的方法，其中所述植物是卡諾拉油菜或大豆。
47.用于產(chǎn)生具有增加的種子大小和增加的種子數(shù)目的轉(zhuǎn)基因植物的方法，所述方法包括(a)將根據(jù)權(quán)利要求29-36中任一項(xiàng)的遺傳構(gòu)建體引入植物或植物細(xì)胞內(nèi)jP(b)在促進(jìn)再生和成熟植物生長(zhǎng)的條件下培養(yǎng)包含所述遺傳構(gòu)建體的所述植物或植物細(xì)胞。
48.根據(jù)權(quán)利要求47的方法，其中所述植物或植物細(xì)胞來(lái)源于為單子葉植物或雙子葉植物的植物。
49.根據(jù)權(quán)利要求48的方法，其中所述植物是十字花科、禾本科、錦葵科或豆科-蝶形花亞科的成員。
50.根據(jù)權(quán)利要求49的方法，其中所述植物是卡諾拉油菜、玉米、亞麻薺、棉花、苜蓿、大豆、小麥、稻或大麥。
51.根據(jù)權(quán)利要求50的方法，其中所述植物是卡諾拉油菜或大豆。
52.轉(zhuǎn)基因植物，其包含根據(jù)權(quán)利要求29-36中任一項(xiàng)的遺傳構(gòu)建體，并且當(dāng)與相應(yīng)的野生型植物相比較時(shí)具有增加的種子大小，當(dāng)與相應(yīng)的野生型植物相比較時(shí)具有增加的種子數(shù)目，或當(dāng)與相應(yīng)的野生型植物相比較時(shí)具有增加的種子大小和種子數(shù)目。
53.根據(jù)權(quán)利要求52的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述植物或植物細(xì)胞來(lái)源于為單子葉植物或雙子葉植物的植物。
54.根據(jù)權(quán)利要求53的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述植物是十字花科、禾本科、錦葵科或豆科-蝶形花亞科的成員。
55.根據(jù)權(quán)利要求54的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述植物是卡諾拉油菜、玉米、亞麻薺、棉花、苜蓿、大豆、小麥、稻或大麥。
56.根據(jù)權(quán)利要求55的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述植物是卡諾拉油菜或大豆。
57.根據(jù)權(quán)利要求53的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述單子葉植物是稻、燕麥、玉米或小麥。
58.根據(jù)權(quán)利要求57的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述植物是十字花科、錦葵科或豆科-蝶形花亞科的成員。
59.根據(jù)權(quán)利要求53的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述雙子葉植物是大豆、棉花、亞麻薺、苜?；蚩ㄖZ拉油菜。
60.根據(jù)權(quán)利要求52-59中任一項(xiàng)的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述植物是全植物、植物器官、種子、植物細(xì)胞或其后代。
61.根據(jù)權(quán)利要求60的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述植物器官是葉、莖、花或根。
62.根據(jù)權(quán)利要求60的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述植物細(xì)胞是組織培養(yǎng)細(xì)胞。
63.用于選擇當(dāng)與早期特異性胚胎啟動(dòng)子功能性地相結(jié)合時(shí)增加植物產(chǎn)量的基因的方法，其包括 構(gòu)建表達(dá)載體，所述表達(dá)載體包含與早期特異性胚胎啟動(dòng)子功能性地相結(jié)合的與植物生長(zhǎng)和/或發(fā)育相關(guān)的基因； 用所述表達(dá)載體轉(zhuǎn)染植物細(xì)胞以形成轉(zhuǎn)基因植物； 培養(yǎng)所述轉(zhuǎn)基因植物；和 在當(dāng)與野生型植物相比較時(shí)具有增加的產(chǎn)量的轉(zhuǎn)基因植物中選擇生長(zhǎng)和/或發(fā)育相關(guān)基因O
64.根據(jù)權(quán)利要求63的方法，其中所述生長(zhǎng)和/或發(fā)育相關(guān)基因是CAP(環(huán)化酶相關(guān)蛋白)基因、稻組蛋白脫乙酰酶I基因、E2Fc基因、BKI基因、BRIl基因、ARL (Argos-Like)基因、bril (油菜素類固醇激素感受)基因、FATB基因、Pepino基因、RGS (G蛋白信號(hào)傳導(dǎo)調(diào)節(jié)劑)基因、TIPl基因、BB (Big fcother)基因、RHD2基因、INCW2基因、MNl基因、WAK2基因、WAK4基因或AP2基因。
65.根據(jù)權(quán)利要求63的方法，其中所述早期特異性胚胎啟動(dòng)子是與氨基酸通透酶基因(AAP1)、油酸12-羥化酶去飽和酶基因、2S2白蛋白基因(2S2)、脂肪酸延長(zhǎng)酶基因(FAEl)或葉狀子葉基因(LEC2)相關(guān)的啟動(dòng)子。
66.根據(jù)權(quán)利要求63的方法，其中所述AAPl啟動(dòng)子是來(lái)自擬南芥的AAPl啟動(dòng)子，所述油酸12-輕化酶去飽和酶啟動(dòng)子是來(lái)自Lesquerella fendleri的油酸12-輕化酶去飽和酶基因啟動(dòng)子(LFAH12)，所述2S2基因啟動(dòng)子來(lái)自擬南芥，所述脂肪酸延長(zhǎng)酶基因啟動(dòng)子來(lái)自擬南芥，或所述葉狀子葉基因啟動(dòng)子來(lái)自擬南芥。
全文摘要
本發(fā)明提供了用于增加植物中的種子大小和/或種子數(shù)目的方法和組合物。特別地，提供了用于在胚胎發(fā)育期間過(guò)量表達(dá)植物生長(zhǎng)和/或發(fā)育相關(guān)或關(guān)聯(lián)基因的方法和組合物。用遺傳構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植物提供了在田間產(chǎn)生更大和/或更多種子的成熟植物，所述遺傳構(gòu)建體具有在早期特異性胚胎啟動(dòng)子控制下的植物生長(zhǎng)和/或發(fā)育相關(guān)基因。還提供了用于選擇生長(zhǎng)和發(fā)育相關(guān)基因的方法，所述生長(zhǎng)和發(fā)育相關(guān)基因提供具有更高產(chǎn)量表型的轉(zhuǎn)基因植物。
文檔編號(hào)C12N15/82GK102839191SQ201210347079
公開日2012年12月26日 申請(qǐng)日期2006年12月15日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月15日
發(fā)明者J·德羅徹, T·恩谷彥 申請(qǐng)人:目標(biāo)栽培公司