專利名稱：ath-eTM160在抑制microRNA160功能中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種ath_eTM160及其在抑制microRNA160功能中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
MicroRNA(miRNA)是一類重要的小分子RNA，它們參與調(diào)控植物的生長發(fā)育以及脅迫反應(yīng)等多個(gè)途徑。在植物中，miRNA主要通過降解靶基因的方式發(fā)揮作用。首先，成熟的miRNA通過堿基互補(bǔ)匹配的方式與靶基因結(jié)合，然后引起結(jié)合位置靶基因mRNA的切割(切割主要發(fā)生在互補(bǔ)區(qū)域的10與11位之間)，進(jìn)而導(dǎo)致靶基因的降解。最近，有研究者報(bào)道了一個(gè)IPSl基因，雖然該基因能部分的與miR399序列互補(bǔ)匹配，但在切割位置上IPSl形成3個(gè)堿基的凸起，該凸起使IPSl不能被miR399切割，也就不能被降解。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)高表達(dá)IPSl時(shí)，其與miR399結(jié)合，這導(dǎo)致miR399不能與其靶基因結(jié)合，進(jìn)而使其靶基因不受miR399調(diào)控。IPSl被稱為內(nèi)源的模擬祀基因(endogenous Target Mimic-eTM)。IPSl可以作為抑制miR399的工具，應(yīng)用于miR399的相關(guān)研究。而其它miRNA的內(nèi)源模擬靶基因未見報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種ath_eTM160及其在抑制microRNA160功能中的應(yīng)用。本發(fā)明提供的DNA分子，為一種內(nèi)源DNA分子，命名為ath_eTM160，其為如下
(1)-(3)中任——種的DNA分子
(I)序列表中的序列I自5'末端第8-187位核苷酸所示的DNA分子；(2)在嚴(yán)格條件下與(I)限定的DNA序列雜交且具有相同功能的DNA分子；(3)與(I)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且具有相同功能的DNA分子。上述嚴(yán)格條件可為如下在6父33(，0.5%303的溶液中，在65° C下雜交，然后用2 X SSC, O. 1%SDS 和 I X SSC, O. 1%SDS 各洗膜一次。含有上述DNA分子的重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。上述重組載體為將上述DNA分子插入表達(dá)載體中，得到的重組載體。在本發(fā)明的實(shí)施例中，重組載體為序列表中的序列I自5'末端第8-187位核苷酸插入pCAMBIA1300的Xba I和Sac I酶切位點(diǎn)間得到的載體擴(kuò)增上述DNA分子的全長或其任意片段的引物對也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。上述DNA分子或上述重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌在調(diào)控植物中microRNA160表達(dá)或其靶基因表達(dá)或改變植物葉片形狀中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍；其中，所述microRNA160的核苷酸序列為序列表中的序列5。上述應(yīng)用中，所述microRNA160的靶基因?yàn)锳RF10、ARF16和/或ARF17。ARFlO的核苷酸序列為序列表中的序列2 ；ARF16的核苷酸序列為序列表中的序列3 ；ARF17的核苷酸序列為序列表中的序列4。上述應(yīng)用中，所述調(diào)控植物中microRNA160表達(dá)為抑制植物中microRNA160表達(dá)；所述調(diào)控植物中microRNA1 60靶基因表達(dá)為提高植物中microRNA160靶基因表達(dá)；所述改變植物葉片形狀為增強(qiáng)植物葉片邊緣鋸齒化；所述植物具體為雙子葉植物或單子葉植物，所述雙子葉植物進(jìn)一步具體為擬南芥。上述抑制植物中microRNA160表達(dá)通過提高目的植物中microRNA160表達(dá)實(shí)現(xiàn)。上述應(yīng)用為將上述DNA分子導(dǎo)入目的植物，得到轉(zhuǎn)基因植物；所述轉(zhuǎn)基因植物具有如下I) -3)中至少一種特征I)所述轉(zhuǎn)基因植物中microRNA160表達(dá)量低于所述目的植物；2)所述轉(zhuǎn)基因植物中microRNA160的靶基因ARF10、ARF16和/或ARF17表達(dá)量均高于所述目的植物；3)所述轉(zhuǎn)基因植物葉片邊緣鋸齒化。上述DNA分子通過上述重組載體導(dǎo)入目的植物中。上述應(yīng)用中，所述目的植物為雙子葉植物或單子葉植物，所述雙子葉植物具體為擬南芥。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明在擬南芥中獲得一段DNA分子ath_eTM160，將其轉(zhuǎn)入擬南芥中過表達(dá)，發(fā)現(xiàn)其可以抑制擬南芥中microRNA160的表達(dá),且同時(shí)提高microRNA160靶基因的表達(dá)，也同時(shí)呈現(xiàn)葉片鋸齒形加重。因此，該基因可以作為內(nèi)源工具來調(diào)控microRNA160 的功能。


圖I 為 PCR 擴(kuò)增得到 ath_eTM160圖2為轉(zhuǎn)基因擬南芥的PCR鑒定圖3為擬南芥ath_eTM160抑制mi croRNA160的功能
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。實(shí)施例I、ath_eTM160基因的獲得I、擬南芥總RNA的提取I) Trizol 法提取(I)取適量野生型擬南芥(Arabidopsis thaliana,購自ABRC,美國)材料(O. Ig)加入液氮研磨15min，至粉末狀，將粉末倒入2mL離心管(約占1/2管)，然后立即加入ImLTrizol試劑。將粉末與Trizol試劑混勻,在室溫下孵育5min,以便核酸蛋白復(fù)合體完全解離。(2)將離心管于 4°C 12000rpm 離心 15min。(3)將上清液轉(zhuǎn)移到新的2mL離心管中，并向其中加入等體積O. 5ml氯仿，手動(dòng)劇烈振蕩管體15s后，室溫靜至3min。
(4)將離心管于 4°C 12000rpm 離心 15min。(5)將上層的水相轉(zhuǎn)移至新的離心管中，向其中加入等體積的異丙醇以沉淀RNA?；靹蚝?，于一 20°C靜置lOmin。(6)將離心管于 4°C 12000rpm 離心 lOmin。(7)倒掉上清液，加入ImL 75%乙醇清洗RNA沉淀，振蕩后，4 °C 12000rpm離心3min。(8)除去乙醇溶液，在超凈臺(tái)吹干。(9)加入20 μ I不含RNA酶的水溶解沉淀，得到RNA溶液。2) RNA 的純化(除 DNA) (I)將RNA溶液加水至39 μ 1，按下表加入其余試劑，混勻。
權(quán)利要求
1.一種DNA分子，為如下(I)-(3)中任--種的DNA分子 (1)序列表中的序列I自5'末端第8-187位核苷酸所示的DNA分子； (2)在嚴(yán)格條件下與(I)限定的DNA序列雜交且具有相同功能的DNA分子； (3)與(I)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且具有相同功能的DNA分子。
2.含有權(quán)利要求I所述DNA分子的重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌。
3.如權(quán)利要求2所述的重組載體，其特征在于所述重組載體為將權(quán)利要求I所述DNA分子插入表達(dá)載體中，得到的重組載體。
4.擴(kuò)增權(quán)利要求I所述DNA分子的全長或其任意片段的引物對。
5.權(quán)利要求I所述DNA分子或權(quán)利要求2所述重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌在調(diào)控植物中microRNA160表達(dá)或調(diào)控植物中microRNA160靶基因表達(dá)或改變植物葉片形狀中的應(yīng)用；所述microRNA160的核苷酸序列為序列表中的序列5。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于所述microRNA160的靶基因?yàn)锳RF10、ARF16 和 / 或 ARF17。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的應(yīng)用，其特征在于所述調(diào)控植物中microRNA160表達(dá)為抑制植物中microRNA160表達(dá)；所述調(diào)控植物中microRNA160靶基因表達(dá)為提高植物中microRNA160靶基因表達(dá)；所述改變植物葉片形狀為增強(qiáng)植物葉片邊緣鋸齒化；所述植物具體為雙子葉植物或單子葉植物，所述雙子葉植物進(jìn)一步具體為擬南芥。
8.如權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于所述應(yīng)用為將權(quán)利要求I所述DNA分子導(dǎo)入目的植物，得到轉(zhuǎn)基因植物； 所述轉(zhuǎn)基因植物具有如下I) -3)中至少一種特征 1)所述轉(zhuǎn)基因植物中microRNA160表達(dá)量低于所述目的植物； 2)所述轉(zhuǎn)基因植物中microRNA160的靶基因ARF10、ARF16和/或ARF17表達(dá)量均高于所述目的植物； 3)所述轉(zhuǎn)基因植物葉片邊緣鋸齒化。
9.如權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于權(quán)利要求I所述DNA分子通過權(quán)利要求2所述重組載體導(dǎo)入目的植物中。
10.如權(quán)利要求8或9所述的應(yīng)用，其特征在于 所述目的植物為雙子葉植物或單子葉植物，所述雙子葉植物具體為擬南芥。
全文摘要
本發(fā)明公開了ath-eTM160在抑制microRNA160功能中的應(yīng)用。本發(fā)明提供的DNA分子，為如下(1)-(3)中任一一種的DNA分子(1)序列表中的序列1自5′末端第8-187位核苷酸所示的DNA分子；(2)在嚴(yán)格條件下與(1)限定的DNA序列雜交且具有相同功能的DNA分子；(3)與(1)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且具有相同功能的DNA分子。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，在擬南芥中獲得一段基因ath-eTM160，將其轉(zhuǎn)入擬南芥中過表達(dá)，發(fā)現(xiàn)其可以抑制擬南芥中microRNA160的表達(dá)。
文檔編號(hào)C12N15/113GK102864146SQ20121034820
公開日2013年1月9日 申請日期2012年9月18日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月18日
發(fā)明者王秀杰, 王猛, 吳華君, 王志敏 申請人:中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所