軍團(tuán)菌dna提取試劑盒及提取軍團(tuán)菌dna的方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及一種臨床樣本及環(huán)境水樣本中軍團(tuán)菌DNA提取方法及提取試劑盒。即通過(guò)疊氮鈉、Chelex-100溶液，使標(biāo)本中的蛋白質(zhì)變性，在蛋白酶K充分消化作用后，通過(guò)Chelex-100將非核酸有機(jī)物螯合，再離心除去Chelex顆粒，使其它雜質(zhì)與DNA分離，從而將上清DNA溶解在三羥甲基氨甲烷鹽酸鹽和乙二胺四乙酸溶液中，DNA得以純化回收。本發(fā)明的方法可以在較短時(shí)間內(nèi)同時(shí)提取多個(gè)樣品，正常工作時(shí)間小于60min，獲得適合后續(xù)分子生物學(xué)分析的DNA樣品。本發(fā)明方法建立的試劑盒獲得的DNA樣品純度高，且在單管操作，可有效避免因轉(zhuǎn)換而引起的污染，成本低廉，使用范圍廣泛。
【專(zhuān)利說(shuō)明】軍團(tuán)菌DNA提取試劑盒及提取軍團(tuán)菌DNA的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于基因組DNA分離純化【技術(shù)領(lǐng)域】，具體是一種基因組DNA試劑盒及其用于快速?gòu)呐R床標(biāo)本及環(huán)境水樣本中提取軍團(tuán)菌DNA的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]軍團(tuán)菌是一種兼性胞內(nèi)寄生菌，是引起人類(lèi)軍團(tuán)菌病的重要病原體。近年來(lái)，軍團(tuán)菌病在世界各地時(shí)有爆發(fā)流行，我國(guó)已將其例入14種新發(fā)傳染病之一。據(jù)國(guó)外報(bào)道，院內(nèi)不明原因肺炎感染有10%是由軍團(tuán)菌引起。目前已知軍團(tuán)菌雖有52個(gè)種，70多個(gè)血清型。因此，軍團(tuán)菌的鑒定對(duì)于軍團(tuán)菌病診斷具有重大價(jià)值。
[0003]DNA的提取是分子生物學(xué)研究的基礎(chǔ)技術(shù)，提取的DNA的純度及結(jié)構(gòu)完整性是進(jìn)行細(xì)菌分子生物學(xué)研究的基礎(chǔ)。軍團(tuán)菌的鑒定主要依靠分子分型檢測(cè)技術(shù)，主要包括傳統(tǒng)的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)電泳及探針雜交檢測(cè)方法、擴(kuò)增長(zhǎng)度多態(tài)性分析(AFLP)、限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析(RFCP)、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性分析(RAPD)、限制性酶切分析、DNA測(cè)序分析等。但以上的檢測(cè)方法均需要高質(zhì)量DNA的提取。目前，細(xì)菌基因組DNA提取方法常見(jiàn)的有堿裂解法、Chelex-1OO法、溶菌酶法、煮沸法及SDS裂解法等，而Chelex-100法、煮沸法作為一種簡(jiǎn)單有效地快速DNA提取方法，廣泛應(yīng)用于細(xì)菌DNA的提取，但常規(guī)的Chelex-1OO法、煮沸法在處理臨床標(biāo)本時(shí)都具有一定的局限性。本發(fā)明對(duì)傳統(tǒng)的Chelex-100法、煮沸法加以改良，建立了一種有效地軍團(tuán)菌及及其他病原菌的快速簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)適用并能滿(mǎn)足臨床需要的基因組DNA提取方法及提取 試劑盒。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種快速?gòu)呐R床標(biāo)本及環(huán)境水樣標(biāo)本中獲得軍團(tuán)菌基因組DNA的方法，并提供成套的軍團(tuán)菌基因組DNA提取試劑盒。
[0005]為了實(shí)現(xiàn)以上目的，本發(fā)明提供一種軍團(tuán)菌DNA提取試劑盒，包括DNA提取液，所述提取液由0.1~0.3%疊氮鈉、5~10%Chelex-100溶液、8~12mM三羥甲基氨甲烷鹽酸、
0.1~0.3mM乙二胺四乙酸二鈉、100~200 μ g/ml蛋白酶K組成。
[0006]同時(shí)，本發(fā)明還提供一種提取軍團(tuán)菌DNA的方法，包括以下步驟，
[0007]先配置200ml的DNA提取液:稱(chēng)取三羥甲基氨甲烷鹽酸0.24g，加無(wú)菌水至100ml，混合溶解；再加濃鹽酸10 μ 1，調(diào)Ph值至8.3 ;加乙二胺四乙酸二鈉7.5mg混合溶解；再加疊氮鈉0.2g,加無(wú)菌水至200ml ;最后再加入IOg的Chelex-100溶液和40mg的蛋白酶K,充分混合后，于-20°C保存；
[0008]再提取軍團(tuán)菌DNA:向濃縮處理的待提取樣品中加入50~100 μ I的DNA提取液，充分混勻，置于55°C水浴30min，100°C水浴lOmin，置于13000rpm離心3min，取上清即為提取的軍團(tuán)菌基因組DNA。
[0009]本發(fā)明使用疊氮鈉、Chelex-100溶液，最大程度的使臨床標(biāo)本及環(huán)境水樣標(biāo)本中的蛋白質(zhì)變性，在蛋白酶K充分消化作用后，利用Chelex-100除去非核酸有機(jī)物，再離心除去Chelex顆粒，使其它雜質(zhì)與DNA分離。從而將上清DNA溶解在三羥甲基氨甲烷鹽酸鹽和乙二胺四乙酸溶液中，使DNA得以純化回收。
[0010]根據(jù)本發(fā)明的方法建立的試劑盒可以在60min時(shí)間內(nèi)同時(shí)提取多個(gè)樣品，獲得的DNA可直接用于后續(xù)分子生物學(xué)分析，不僅可用于軍團(tuán)菌基因組DNA的提取，也可用于其他病原細(xì)菌基因組DNA的提取，具有廣闊的應(yīng)用前景。
[0011]本發(fā)明根據(jù)上述方法配置的DNA提取液，通過(guò)一系列優(yōu)化建立的軍團(tuán)菌基因組DNA提取試劑盒，其主要優(yōu)點(diǎn)如下:
[0012](I)無(wú)需專(zhuān)門(mén)抽提蛋白質(zhì)、沉淀DNA、洗滌DNA和溶解DNA，所用試劑少，提取成本低
廉
MTv ο
[0013](2)單管操作，提取過(guò)程中不需要更換基因組DNA的器皿，可有效避免交叉污染。
[0014](3)試劑盒配置簡(jiǎn)單，操作方法簡(jiǎn)單快速。
[0015](4)使用范圍廣泛，除軍團(tuán)菌外，對(duì)其他細(xì)菌基因組DNA的提取也有很好的效果?！揪唧w實(shí)施方式】
[0016]本發(fā)明從臨床標(biāo)本及環(huán)境水樣本中提取軍團(tuán)菌基因組DNA為具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。
[0017]1、軍團(tuán)菌DNA提取試劑盒的制備
[0018]
【權(quán)利要求】
1.一種軍團(tuán)菌DNA提取試劑盒，包括DNA提取液，其特征在于:所述提取液由0.1~0.3%疊氮鈉、5~10%Chelex-100溶液、8~12mM三羥甲基氨甲烷鹽酸、0.1~0.3mM乙二胺四乙酸二鈉、100~200μ g/ml蛋白酶K組成。
2.一種提取軍團(tuán)菌DNA的方法，其特征在于，包括以下步驟: 先配置200ml的DNA提取液:稱(chēng)取三羥甲基氨甲烷鹽酸0.24g，加無(wú)菌水至100ml，混合溶解；再加濃鹽酸10μ 1，調(diào)ph值至8.3 ;加乙二胺四乙酸二鈉7.5mg混合溶解；再加疊氮鈉0.2g,加無(wú)菌水至200ml ;最后再加入IOg的Chelex-1OO溶液和40mg的蛋白酶K,充分混合后，于_20°C保存。 再提取軍團(tuán)菌DNA:向濃縮處理的待提取樣品中加入50~100 μ I的DNA提取液，充分混勻，置于55°C水浴30min，100°C水浴lOmin，置于13000rpm離心3min，取上清即為提取的軍團(tuán)菌基因組DNA。`
【文檔編號(hào)】C12N15/10GK103509785SQ201210349441
【公開(kāi)日】2014年1月15日 申請(qǐng)日期:2012年9月18日 優(yōu)先權(quán)日:2012年9月18日
【發(fā)明者】朱慶義, 胡朝暉, 趙利偉 申請(qǐng)人:上海金域醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所有限公司