專利名稱：耐表面活性劑的纖維素酶及其修飾方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種修飾 具有內(nèi)切葡聚糖酶活性的蛋白(特別是屬于家族45并具有內(nèi)切葡聚糖酶活性的纖維素酶)的N-末端為焦谷氨酸，從而使其成為在表面活性劑時(shí)內(nèi)切葡聚糖酶活性降低很小的纖維素酶的方法，并涉及該纖維素酶。
背景技術(shù)：
纖維素是自然資源中最豐富的資源，因此可有效分解纖維素的纖維素酶系統(tǒng)在各個(gè)領(lǐng)域具有廣泛用途。在本發(fā)明過程中，純化和測(cè)定了多種纖維素酶，進(jìn)一步，克隆了多種纖維素酶的基因，并通過序列同源性分析而進(jìn)行家族分類(參見非專利參考文獻(xiàn)I)。另一方面，根據(jù)其性質(zhì)，可將纖維素酶應(yīng)用于多個(gè)工業(yè)領(lǐng)域，特別是紡織品加工領(lǐng)域。例如，纖維素酶處理可改善含纖維素的織物的手感和/或外觀，或通過“酵素洗滌”，賦予含纖維素的有色織物“石磨”外觀，從而使織物的色彩局部性變化。另外，在萊塞爾加工過程中，可用纖維素酶除去加工過程中在織物表面產(chǎn)生的絨毛。在本文中，萊塞爾是一種來源于木漿的再生纖維素織物，最近由于其本身特性，例如高強(qiáng)度或吸水性，并且其生產(chǎn)過程造成的環(huán)境污染小而倍受關(guān)注。目前認(rèn)為纖維素酶是通過多個(gè)酶的共同作用，例如協(xié)同作用來分解纖維素的。在由多個(gè)酶組成的纖維素酶組中含有可降低織物韌性的酶等不適于紡織品加工領(lǐng)域的酶。因此，需要通過蛋白分離技術(shù)和/或基因工程技術(shù)從纖維素酶組中分離適于紡織品加工的酶組分，并生產(chǎn)這些酶組分。特別地，對(duì)來源于絲狀真菌例如木霉屬(Trichoderma)或腐質(zhì)霉屬(Humicola)的微生物的纖維素酶已進(jìn)行了深入研究。例如，已分離到腐質(zhì)霉屬中的纖維素酶組分CBH 1、EG V(參見專利文獻(xiàn)I)、NCE2、NCE4和NCE5，及木霉屬中的CBH 1、CBH
I1、EG II和EG III等，因此，可通過基因工程技術(shù)制備過表達(dá)的酶或單一組分的酶等，從而來生產(chǎn)含一種或多種特定的纖維素酶組分為主要組分，適于不同目的的纖維素酶制品。另外，已表明屬于家族45的纖維素酶，例如NCE4 (參見專利文獻(xiàn)2)、NCE5 (參見專利文獻(xiàn)3)、RCEl (參見專利文獻(xiàn)4)或STCEl (參見國(guó)際專利申請(qǐng)PCT/JP2004/15733)在上述領(lǐng)域是非常有用的。另一方面，當(dāng)纖維素酶用于衣物洗滌劑時(shí)，則不僅要改善纖維素酶組分的量，而且要改善其性質(zhì)。更具體地，衣物洗滌劑含多種表面活性劑，而且將其溶解于水所獲得的溶液是堿性的(pH10-pH 11)。因此，包含在衣物洗滌劑中的纖維素酶要在堿性條件下可耐受多種表面活性劑的作用。Otzen, D.E.等人已報(bào)道向來源于Humicola insolens的Cel45的內(nèi)部氨基酸序列中引入一個(gè)突變，可使其在PH7，存在線性烷基苯磺酸鹽(LAS)的條件下表現(xiàn)出約3.3倍于野生型Cel45的活性(參見非專利文獻(xiàn)2)。但由該突變提供的在存在表面活性劑時(shí)抑制活性降低的作用僅限于Cel45或其同源蛋白，并不適于與Cel45同源性較低的，屬于家族45的內(nèi)切葡聚糖酶。(專利文獻(xiàn)I)國(guó)際專利W091/17243(專利文獻(xiàn)2)國(guó)際 專利W098/03667(專利文獻(xiàn)3)國(guó)際專利W001/90375(專利文獻(xiàn)4)國(guó)際專利W000/24879非專利文獻(xiàn) 1:Henrissat B., Bairoch A.Updating the sequence-bas edclassification of glycosyl hydrolases.Biochem.J.316:695-696 (1996)非專利文獻(xiàn)2:Daniel E.0tzen, Lars Christiansen, Martin Schulein.Acomparative study of the unfolding of the endoglucanase Cel45 from Humicolainsolens in denaturant and surfactant.Protein Sc1.8:1878-1887 (1999)發(fā)明描述本發(fā)明要解決的問題本發(fā)明的一個(gè)目標(biāo)是提供將具有內(nèi)切葡聚糖酶活性的蛋白(特別是屬于家族45，并具有內(nèi)切葡聚糖酶活性的蛋白)轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂袃?nèi)切葡聚糖酶活性，而且其活性在存在表面活性劑時(shí)降低很小的蛋白的方法；該方法中使用的載體；具有內(nèi)切葡聚糖酶活性，而且其活性在存在表面活性劑時(shí)降低很小的蛋白；及其編碼多核苷酸。本發(fā)明的另一個(gè)目標(biāo)是用上述微生物提供一種可有效地生產(chǎn)用于洗滌衣物的酶蛋白的微生物。解決問題的方法本發(fā)明人進(jìn)行了廣泛研究，發(fā)現(xiàn)將焦谷氨酸(以下有時(shí)以PQ表示)或含PQ的肽加到屬于家族45，并具有內(nèi)切葡聚糖酶活性的蛋白的N末端的蛋白，例如N末端添加型纖維素酶，與野生型纖維素酶相比較，其內(nèi)切葡聚糖酶活性在表面活性劑存在時(shí)沒有顯著降低。在存在陰離子表面活性劑時(shí)保持高內(nèi)切葡聚糖酶活性的性質(zhì)對(duì)用于衣物洗滌的酶來說是非常有用的，但沒有發(fā)現(xiàn)這樣的纖維素酶。另外，也沒有關(guān)于通過添加焦谷氨酸或含焦谷氨酸的肽而在存在表面活性劑時(shí)保持酶活性的作用的報(bào)道。本發(fā)明的另一個(gè)方面是關(guān)于所有N末端未被保護(hù)而在存在表面活性劑時(shí)保持酶活性的纖維素酶，可通過向纖維素酶中加入焦谷氨酸或含焦谷氨酸的肽來抑制在表面活性劑存在時(shí)活性降低。可添加焦谷氨酸或含焦谷氨酸的肽的纖維素酶無特別的限定，但優(yōu)選屬于家族45的纖維素酶。因此，本發(fā)明包括以下方面:1) 一種抑制在存在表面活性劑時(shí)內(nèi)切葡聚糖酶活性降低的方法，其特征在于修飾具有內(nèi)切葡聚糖酶活性、而N末端不是焦谷氨酸的蛋白的N末端，使其成為N末端具有焦谷氨酸的蛋白；(2) (I)中的方法，其中通過向具有內(nèi)切葡聚糖酶活性、而N末端不是焦谷氨酸的蛋白的N末端加入焦谷氨酸或可轉(zhuǎn)變?yōu)榻构劝彼岬陌被?，或N末端含有焦谷氨酸或可轉(zhuǎn)變?yōu)榻构劝彼岬陌被岬碾膩磉M(jìn)行修飾；(3)(1)中的方法，其中通過用焦谷氨酸或可轉(zhuǎn)變?yōu)榻构劝彼岬陌被幔騈末端含有焦谷氨酸或可轉(zhuǎn)變?yōu)榻构劝彼岬陌被岬碾奶鎿Q具有內(nèi)切葡聚糖酶活性、而N末端不是焦谷氨酸的蛋白的N末端氨基酸或包含N末端的區(qū)域來進(jìn)行修飾；(4) (1)到(3)任一項(xiàng)中的方法，其中具有內(nèi)切葡聚糖酶活性、而N末端不是焦谷氨酸的蛋白是屬于家族45的纖維素酶；(5) 一種具有內(nèi)切葡聚糖酶活性的修飾蛋白，其N末端氨基酸通過氨基酸修飾轉(zhuǎn)變?yōu)榻构劝彼幔?6) (5)中的修飾蛋白，其是通過⑴到⑷任一項(xiàng)中的方法獲得的；(7) 一種從以下組中選擇的蛋白:(a)包含SEQ ID NO:2、4、38或40所示的氨基酸序列的蛋白；(b)包含在SEQ ID NO:2、4、38或40所示的氨基酸序列中缺失、替換、插入或添加一個(gè)或多個(gè)氨基酸所得的氨基酸序列，而且其內(nèi)切葡聚糖酶活性在存在表面活性劑時(shí)降低很小的修飾蛋白 '及(C)同源蛋白，其氨基酸序列與包含SEQ ID NO:2、4、38或40所示的氨基酸序列的蛋白的同源性至少為85%，并且，其內(nèi)切葡聚糖酶活性在存在表面活性劑時(shí)降低很?。?8)編碼(5)到(7)任一項(xiàng)中的蛋白的多核苷酸；(9)從以下組中選擇的多核苷酸:(a)包含SEQ ID NO:1、3、37或39所示的核酸序列的多核苷酸；(b)包含在SEQ ID NO:1、3、37或39所示的核酸序列中缺失、替換、插入或添加一個(gè)或多個(gè)堿基所得的堿基序列，而且其所編碼蛋白的內(nèi)切葡聚糖酶活性在存在表面活性劑時(shí)降低很小的多核苷酸；及(c)與SEQ ID NO:1、3、37或39所示的核酸序列在嚴(yán)緊條件下雜交，而且編碼內(nèi)切葡聚糖酶活性在存在表面活性劑時(shí)降低很小的蛋白的多核苷酸；(10)含⑶或(9)所述的多核苷酸的表達(dá)載體；(11)用(10)所述的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞；(12) (11)所述的宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞是酵母或絲狀真菌；(13) (12)所述的宿主細(xì)胞,其中，所述絲狀真菌是屬于腐質(zhì)霉屬(Humicola)或木霉屬的微生物；(14) (13)中的宿主細(xì)胞,其中，所述絲狀真菌是Humicola insolens或綠色木霉(Trichoderma viride)；(15) 一種生產(chǎn)(5)到(7)中任何一種蛋白的方法，包括:培養(yǎng)(11)到(14)任一項(xiàng)中的宿主細(xì)胞，從培養(yǎng)的宿主細(xì)胞或培養(yǎng)物中回收蛋白；及(16) 一種由(15)所述的方法產(chǎn)生的蛋白。發(fā)明效果根據(jù)本發(fā)明可有效產(chǎn)生用于衣物洗滌，而且其內(nèi)切葡聚糖酶活性在存在表面活性劑時(shí)降低很小的新型纖維素酶。發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案屬于家族45并具有內(nèi)切葡聚糖酶活性的蛋白(此后有時(shí)指“屬于家族45的纖維素酶”)家族45此處所用術(shù)語(yǔ)“家族45”是指根據(jù)Henrissat B.等人.關(guān)于碳水化合物活性酶的疏水簇分析而劃分為家族45的蛋白[Henrissat B., Bairoch A.Updatingthe sequence-based classification of glycosyl hydrolases.Biochem.J.316:695-696(1996)]。具有內(nèi)切葡聚糖酶活性的蛋白此處所用術(shù)語(yǔ)“具有內(nèi)切葡聚糖酶活性的蛋白”是指具有內(nèi)切葡聚糖酶活性的酶，例如內(nèi)切-1，4-β-葡聚糖酶伍03.2.1.4)，它可水解β-1，4-葡聚糖中的β_1，4_吡喃型葡萄糖基鍵。表面活性劑此處所用術(shù)語(yǔ)“表面 活性劑”是一種含在衣物洗滌劑中的洗滌劑成分，可廣泛地分為陰離子、陽(yáng)離子和非離子表面活性劑。通常使用的是陰離子表面活性劑。本發(fā)明中所用的優(yōu)選陰離子表面活性劑可以是，例如線性烷基苯磺酸鹽(以下有時(shí)以LAS表示)。內(nèi)切葡聚糖酶活性此處所用術(shù)語(yǔ)“內(nèi)切葡聚糖酶(以下以“EGU”表示)活性”定義為通過以下流程測(cè)定的羧甲基纖維素溶液粘度的降低而得到的酶活性。更具體地，作為底物溶液，將羧甲基纖維素(Hercules)溶解在0.lmol/L的Tris-HCl緩沖液(ρΗΙΟ.0)中，使終濃度為3.5%.預(yù)先將底物溶液(5mL)在40°C加熱10分鐘，然后加入0.15mL酶溶液，將整個(gè)溶液混勻，在40°C反應(yīng)30分鐘。通過R型粘度計(jì)(RE 100 ；T0KI SANGYO C0.，LTD.)在40°C測(cè)定混合液的粘度?！癐單位”酶活性定義為在每個(gè)反應(yīng)條件下，將最初粘度降低到1/2所用的酶量。使用的陰離子表面活性劑是線性烷基苯磺酸鹽(Wako Pure Chemical Industries, C0., Ltd.),將其加到羧甲基纖維素溶液中，至終濃度為800ppm。存在表面活性劑時(shí)內(nèi)切葡聚糖酶活性降低的抑制此處所用術(shù)語(yǔ)“存在表面活性劑時(shí)其內(nèi)切葡聚糖酶活性降低較小“是指將其N末端根據(jù)本發(fā)明進(jìn)行修飾的蛋白(N末端修飾型蛋白)與修飾前的原始蛋白(以下簡(jiǎn)稱為原始蛋白)在存在表面活性劑時(shí)，對(duì)其內(nèi)切葡聚糖酶活性進(jìn)行比較，N末端修飾型蛋白的內(nèi)切葡聚糖酶活性比原始蛋白高。原始蛋白本發(fā)明方法中所用的原始蛋白并無特別限定，只要N末端是除焦谷氨酸外的氨基酸，并具有內(nèi)切葡聚糖酶活性的蛋白即可。原始蛋白優(yōu)選地可以包括，例如纖維素酶(例如，內(nèi)切葡聚糖酶、纖維二糖水解酶或葡萄糖苷酶)，及屬于家族45的纖維素酶。在本文中，只要原始蛋白至少具有內(nèi)切葡聚糖酶活性即可，因此可以是只具有內(nèi)切葡聚糖酶活性的蛋白，或具有除內(nèi)切葡聚糖酶活性外其它一種或多種酶活性的蛋白。另外，原始蛋白可以是天然蛋白或經(jīng)遺傳修飾的蛋白。屬于家族45的纖維素酶的來源 屬于家族45的纖維素酶可通過基因工程技術(shù)，例如重組DNA技術(shù)或多肽合成技術(shù)產(chǎn)生，或從分離的野生型菌株獲得。另外，纖維素酶包括屬于家族45的野生型纖維素酶的突變體。屬于家族45的纖維素酶可從微生物，例如絲狀真菌或接合菌獲得。絲狀真菌包括，例如屬于腐質(zhì)霉屬(例如Humicola insolens)、木霉屬(例如綠色木霉)、圓孢霉屬(例如 Staphylotrichum coccosporum)或 Myriococcum(例如 Myriococcum thermophilum)的微生物。更具體地，來源于腐質(zhì)霉屬的纖維素酶包括，例如CBH 1、EG V、NCE2、NCE4或NCE5等；來源于木霉屬的纖維素酶包括，例如CBH 1、CBH I1、EG II和EG III等；來源于Staphylotrichum屬的纖維素酶包括,例如STCEl和STCE3等；及來源于Myriococcum屬的纖維素酶包括，例如MTEl等。接合菌包括,例如屬于根霉屬(Rhizopus)(例如米曲霉(Rhizopus oryzae))、毛霉屬(Mucor)(例如卷枝毛霉(Mucor circinelloides))或須霉屬(Phycomyces)(例如閃光須霉(Phycomyces nitens))的微生物。更具體地，包括來源于米曲霉的RCE 1、RCE II或RCE III ;來源于卷枝毛霉的MCEI或MCE II ;或來源于閃光須霉的 PCE I(W000/24879)。焦谷氨酸或含焦谷氨酸的肽此處所用術(shù)語(yǔ)“焦谷氨酸“是指通過成熟蛋白N末端谷氨酰胺或谷氨酸的環(huán)化而產(chǎn)生的焦谷氨酸。焦谷氨酸具有N末端氨基不暴露在外的性質(zhì)?？稍隗w內(nèi)或體外進(jìn)行焦谷氨酸的環(huán)化。體內(nèi)，通過將編碼經(jīng)基因工程設(shè)計(jì)而使成熟蛋白的N末端為谷氨酰胺或谷氨酸的修飾蛋白的多核苷酸在宿主中進(jìn)行表達(dá)，從而得到焦谷氨酸環(huán)化的蛋白。體外，將N末端具有谷氨酰胺或谷氨酸的蛋白用酸性溶液，例如甲酸進(jìn)行處理，從而得到焦谷氨酸環(huán)化的蛋白。此處所用術(shù)語(yǔ)“肽”是 指含一個(gè)或多個(gè)氨基酸，而且氨基酸通過肽鍵聚合的化合物。因此，此處所用術(shù)語(yǔ)“含焦谷氨酸的肽”是指其N末端為焦谷氨酸的肽。含焦谷氨酸的肽包括兩個(gè)或多個(gè)交聯(lián)的氨基酸，例如2到40個(gè)氨基酸，優(yōu)選地為2到30個(gè)氨基酸，更優(yōu)選地為2到20個(gè)氨基酸，更優(yōu)選地為2到10個(gè)氨基酸，更優(yōu)選地為2到5個(gè)氨基酸，最優(yōu)選地為2到4個(gè)氨基酸交聯(lián)。氨基酸并無特別限定，只要他們可被本領(lǐng)域技術(shù)人員用于所述目的即可。在本發(fā)明的方法中，對(duì)將原始蛋白修飾為N末端具有焦谷氨酸的蛋白的方法不進(jìn)行限定，只要可進(jìn)行蛋白修飾即可。這些方法包括，例如基因工程技術(shù)或化學(xué)技術(shù)。根據(jù)基因工程技術(shù)，原始蛋白可通過，例如基因工程水平上的添加和/或替代合適的氨基酸或氨基酸序列而進(jìn)行修飾。在一個(gè)通過基因工程添加的實(shí)施例中，通過向原始蛋白(例如，具有內(nèi)切葡聚糖酶活性，且N末端不是焦谷氨酸的蛋白)的N末端加入焦谷氨酸或N末端含焦谷氨酸的肽而進(jìn)行蛋白修飾。例如，更具體地，通過基因工程技術(shù)進(jìn)行添加的實(shí)施例可包括以下步驟:(1)向編碼原始蛋白的多核苷酸的5’末端添加編碼可轉(zhuǎn)變?yōu)榻构劝彼岬陌被?谷氨酰胺或谷氨酸)的多核苷酸，或編碼N末端具有可轉(zhuǎn)變?yōu)榻构劝彼岬陌被岬亩嚯牡亩嗪塑账?'及(2)在可使N末端氨基酸進(jìn)行焦谷氨酸環(huán)化的宿主中表達(dá)(I)中所得的多核苷酸。在通過基因工程替代的實(shí)施例中，通過將原始蛋白的N末端氨基酸或N末端區(qū)替代為焦谷氨酸或N末端含焦谷氨酸的肽而進(jìn)行蛋白修飾。例如，更具體地，通過基因工程替代的實(shí)施例可包括以下步驟:(1)將編碼原始蛋白的5’末端或含5’末端區(qū)的多核苷酸用編碼可轉(zhuǎn)變?yōu)榻构劝彼岬陌被?谷氨酰胺或谷氨酸)的多核苷酸，或編碼N末端具有可轉(zhuǎn)變?yōu)榻构劝彼岬陌被岬碾牡亩嗪塑账崽娲患?br> (2)在可使N末端氨基酸進(jìn)行焦谷氨酸環(huán)化的宿主中表達(dá)(I)中所得的多核苷酸。使用化學(xué)技術(shù)的實(shí)施例可包括，例如，(a)將焦谷氨酸(或N末端含焦谷氨酸的肽)直接加到原始蛋白的N末端的實(shí)施例；(b)將可轉(zhuǎn)變?yōu)榻构劝彼岬陌被?或N末端具有可轉(zhuǎn)變?yōu)榻构劝彼岬陌被岬碾?通過化學(xué)方法加到原始蛋白N末端，并通過化學(xué)方法進(jìn)行N末端氨基酸焦谷氨酸化的實(shí)施例；或(c)將N末端具有可轉(zhuǎn)變?yōu)榻构劝彼岬陌被岬脑嫉鞍椎腘末端氨基酸通過化學(xué)方法焦谷氨酸化的實(shí)施例。在屬于家族45的纖維素酶的N末端加入焦谷氨酸或合焦谷氨酸的肽的方法修飾方法可通過用屬于家族45的纖維素酶在實(shí)施例中進(jìn)行進(jìn)一步闡述。在屬于家族45的纖維素酶的N末端加入焦谷氨酸或含焦谷氨酸的肽的方法可通過基因工程技術(shù)進(jìn)行。在通常所用的纖維素酶的生產(chǎn)中，編碼所需纖維素酶的多核苷酸的編碼區(qū)可連接到在絲狀真菌等宿主中有功能的啟動(dòng)子和終止子之間，然后將得到的表達(dá)盒轉(zhuǎn)入宿主中。另夕卜，編碼在宿主細(xì)胞中具有分泌功能的信號(hào)肽序列的多核苷酸也可以加到表達(dá)盒中。當(dāng)將表達(dá)盒引入到宿主細(xì)胞中時(shí)，所需的纖維素酶可分泌到培養(yǎng)基中，從而可很容易地收集所需的纖維素酶。在這種情況下，可通過向緊鄰分泌信號(hào)肽序列的下游加入編碼氨基酸的多核苷酸而將所需氨基酸加到纖維素酶的N末端。另外，也可通過用宿主中的分泌信號(hào)序列進(jìn)行N末端氨基酸的氨基基團(tuán)的修飾。例如，在來源于綠色木霉的cbhl或cbh2，或來源于Humicola insolens的NCE2或NCE5中，N末端是焦谷酸化的,這種修飾可通過用來源于這種微生物的分泌信號(hào)序列并在綠色木霉或Humicola insolens中表達(dá)來制備。根據(jù)優(yōu)選實(shí)施例，如上所述制備的屬于家族45的修飾纖維素酶具有在存在表面活性劑時(shí)其內(nèi)切葡聚糖酶活性降低很小的優(yōu)勢(shì)性質(zhì)。根據(jù)另一個(gè)實(shí)施例，整個(gè)序列可根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員常用的技術(shù)進(jìn)行化學(xué)合成。在這種情況下，可用部分天然蛋白進(jìn)行合成。
_3] 本發(fā)明中的蛋白本發(fā)明中的蛋白通過將具有內(nèi)切葡聚糖酶活性的原始蛋白的N末端修飾為焦谷氨酸而進(jìn)行制備(例如，通過獲得屬于家族45的纖維素酶，并向該成熟蛋白的N末端氨基酸中鏈加入焦谷氨酸(PQ)或含焦谷氨酸的肽而制備)，而且其內(nèi)切葡聚糖酶活性在存在表面活性劑時(shí)降低很小。另外，本發(fā)明包括通過上述方法制備的，其內(nèi)切葡聚糖酶活性在存在表面活性劑時(shí)降低很小的蛋白。更具體地，本發(fā)明中的蛋白包括從由以下蛋白組成的組中選擇的蛋白:(a)包含SEQ ID NO:2、4、38或40所示的氨基酸序列的蛋白；(b)含有在SEQ ID NO:2、4、38或40所示的氨基酸序列中缺失、替換、插入或添加一個(gè)或多個(gè)氨基酸所得的氨基酸序列，而且其內(nèi)切葡聚糖酶活性在存在表面活性劑時(shí)降低很小的修飾蛋白 '及(C)同源蛋白，其氨基酸序列與SEQ ID NO:2、4、38或40所示的氨基酸序列的蛋白的同源性至少為85%， 而且其內(nèi)切葡聚糖酶活性在存在表面活性劑時(shí)降低很小。SEQ ID NO:2的氨基酸序列是N末端添加型NCE4的氨基酸序列(參見實(shí)施例A2)，其中含有5個(gè)氨基酸(N末端為焦谷氨酸)的肽加到來源于Humicola insolens麗200-1的內(nèi)切葡聚糖酶NCE4的N末端。SEQ ID NO:4的氨基酸序列是N末端替代型STCEl的氨基酸序列(參見實(shí)施例B2),其中含有4個(gè)氨基酸(N末端為焦谷氨酸)的肽替代來源于Staphylotrichumcoccosporum IFO 31817的內(nèi)切葡聚糖酶STCEl的N末端氨基酸(Ala)。SEQ ID NO:38的氨基酸序列是pQ添加型STCEl的氨基酸序列(參見實(shí)施例B3)，其中焦谷氨酸加到來源于Staphylotrichum coccosporum IFO 31817的內(nèi)切葡聚糖酶STCEl的N末端。SEQ ID NO:40的氨基酸序列是N末端添加型STCEl的氨基酸序列(參見實(shí)施例B4),其中含有4個(gè)氨基酸(N末端為焦谷氨酸)的肽加到來源于Staphylotrichumcoccosporum IFO 31817的內(nèi)切葡聚糖酶STCEl的N末端。此處所用術(shù)語(yǔ)“修飾 蛋白”是指包含在SEQ ID NO:2、4、38或40所示的氨基酸序列中缺失、替代、插入或添加一個(gè)或多個(gè)氨基酸(例如，一個(gè)或幾個(gè)氨基酸)所得的氨基酸序列，而且其內(nèi)切葡聚糖酶活性在存在表面活性劑時(shí)降低很小的蛋白。修飾例如“缺失、替代、插入或添加”的氨基酸的數(shù)目?jī)?yōu)選地是I到30，更優(yōu)選地是I到10，最優(yōu)選地是I到6。另外，修飾蛋白是指包含在SEQ ID NO:2、4、38或40所示的氨基酸序列中保守替代一個(gè)或多個(gè)氨基酸，而且其內(nèi)切葡聚糖酶活性在存在表面活性劑時(shí)降低很小的蛋白。此處所用術(shù)語(yǔ)“保守替代”是指蛋白中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基可被具有相同化學(xué)性質(zhì)的不同氨基酸替代，從而使其蛋白活性不發(fā)生實(shí)質(zhì)性改變。保守替代可包括，例如將疏水殘基替代為另一個(gè)疏水殘基，或?qū)O性殘基替代為另一個(gè)具有相同電荷的極性殘基。具有相同化學(xué)性質(zhì)并可互相保守替代的氨基酸是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。更具體地，非極性(疏水)氨基酸包括，例如丙氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、脯氨酸、色氨酸、苯丙氨酸或蛋氨酸。極性(中性)氨基酸包括，例如甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺或半胱氨酸。帶正電荷的堿性氨基酸包括，例如精氨酸、組氨酸或賴氨酸。帶負(fù)電荷的酸性氨基酸包括，例如天冬氨酸或谷氨酸。此處所用術(shù)語(yǔ)“同源蛋白”是指其與包含SEQ ID NO:2、4、38或40所示的氨基酸序列的同源性(序列相似性)至少為85% (優(yōu)選地是90%或以上，最優(yōu)選地是95%或以上)，且其內(nèi)切葡聚糖酶活性在存在表面活性劑時(shí)降低很小的蛋白。此處所用同源性以用已知的同源性分析軟件FASTA3，根據(jù)缺省參數(shù)計(jì)算出的值(相似性)表示[Science，227，1438-1441 (1985) ；Proc.Natl.Acad.Sc1.USA，85，2444-2448(1988) ；http://www.ddbj.nig.ac.jp/E-mai1/homology-j.html]。如上所述，在本發(fā)明的“由氨基酸序列SEQ ID NO:2所示的蛋白”中，除了加到N末端的由5個(gè)氨基酸組成的肽外，其它部分來源于內(nèi)切葡聚糖酶NCE4。另外，在本發(fā)明的“氨基酸序列SEQ ID NO:4、38或40所示的蛋白”中，除了 N末端氨基酸或肽外，其它部分來源于內(nèi)切葡聚糖酶STCE1。內(nèi)切葡聚糖酶NCE4和STCEl屬于家族45。已知屬于家族45的內(nèi)切葡聚糖酶包括，例如來源于腐質(zhì)霉屬的NCE5 (W001/90375)。在

圖1和2中，所示的是內(nèi)切葡聚糖酶STCEl的氨基酸序列[信號(hào)肽(SEQ ID NO:43)，成熟蛋白(SEQ ID NO:44)]、內(nèi)切葡聚糖酶NCE4的氨基酸序列[信號(hào)肽(SEQ ID NO:45)，成熟蛋白(SEQ ID NO:46)]和內(nèi)切葡聚糖酶NCE5的氨基酸序列[信號(hào)肽(SEQ ID NO:47)，成熟蛋白(SEQ ID NO:48)]的比對(duì)結(jié)果。圖1所示的是前半部分(即N末端部分)的比對(duì)結(jié)果，圖2所示的是后半部分(即C末端部分)的比對(duì)結(jié)果。圖1和2中的符號(hào)表示與STCEl —致的氨基酸。如圖1和2所示，屬于家族45的內(nèi)切葡聚糖酶包括作為共有結(jié)構(gòu)域的催化結(jié)構(gòu)域(I到207位)，有些含有接頭(208到258位)和/或纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域(CBD) (259到295位)。在本文中，以上結(jié)構(gòu)域之后的括號(hào)中的數(shù)字表示內(nèi)切葡聚糖酶STCEl的氨基酸序列(SEQ ID NO:44)中的氨基酸編號(hào)。在內(nèi)切葡聚糖酶的催化結(jié)構(gòu)域和纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域均存在保守氨基酸，但在接頭沒有明顯的保守區(qū)存在。含多個(gè)保守氨基酸或在該區(qū)域所含的共有氨基酸的區(qū)域(例如，催化結(jié)構(gòu)域或纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域，特別是催化結(jié)構(gòu)域)是對(duì)內(nèi)切葡聚糖酶(例如STCEl或NCE4)酶活性重要的區(qū)域或氨基酸。因此，在除了這種重要區(qū)域或氨基酸的其它區(qū)域或氨基酸處進(jìn)行氨基酸修飾(例如缺失、替代、插入和/或添加，特別是保守替代)，可高效率獲得該酶活性得到維持的修飾蛋白質(zhì)或同源蛋白質(zhì)，而無需過度試驗(yàn)。。另外，即使在內(nèi)切葡聚糖酶含多個(gè)保守氨基酸的區(qū)域中，用不同的氨基酸對(duì)非共有氨基酸進(jìn)行修飾(優(yōu)選地是相同的氨基酸進(jìn)行保守替代)也可以保持酶活性。因此，通過這種修飾，可高效率獲得該酶活性得到維持的修飾蛋白質(zhì)或同源蛋白質(zhì)，而無需過度試驗(yàn)。即使是含有大量保守氨基酸的區(qū)域內(nèi)的共有氨基酸，改變?yōu)槠渌被釙r(shí)，有時(shí)也可維持其酶活性，尤其是改變?yōu)榭杀Ｊ厝〈愃瓢被岬臅r(shí)候，其可能性增高。本發(fā)明的修飾蛋白質(zhì)或同源蛋白質(zhì)，只有是具有內(nèi)切葡聚糖酶活性，可以是任意區(qū)域，例如催化區(qū)域、接頭或纖維素結(jié)合區(qū)域所含的氨基酸改變的蛋白質(zhì)。編碼本發(fā)明中蛋白的多核苷酸根據(jù)本發(fā)明，提供編碼包含SEQ ID NO:2、4、38或40所示的氨基酸序列的蛋白，或其修飾或同源蛋白(以下統(tǒng)稱為本發(fā)明中的蛋白)的多核苷酸。當(dāng)給定一個(gè)蛋白的氨基酸序列時(shí)，則可容易地選擇編碼該氨基酸序列的核苷酸序列，因此可選擇多種編碼本發(fā)明中蛋白的核苷酸序列。此處所用術(shù)語(yǔ)“多核苷酸”包括DNA和RNA，DNA是優(yōu)選的。本發(fā)明中的多核苷酸包括從由以下多核苷酸組成的組中選擇的多核苷酸:(a)包含核苷酸序列SEQ ID NO:1、3、37或39的多核苷酸；(b)包含在核苷酸序列SEQ ID NO:1、3、37或39中缺失、替代、插入或添加一個(gè)或多個(gè)堿基所得的堿基序列，而且其所編碼蛋白的內(nèi)切葡聚糖酶活性在存在表面活性劑時(shí)降低很小的多核苷酸；及(C)在嚴(yán)緊條件下與核苷酸序列SEQ ID NO:1、3、37或39所示的多核苷酸雜交，而且其所編碼蛋白的內(nèi)切葡聚糖酶活性在存在表面活性劑時(shí)降低很小的多核苷酸。在上述(b)中的核苷酸序列中，被缺失、替代、插入或添加的核苷酸的數(shù)目可以是例如I到90，優(yōu)選地是I到30，更優(yōu)選地是I到18，最優(yōu)選地是I到9。此處所用術(shù)語(yǔ)“在嚴(yán)緊條件下”是指以下條件。根據(jù)ECL直接DNA/RNA標(biāo)記和檢測(cè)系統(tǒng)(Amersham)的說明書所述，在42°C預(yù)雜交1小時(shí)后，加入核苷酸序列SEQ ID N0:l、3、37或39所示的多核苷酸，并在42°C雜交14到16小時(shí)。雜交后，用含0.4% SDS和6mol/L尿素的0.5XSSC(1XSSC ;15mmol/L檸檬酸鈉，150mmol/L氯化鈉)在42°C洗滌20分鐘，并重復(fù)2次，然后用5 X SSC在室溫下洗滌5分鐘，并重復(fù)2次。
本發(fā)明中的多核苷酸包括天然多核苷酸。也可以是全合成的多核苷酸。而且可用部分天然多核苷酸進(jìn)行合成。典型地，本發(fā)明中的多核苷酸可從來源于微生物的基因組文庫(kù)，通過基因工程的普通方法，例如用根據(jù)部分氨基酸序列信息設(shè)計(jì)的合適的DNA探針，進(jìn)行篩選而獲得。本發(fā)明中的蛋白的產(chǎn)生本發(fā)明中的蛋白可 通過用含編碼本發(fā)明蛋白的多核苷酸片段的多核苷酸分子(優(yōu)選以表達(dá)載體形式)轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，從而使多核苷酸分子在宿主細(xì)胞中復(fù)制，并進(jìn)行基因表達(dá)而在宿主細(xì)胞中產(chǎn)生。根據(jù)本發(fā)明，提供了含編碼本發(fā)明中的蛋白的多核苷酸片段，從而使多核苷酸片段可在宿主微生物中復(fù)制并表達(dá)蛋白的表達(dá)載體。本發(fā)明中的表達(dá)載體可基于存在于染色體外并能獨(dú)立于染色體復(fù)制而進(jìn)行復(fù)制的自主復(fù)制載體(例如質(zhì)粒)進(jìn)行構(gòu)建。選擇性地，本發(fā)明中的表達(dá)載體可以是用載體轉(zhuǎn)化宿主時(shí)將其整合到宿主微生物基因組中，與染色體一起復(fù)制的載體。本發(fā)明中載體的構(gòu)建可通過基因工程中通用流程或方法進(jìn)行。為了用本發(fā)明中的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主微生物而表達(dá)具有所需活性的蛋白。優(yōu)選地是表達(dá)載體除了本發(fā)明中的多核苷酸片段外還包括，例如可調(diào)控表達(dá)的多核苷酸，或篩選轉(zhuǎn)化子的基因標(biāo)記。在本發(fā)明中可使用多種調(diào)控轉(zhuǎn)錄或翻譯的信號(hào)作為可調(diào)控表達(dá)的多核苷酸，例如啟動(dòng)子、終止子或編碼分泌信號(hào)肽的多核苷酸。可通過普通方法將調(diào)控的多核苷酸與其插入片段進(jìn)行連接。本發(fā)明中所用的啟動(dòng)子并無特別限定，只要其在宿主微生物中具有轉(zhuǎn)錄活性即可。啟動(dòng)子可以是調(diào)控來源于相同或不同宿主微生物的編碼蛋白的基因表達(dá)的多核苷酸。例如，可在大腸桿菌中使用乳糖操縱子或色氨酸操縱子的啟動(dòng)子；在酵母中使用乙醇脫氫酶基因、酸性磷酸酶基因、半乳糖利用基因或甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因的啟動(dòng)子；在真菌例如絲狀真菌中使用α-淀粉酶基因、葡糖淀粉酶基因、纖維二糖水解酶基因或甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因的啟動(dòng)子。信號(hào)肽并無特別限定，只要其可在宿主微生物中提供蛋白分泌作用即可。信號(hào)肽多核苷酸可從與編碼蛋白的基因相同或不同來源的宿主微生物中獲得?；驑?biāo)記可根據(jù)篩選轉(zhuǎn)化子的方法進(jìn)行合適的選擇。例如，在本發(fā)明中可使用抗藥基因或與營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變互補(bǔ)的基因作為基因標(biāo)記。例如，當(dāng)宿主是細(xì)菌時(shí)，可使用氨芐青霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因或四環(huán)素抗性基因。當(dāng)宿主是酵母時(shí)，可使用色氨酸合成基因(trpl，trpC)、尿嘧啶合成基因(ura3)、亮氨酸合成基因(leu2)或組氨酸合成基因(his3)。當(dāng)宿主是真菌例如絲狀真菌時(shí)，可使用越霉素抗性基因、硝酸鹽利用基因(niaD)、精氨酸合成基因(argB)、尿嘧啶合成基因(pyr4)、潮霉素抗性基因、除草劑抗性基因、博來霉素抗性基因或aureobasidin抗性基因。根據(jù)本發(fā)明，提供用表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的微生物。本發(fā)明中所用的宿主-載體系統(tǒng)并無特別限定。例如，可使用大腸桿菌、放線菌、酵母或絲狀真菌系統(tǒng)，或利用這種微生物進(jìn)行融合蛋白表達(dá)的系統(tǒng)。當(dāng)用酵母作為宿主時(shí)，包括，例如，使用釀酒酵母屬(Saccharomyces)、漢遜酵母屬(Hansenula)、或畢赤酵母屬(Pichia)的微生物，優(yōu)選地是釀酒酵母。當(dāng)使用絲狀真菌作為宿主時(shí)，可以使用任何絲狀真菌，優(yōu)選地是屬于腐質(zhì)霉屬、木霉屬、曲霉屬(Aspergillus)、Acremonium或鐮刀菌屬(Fusarium)的微生物,更優(yōu)選地是屬于腐質(zhì)霉或木霉屬的微生物。更優(yōu)選地是Humicola insolens、Humicola thermoidea、綠色木霉、里氏木霉(Trichoderma reesei)、長(zhǎng)梗木霉(Trichoderma 1ngibrachiatum)、Staphylotrichum coccosporum、黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillusoryzae)、尖抱鍵抱(Fusarium oxysporum)或 Acremonium cellulolyticus,優(yōu)選地是Humicola insolens 或綠色木霉?？赏ㄟ^普通方法，例如 鈣離子法、鋰離子法、電穿孔法、PEG法、土壤桿菌法或基因槍法用表達(dá)載體轉(zhuǎn)化微生物，根據(jù)待轉(zhuǎn)化宿主選擇合適的方法。在本發(fā)明中，將本發(fā)明中的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行培養(yǎng)，得到的培養(yǎng)物用來獲得本發(fā)明的目的蛋白。本發(fā)明中的轉(zhuǎn)化子可通過普通方法選擇合適的培養(yǎng)基或培養(yǎng)條件進(jìn)行培養(yǎng)?？上蚺囵B(yǎng)基中補(bǔ)充例如可被本發(fā)明中的轉(zhuǎn)化子代謝或利用的碳源或氮源、無機(jī)鹽、各種維生素、各種氨基酸例如谷氨酸或天冬酰胺、微量營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)例如核苷酸、或選擇試劑例如抗生素。另外，可適當(dāng)添加利于本發(fā)明中的轉(zhuǎn)化子生長(zhǎng)或促進(jìn)本發(fā)明中的蛋白產(chǎn)生的有機(jī)和/或無機(jī)物質(zhì)。另外，如果需要，可使用含其它營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的天然或合成培養(yǎng)基?？稍谂囵B(yǎng)基中使用任何碳源和氮源，只要它可被本發(fā)明中的轉(zhuǎn)化子利用即可?？衫锰荚纯墒褂美缯崽?、淀粉、甘油、葡萄糖、果糖、麥芽糖、乳糖、纖維素、纖維二糖、糊精、動(dòng)物油或植物油或其水解物。一般來說，其濃度在培養(yǎng)基中優(yōu)選地是0.1 %到5%?？衫玫纯墒褂美鐒?dòng)植物組分或其提取物、例如蛋白胨、肉提取物、玉米浸出液或脫脂豆粉、有機(jī)酸銨鹽例如琥珀酸銨鹽或酒石酸銨鹽、尿素或其它多種含氮化合物例如無機(jī)酸或有機(jī)酸。無機(jī)鹽可使用例如那些可產(chǎn)生鈉、鉀、鈣、鎂、鈷、磷酸、硫酸或其它離子的無機(jī)鹽?？蛇m當(dāng)使用任何含其它組分，例如細(xì)胞、分泌液或微生物例如酵母提取物、或細(xì)小植物粉的培養(yǎng)基，只要這種培養(yǎng)基不干預(yù)本發(fā)明中的轉(zhuǎn)化子生長(zhǎng)和本發(fā)明中的蛋白的產(chǎn)生和積累即可。當(dāng)培養(yǎng)具有營(yíng)養(yǎng)需求的突變株時(shí)，通常向培養(yǎng)基中加入滿足其營(yíng)養(yǎng)需求的物質(zhì)。在本文中，如果培養(yǎng)基中含天然底物，則不需加入這種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。根據(jù)所用的轉(zhuǎn)化子和外部條件，對(duì)培養(yǎng)條件例如培養(yǎng)基成分、培養(yǎng)基流動(dòng)性、培養(yǎng)溫度、攪拌速率或通氣速率進(jìn)行合適的選擇和控制，從而得到優(yōu)選的結(jié)果。如果在液體培養(yǎng)基中產(chǎn)生泡沫，則可使用消泡劑例如硅樹脂油、植物油、礦物油或表面活性劑。在獲得的培養(yǎng)物中積累的本發(fā)明中的蛋白包含于本發(fā)明中的轉(zhuǎn)化子和培養(yǎng)物濾液中。因此，可通過離心分離培養(yǎng)物組分而從培養(yǎng)物濾液和轉(zhuǎn)化子細(xì)胞中獲得本發(fā)明中的蛋白。本發(fā)明中的蛋白可通過普通方法從培養(yǎng)物濾液中回收。從培養(yǎng)物中回收本發(fā)明中的蛋白的流程可按單獨(dú)或按任意順序組合，或重復(fù)進(jìn)行。例如，可使用萃取過濾、離心、透析、濃縮、干燥、冷凍、吸附、解吸附、基于在各種溶劑中溶解度不同的分離方法(例如沉淀、鹽析、結(jié)晶、重結(jié)晶、反向溶解或?qū)游?。另外，本發(fā)明中的蛋白可從本發(fā)明中的轉(zhuǎn)化子的培養(yǎng)物中獲得。例如，通過普通方法從培養(yǎng)物中提取(例如，研磨處理或壓力破碎)、回收(例如，過濾或離心)、或純化(例如，鹽析或溶劑沉淀)?？筛鶕?jù)普通方法對(duì)得到的粗物質(zhì)進(jìn)行純化，例如用載體物質(zhì)例如葡聚糖、纖維素、瓊脂糖、合成多聚物或硅膠進(jìn)行柱層析。本發(fā)明中的目的蛋白的純品可從本發(fā)明中的轉(zhuǎn)化子培養(yǎng)物中通過上述方法單獨(dú)或以合適組合而獲得。如上所述，根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例，提供本發(fā)明中的新型蛋白的生產(chǎn)過程。可以與制備轉(zhuǎn)化子的原始宿主實(shí)質(zhì)上相同的方式進(jìn)行轉(zhuǎn)化子的培養(yǎng)(包括培養(yǎng)條件)。轉(zhuǎn)化子培養(yǎng)后的目的蛋白的回收方法可通過常用的方法進(jìn)行。保藏菌株用本發(fā)明的表達(dá)載體pE⑶01轉(zhuǎn)化的大腸桿菌JM109 (Escherichia coli/pE⑶01)(FERM BP-5973)在1996年7月12日國(guó)內(nèi)保藏于獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所特許生物寄托中心[(以前名稱)通商產(chǎn)業(yè)省工業(yè)技術(shù)院生命工學(xué)工業(yè)技術(shù)研究所(地址:〒305-8566日本國(guó)茨城縣筑波東I 丁目I番地I中央第6)]，并于1997年6月13日轉(zhuǎn)為國(guó)際保藏。國(guó)際保藏號(hào)(國(guó)際保藏號(hào)后的括號(hào)[]中的數(shù)字是國(guó)內(nèi)保藏號(hào))是FERM BP-5973[FERMP-15729]。用本發(fā)明的表達(dá)載體pMKDOl轉(zhuǎn)化的大腸桿菌JM109 (Escherichia coli/pMKDOl)(FERM BP-5974)在1996年7月12日在國(guó)內(nèi)保藏于獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所特許生物寄托中心[(以前名稱)通商產(chǎn)業(yè)省工業(yè)技術(shù)院生命工學(xué)工業(yè)技術(shù)研究所(地址:〒305-8566日本國(guó)茨城縣筑波東I 丁目I番地I中央第6)]，并于1997年6月13日轉(zhuǎn)為國(guó)際保藏。國(guó)際保藏號(hào)(國(guó)際保藏號(hào)后的括號(hào)[]中的數(shù)字是國(guó)內(nèi)保藏號(hào))是FERM BP-5974[FERMP-15730]。用本發(fā)明的表達(dá)載體pCBl_M2XR轉(zhuǎn)化的大腸桿菌JM109 (Escherichia coli/PCB1-M2XR) (FERM BP-6045)在1996年9月9日在國(guó)內(nèi)保藏于獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所特許生物寄托中心[(以前名稱)通商產(chǎn)業(yè)省工業(yè)技術(shù)院生命工學(xué)工業(yè)技術(shù)研究所(地址:〒305-8566日本國(guó)茨城縣筑波東I 丁目I番地I中央第6)]，并于1997年8月11日轉(zhuǎn)為國(guó)際保藏。國(guó)際保藏號(hào)(國(guó)際保藏號(hào)后的括號(hào)[]中的數(shù)字是國(guó)內(nèi)保藏號(hào))是FERMBP-6045[FERM P-15840]。在本文中，本發(fā)明中的質(zhì)粒pCBl-M2不僅可通過實(shí)施例中描述的方法獲得，而且也可以通過預(yù)先用限制性酶XbaI消化的質(zhì)粒pCBl-M2XR的自連而獲得。作為本發(fā)明中的表達(dá)載體的宿主的Humicola insolens MN200-1 (FERM BP-5977)在1996年7月15日在國(guó)內(nèi)保藏于獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所特許生物寄托中心[(以前名稱)通商產(chǎn)業(yè)省工業(yè)技術(shù)院生命工學(xué)工業(yè)技術(shù)研究所(地址:〒305-8566日本國(guó)茨城縣筑波東I 丁目I番地I中央第6)]，并于1997年6月13日轉(zhuǎn)為國(guó)際保藏。國(guó)際保藏號(hào)(國(guó)際保藏號(hào)后的括號(hào)[]中的數(shù)字是國(guó)內(nèi)保藏號(hào))是FERMBP-5977[FERM P-15736]。作為本發(fā)明中的表達(dá)載體的宿主的綠色木霉MC300-1 (Trichoderma virideMC300-1) (FERM BP-6047)在1996年9月9日在國(guó)內(nèi)保藏于獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所特許生物寄托中心[(以前名稱)通商產(chǎn)業(yè)省工業(yè)技術(shù)院生命工學(xué)工業(yè)技術(shù)研究所(地址:〒305-8566日本國(guó)茨城縣筑波東I 丁目I番地I中央第6)]，并于1997年8月11日轉(zhuǎn)為國(guó)際保藏。國(guó)際保藏號(hào)(國(guó)際保藏號(hào)后的括號(hào)[]中的數(shù)字是國(guó)內(nèi)保藏號(hào))是FERMBP-6047[FERM P-15842]。用本發(fā)明的表達(dá)載體pUC118_STCEex轉(zhuǎn)化的大腸桿菌JM109(E.coli DH5 α /pUC118-STCEex) (FERM BP-10127)在2003年12月I日在國(guó)內(nèi)保藏于獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所特許生物寄托中心(地址:〒305-8566日本國(guó)茨城縣筑波東I 丁目I番地I中央第6)，并于2004年9月15日轉(zhuǎn)為國(guó)際保藏。國(guó)際保藏號(hào)(國(guó)際保藏號(hào)后的括號(hào)[]中的數(shù)字是國(guó)內(nèi)保藏號(hào))是FERM BP-10127[FERM P-19602]。在本文中，質(zhì)粒pUC118_STCEex是通過將STCE基因插入到質(zhì)粒pUC118的BamHI位點(diǎn)而得到的質(zhì)粒。包含在BamHI片段中的內(nèi)切葡聚糖酶STCEl基因包括一個(gè)內(nèi)含子，其序列為SEQ ID NO:5。
實(shí)施例本發(fā)明將通 過以下實(shí)施例進(jìn)行進(jìn)一步描述，但不作為對(duì)本發(fā)明的限制。實(shí)施侈Il Al:在Humicola insolens中表汰N末端添力口型纖維素酶矛口里予牛.型纖維素酶的表達(dá)載體的構(gòu)建(I)用于表達(dá)N末端添加型纖維素酶的表達(dá)載體pMKDOl的構(gòu)建用BamHI消化質(zhì)粒pUC118 (Takara Bio)。得到的片段用DNA平端化試劑盒(TakaraBio)進(jìn)行平端化，然后用DNA連接試劑盒(Takara Bio)進(jìn)行自連，從而得到pUC118BN。將所得的PUC118BN用SphI消化，平末端化后自連得到pUC118BSN。然后，根據(jù)特開平N0.8-126492 中所述的方法從 Humicola insolens MN200-1 (FERM BP-5977)獲得含纖維素酶NCE2基因全長(zhǎng)的3.4kb Pst1-XbaI片段。將該片段連接到預(yù)先用相同的限制性酶消化的 pUC118BSN 中，得到 pUC118BSN_PX。用 Sculptor 體外突變系統(tǒng)(Amersham Bioscience)在pUC118BSN-PX引入定點(diǎn)突變，得到質(zhì)粒pM21。用于突變的寡核苷酸使用的是寡核苷酸MNC-02 和 MNC-03。MNC-02:5’ -GAGCGCCAGAACTGTGGATCCACTTGGTGAGCAAT G_3’ (SEQ ID NO:6)MNC-03:5，-TCCGCCGTTCTGAGCGGATCCAGGCGTTTGGCGCG-3’ (SEQ ID NO:7)用BamHI消化質(zhì)粒pM21,并與來源于Humicola insolens MN200-1的纖維二糖水解酶基因(NCE3)的BamHI消化的PCR片段連接，得到質(zhì)粒pKM04。用來源于Humicolainsolens MN200-1 (FERM BP-5977)的基因組 DNA (W098/03640)為模板，以下列引物 MKA-05和MKA-06擴(kuò)增NCE3的PCR片段。MKA-05:5，-GCCGCCCAGCAGGCGGGATCCCTCACCACCGAGAG G_3’ (SEQ ID NO:8)MKA-06:5’ -TGATCGTCGAGTCAGGGATCCAGAATTTACAGGCA C_3’ (SEQ ID NO:9)然后，用來源于構(gòu)巢曲霉(Aspergillus nidulans)的trpC基因的啟動(dòng)子和終止子(Mullaney, E.J.，et.al.，Mol.Gem.Genet.，199,37-45,1985)制備可在 Humicolainsolens中表達(dá)特開昭59-175889號(hào)公報(bào)記載的越霉素抗性基因的基因。將得到的基因連接到用XbaI消化的質(zhì)粒pKM04中，得到表達(dá)N末端添加型纖維素酶的表達(dá)載體pKMDOl (FERM BP-5974)。在pKMDOl中，在距NCE2基因的成熟蛋白N末端下游IObp和其終止密碼子下游3bp處引入BamHI識(shí)別位點(diǎn)，從而在屬于家族45的纖維素酶的N末端加入5個(gè)氨基酸殘基。表I
權(quán)利要求
1.選自下述的、N末端為焦谷氨酸的蛋白質(zhì): (a)由在SEQID NO:2、4、38或40所示的氨基酸序列中缺失、替換、插入或添加I 30個(gè)氨基酸所得的氨基酸序列組成、所述氨基酸序列的N末端被轉(zhuǎn)變?yōu)榻构劝彼?、且其?nèi)切葡聚糖酶活性在存在表面活性劑時(shí)降低很小的修飾蛋白質(zhì)； (b)由在SEQID NO:2、4、38或40所示的氨基酸序列中保守替換I 30個(gè)氨基酸所得的氨基酸序列組成、所述氨基酸序列的N末端被轉(zhuǎn)變?yōu)榻构劝彼?、且其?nèi)切葡聚糖酶活性在存在表面活性劑時(shí)降低很小的修飾蛋白質(zhì)；及 (c)同源蛋白質(zhì)，其由與包含SEQID NO:2、4、38或40所示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的同源性至少為85%的氨基酸序列組成、所述氨基酸序列的N末端被轉(zhuǎn)變?yōu)榻构劝彼帷⑶移鋬?nèi)切葡聚糖酶活性在存在表面活性劑時(shí)降低很小。
2.選自下述的、編碼N末端為焦谷氨酸的蛋白質(zhì)的多核苷酸: (a)多核苷酸，其由在SEQID NO:1、3、37或39所示的堿基序列中缺失、替換、插入或添加I 90個(gè)堿基所得的堿基序列組成、所述堿基序列的N末端密碼子編碼谷氨酸或谷氨酰胺、且所述多核苷酸編碼蛋白質(zhì)的內(nèi)切葡聚糖酶活性在存在表面活性劑時(shí)降低很小；及 (b)多核苷酸，其在嚴(yán)緊條件下與SEQID NO:1、3、37或39的堿基序列組成的多核苷酸序列雜交、所述堿基序列的N末端密碼子編碼谷氨酸或谷氨酰胺、且所述多核苷酸編碼蛋白質(zhì)的內(nèi)切葡聚糖酶活性在存在表面活性劑時(shí)降低很小。
3.包含權(quán)利要求2的多核苷酸的表達(dá)載體。
4.用權(quán)利要求3的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
5.權(quán)利要求4的宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞是酵母或絲狀真菌。`
6.權(quán)利要求5的宿主細(xì)胞,其中，所述絲狀真菌是屬于腐質(zhì)霉(Humicola)或木霉屬(Trichoderma)的微生物。
7.權(quán)利要求6中的宿主細(xì)胞,其中，所述絲狀真菌是Humicolainsolens或綠色木霉(Trichoderma viride)。
8.生產(chǎn)前述蛋白質(zhì)的方法，包括:培養(yǎng)權(quán)利要求5 7任一項(xiàng)中的宿主細(xì)胞的步驟，以及從培養(yǎng)獲得的宿主細(xì)胞或其培養(yǎng)物中回收權(quán)利要求1的蛋白質(zhì)的步驟。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的方法生產(chǎn)的蛋白質(zhì)。
全文摘要
公開了一種抑制在存在表面活性劑時(shí)內(nèi)切糖苷酶活性降低的方法，其特征在于通過修飾具有內(nèi)切糖苷酶活性，N末端氨基酸不是焦谷氨酸的蛋白，使其轉(zhuǎn)變?yōu)镹末端具有焦谷氨酸的蛋白。另外，公開了一種具有內(nèi)切糖苷酶活性，其N末端通過氨基酸修飾轉(zhuǎn)變?yōu)榻构劝彼岬男揎椀鞍?，編碼該蛋白的多核苷酸，包含該多核苷酸的表達(dá)載體，用該表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞和通過培養(yǎng)宿主細(xì)胞而生產(chǎn)蛋白的方法。
文檔編號(hào)C12N15/56GK103103171SQ20121035089
公開日2013年5月15日 申請(qǐng)日期2004年12月7日 優(yōu)先權(quán)日2003年12月8日
發(fā)明者渡邊學(xué), 矢內(nèi)耕二, 露木由美子 申請(qǐng)人:明治制果藥業(yè)株式會(huì)社