專利名稱：使用簡并引物檢測海水中細菌過氧化氫酶多樣性的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于海洋微生物生態(tài)學(xué)領(lǐng)域，特別是涉及使用簡并引物檢測海水中細菌過氧化氫酶多樣性的方法。
背景技術(shù)：
生命活動中，特別是有氧代謝過程中會產(chǎn)生過氧化氫。過氧化氫是ー種活性氧，氧化性強，危害性大。過氧化氫酶能迅速分解過氧化氫，保護生物分子免受氧化損傷；過氧化氫酶是嗜氧微生物生命活動中一直保持活性的重要持家蛋白。海洋中廣泛存在低溫環(huán)境，低溫條件下氧氣溶解度増大，氧濃度提高使低溫微生物更容易受到活性氧的影響。過氧化氫酶是嗜氧低溫生物代謝必需的抗氧化酶。完成基因組測序的海洋低溫細菌都有過氧化氫酶基因，如Desulfotalea psychrophila, Colwellia psychrerythraea和Pseudoalteromonas haloplanktis等。過氧化氫酶研究對于認識海洋微生物在低溫下有氧代謝活動規(guī)律有重要意義。海水表層過氧化氫含量受到太陽紫外線輻射和降水的影響，某些地區(qū)表層海水中過氧化氫濃度可達I. 45 μ mol/L。生活在含高過氧化氫的表層海水中的細菌面臨氧化脅迫，推測這些細菌只有具備較高活性的過氧化氫酶才能維持代謝活動正常進行。表層海水中的微生物過氧化氫酶分解紫外輻射產(chǎn)生的過氧化氫，這ー過程放熱促進海冰融化，具有重要的生態(tài)影響。為了深入認識海洋微生物過氧化氫酶的生態(tài)作用，有必要建立研究微生物過氧化氫酶多樣性的方法。目前可以直接檢測海水中過氧化氫酶活性，但直接測活的方法無法研究過氧化氫酶的種類和含量，因此無法獲得多祥性的信息；構(gòu)建宏基因組文庫并測序，可以獲得環(huán)境中過氧化氫酶基因的信息，但價格昂貴耗時太長，因此無相關(guān)報道；使用特異的保守引物擴增環(huán)境樣品DNA中的目的基因，是研究環(huán)境基因多祥性的理想方法。目前尚無用于擴增環(huán)境中過氧化氫酶基因的保守引物，因此也沒有發(fā)展出相應(yīng)的過氧化氫酶多樣性檢測方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于克服上述現(xiàn)有技術(shù)中存在不足，經(jīng)發(fā)明人長期從事海洋微生物領(lǐng)域的開發(fā)研究和生產(chǎn)實踐，從而開發(fā)提供一種精確、可靠、快速的使用簡并引物檢測海水中細菌過氧化氫酶多樣性的方法，本發(fā)明提供的使用簡并引物檢測海水中細菌過氧化氫酶多樣性的方法，包括下述步驟I)、從GenBank搜集各類已知的細菌過氧化氫酶蛋白序列，進行多序列比對后，找出保守的氨基酸序列，由此獲得合適的四種簡并引物，四種簡并引物均根據(jù)過氧化氫酶蛋白序列的保守區(qū)設(shè)計，四種簡并引物序列包括兩種正向簡并引物序列(5’至3’)為C3+:TTTYAAYCGAGARMGRGTNCCNGARMGNG ；
CA:GTACCTGAAMGRGTRGTSCAYGCNMRRGG ；和兩種反向簡并引物序列(5’至3’)為CB:GAATATGCAAAAAGGCGNCCYTGNARNAKYTTRTC ；C3-:AATCTTTATGAGGCCAAACTTTTGTNANRTCR;2)使用步驟I)中四種簡并引物任ー組合，以聚合酶鏈式反應(yīng)(以下簡稱PCR)擴增過氧化氫酶基因片段，PCR擴增使用12. 5微升反應(yīng)體系所述反應(yīng)體系為2. 5mM脫氧核糖核苷三磷酸(以下簡稱dNTP) I微升，IOX水生棲熱菌(Taq) DNA聚合酶(以下簡稱Taq酶)PCR緩沖液I. 25微升，50 μ M的兩種簡并引物各O. I至O. 2微升，Taq DNA聚合酶O. 5至O. 7U，海水DNA I微升，加水至總體積12. 5微升；制備過氧化氫酶基因片段時每次使用4至8個12. 5微升PCR擴增體系；PCR擴增條件94°C I至2分；94°C 20至40 秒，600C- 51°C 50至80秒，72°C I分30秒，10至15個循環(huán)，每循環(huán)降低退火溫度1°C ；94 °C 20至40秒，50 0C 50至80秒，72°C I分，20循環(huán)；72°C 3分。反應(yīng)后合并各管PCR擴增產(chǎn)物，純化分子量在500bp至IOOObP的單ー PCR擴增產(chǎn)物；；3)使用T載體試劑盒(寶生物公司產(chǎn)品)連接步驟2)的PCR擴增產(chǎn)物，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞構(gòu)建過氧化氫酶的基因片段的T載體文庫，藍白斑篩選；挑取所有菌落擴增，使用相應(yīng)的過氧化氫酶簡并引物進行菌落PCR擴增尋找陽性克隆；瓊脂糖凝膠電泳確認目標PCR擴增產(chǎn)物即過氧化氫酶基因片段；4)向步驟3)的所有目的PCR擴增產(chǎn)物中加入限制性核酸內(nèi)切酶MboI及其緩沖液，酶切后使用瓊脂糖凝膠電泳檢測所有酶切反應(yīng)液中的核酸片段，每ー種特異的不重復(fù)的電泳條帶類型對應(yīng)著一種過氧化氫酶基因。確定過氧化氫酶基因的種類數(shù)以及每種基因的數(shù)目；5)對于步驟4)確定的每種過氧化氫酶基因，選擇ー個對應(yīng)的步驟2)中的PCR擴增產(chǎn)物進行DNA測序，獲得所有種類的過氧化氫酶基因的序列；這些序列和過氧化氫酶基因種類及數(shù)目構(gòu)成了海水中細菌過氧化氫酶多樣性的信息。本發(fā)明提供的使用簡并引物檢測海水中細菌過氧化氫酶多樣性的方法中，所述簡并引物序列通過以下方式獲得從GenBank搜集各類已知的細菌過氧化氫酶的蛋白序列，進行多序列比對后，找出保守的氨基酸序列，由此獲得合適的簡并引物。擴增過氧化氫酶基因的簡并引物，共有四種，其中正向引物和反向引物各兩種，正向引物序列(5’至3’ )為C3+:TTTYAAYCGAGARMGRGTNCCNGARMGNG ；CA:GTACCTGAAMGRGTRGTSCAYGCNMRRGG ；反向引物序列(5’至3’)為CB:GAATATGCAAAAAGGCGNCCYTGNARNAKYTTRTC ；C3-: AATCTTTATGAGGCCAAACTTTTGTNANRTCRAA。本發(fā)明提供的使用簡并引物檢測海水中細菌過氧化氫酶多樣性的方法中，使用的海水DNA通過以下方式提取采樣獲得的海水4°C暫存，送回實驗室后立即通過8微米濾膜，再通過O. 22微米濾膜，將細菌截留在膜上。將膜剪成小于Imm2的碎片，加入2mL裂解緩沖液(50mmol/L三羥甲基氨基甲烷-20mmol/Lこニ胺四こ酸_400mmol/L氯化鈉_750mmol/L鹿糖_2mg/mL溶菌酶),37°C 30min,加入十二烷基硫酸鈉(終濃度1%)和蛋白酶K (終濃度100 μ g/mL), 55°C靜置2小吋，離心棄去碎膜片，加入等體積苯酹/氯仿/異戍醇混合液(體積比25:24:1)震蕩混勻，IOOOOg離心15min,取上清加入等體積氯仿/異戍醇混合液(體積比24:1)震蕩混勻，IOOOOg離心15min,取上清加入十分之一體積3mol/Lこ酸鈉和等體積異丙醇，-20°C靜置I小時或過夜，IOOOOg離心15min棄上清,加入500 μ L 70%こ醇，IOOOOg離心5min棄上清,干燥后加水復(fù)溶。本發(fā)明提供的使用簡并引物的方法的特點該方法精確、可靠、快速，是ー種使用簡并引物檢測海水中細菌過氧化氫酶多樣性的新一代的檢測方法?？煞奖闶褂脵z測海水中細菌過氧化氫酶的多祥性。適用于各種海洋環(huán)境的海水過氧化氫酶檢測，所能檢測的最小海水體積為200mL。


圖I為四種簡并引物擴增海水DNA得到的過氧化氫酶基因片段的瓊脂糖凝膠電泳圖·M :分子量標準品；1 :CAC3-引物對擴增產(chǎn)物，2: CACB弓I物對擴增產(chǎn)物，3: C3+CB弓I物對擴增產(chǎn)物，4: C3+C3-弓I物對擴增產(chǎn)物
具體實施例方式本發(fā)明用下列實施例來進ー步說明本發(fā)明，但本發(fā)明保護范圍并非限于下列實施例。實施例II)、簡并引物的確定從GenBank搜集各類已知的細菌過氧化氫酶的蛋白序列，進行多序列比對后，找出保守的氨基酸序列，由此獲得合適的PCR擴增過氧化氫酶基因的簡并引物，共有四種，正向引物和反向引物各兩種，正向引物序列(5’至3’)為C3+:TTTYAAYCGAGARMGRGTNCCNGARMGNG ；CA:GTACCTGAAMGRGTRGTSCAYGCNMRRGG ；反向引物序列(5’至3’)為CB:GAATATGCAAAAAGGCGNCCYTGNARNAKYTTRTC ；C3-:AATCTTTATGAGGCCAAACTTTTGTNANRTCRAA。、2 )使用正向簡并引物CA: CCNGARMGNGTNGTNCAYGCN和反向簡并引物C3-:AATCTTTATGAGGCCAAACTTTTGTNANRTCRAA,PCR擴增過氧化氫酶基因片段。PCR擴增使用12. 5微升反應(yīng)體系2. 5mM dNTP I微升，IOXTaq PCR擴增緩沖液I. 25微升，50 μ M的兩種簡并引物各O. 15微升，Taq DNA聚合酶O. 625U，海水DNA I微升，加水至總體積12. 5微升。制備每種過氧化氫酶基因片段時毎次使用6個12. 5微升PCR擴增體系。PCR條件940C 2min;94°C 30s, 60°C— 51 °C lmin, 72°C Imin 30s, 10 循環(huán)，每循環(huán)降低退火溫度 1°C ；94°C 30s, 50°C lmin, 72°C lmin, 20 循環(huán)；72°C 3min。反應(yīng)后合并 6 管 PCR 產(chǎn)物，使用膠回收試劑盒純化分子量在500bp至IOOObp的單ー PCR擴增產(chǎn)物。3)、使用T載體試劑盒連接步驟2)的PCR產(chǎn)物，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞構(gòu)建過氧化氫酶的基因片段的T載體文庫。藍白斑篩選，挑取所有白色菌落，使用CA和C3-引物進行菌落PCR尋找陽性克隆。瓊脂糖凝膠電泳確認目標PCR產(chǎn)物即過氧化氫酶基因片段。
4)、向步驟3)的所有目的PCR產(chǎn)物中加入限制性核酸內(nèi)切酶MboI及其緩沖液，酶切后使用瓊脂糖凝膠電泳檢測所有酶切反應(yīng)液中的核酸片段，每ー種特異的不重復(fù)的電泳條帶類型對應(yīng)著一種過氧化氫酶基因。確定過氧化氫酶基因的種類數(shù)以及每種基因的數(shù)目。5)、對于步驟4)確定的每種過氧化氫酶基因，選擇ー個對應(yīng)的步驟3)中的PCR產(chǎn)物進行DNA測序，獲得所有種類的過氧化氫酶基因的序列。這些序列和過氧化氫酶基因種類及數(shù)目構(gòu)成了海水中細菌過氧化氫酶多樣性的信息。實施例2I)使用正向簡并引物CA: CCNGARMGNGTNGTNCAYGCN和反向簡并引物CB:AAATGTTCGGCCYTGNARNADYTTRTC，PCR擴增過氧化氫酶基因片段。PCR使用12. 5微升反應(yīng)體系2.5mM dNTP I微升，IOXTaq PCR緩沖液I. 25微升，50 μ M的兩種簡并引物各O. 15微升，Taq DNA聚合酶O. 625U，海水DNA I微升，加水至總體積12. 5微升。制備每種過氧化氫 酶基因片段時每次使用6個12. 5微升PCR體系。PCR條件94°C 2min; 94°C 30s，60°C —51°C Imin, 72°C lmin 30s, 10循環(huán)，每循環(huán)降低退火溫度 1°C ;94°C 30s, 50°C lmin, 72°C lmin, 20循環(huán)；72°C 3min。反應(yīng)后合并6管PCR產(chǎn)物，使用膠回收試劑盒純化分子量在500bp至IOOObp的單ー PCR產(chǎn)物。2)使用T載體試劑盒連接步驟I)的PCR產(chǎn)物，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞構(gòu)建過氧化氫酶的基因片段的T載體文庫。藍白斑篩選，挑取所有白色菌落，使用CA和CB引物進行菌落PCR尋找陽性克隆。瓊脂糖凝膠電泳確認目標PCR產(chǎn)物即過氧化氫酶基因片段。3)向步驟2)的所有目的PCR產(chǎn)物中加入限制性核酸內(nèi)切酶MboI及其緩沖液，酶切后使用瓊脂糖凝膠電泳檢測所有酶切反應(yīng)液中的核酸片段，每ー種特異的不重復(fù)的電泳條帶類型對應(yīng)著一種過氧化氫酶基因。確定過氧化氫酶基因的種類數(shù)以及每種基因的數(shù)目。4)對于步驟3)確定的每種過氧化氫酶基因，選擇ー個對應(yīng)的步驟2)中的PCR產(chǎn)物進行DNA測序，獲得所有種類的過氧化氫酶基因的序列。這些序列和過氧化氫酶基因種類及數(shù)目構(gòu)成了海水中細菌過氧化氫酶多樣性的信息。實施例3I)使用正向簡并引物C3+:TTTYAAYCGAGARMGRGTNCCNGA和反向簡并引物CB:AAATGTTCGGCCYTGNARNADYTTRTC，擴增過氧化氫酶基因片段。PCR使用12. 5微升反應(yīng)體系2. 5mM dNTP I微升，IOXTaq PCR緩沖液I. 25微升，50 μ M的兩種簡并引物各O. 15微升，Taq DNA聚合酶O. 625U，海水DNA I微升，加水至總體積12. 5微升。制備每種過氧化氫酶基因片段時每次使用6個12. 5微升PCR體系。PCR條件94°C 2min; 94°C 30s，60°C —51°C Imin, 72°C lmin 30s, 10循環(huán)，每循環(huán)降低退火溫度 1°C ;94°C 30s, 50°C lmin, 72°C lmin, 20循環(huán)；72°C 3min。反應(yīng)后合并6管PCR產(chǎn)物，使用膠回收試劑盒純化分子量在500bp至IOOObp的單ー PCR產(chǎn)物。2)使用T載體試劑盒連接步驟I)的PCR產(chǎn)物，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞構(gòu)建過氧化氫酶的基因片段的T載體文庫。藍白斑篩選，挑取所有白色菌落，使用C3+和CB引物進行菌落PCR尋找陽性克隆。瓊脂糖凝膠電泳確認目標PCR產(chǎn)物即過氧化氫酶基因片段。3)向步驟2)的所有目的PCR產(chǎn)物中加入限制性核酸內(nèi)切酶MboI及其緩沖液，酶切后使用瓊脂糖凝膠電泳檢測所有酶切反應(yīng)液中的核酸片段，每ー種特異的不重復(fù)的電泳條帶類型對應(yīng)著一種過氧化氫酶基因。確定過氧化氫酶基因的種類數(shù)以及每種基因的數(shù)目。4)對于步驟3)確定的每種過氧化氫酶基因，選擇ー個對應(yīng)的步驟2)中的PCR產(chǎn)物進行DNA測序，獲得所有種類的過氧化氫酶基因的序列。這些序列和過氧化氫酶基因種類及數(shù)目構(gòu)成了海水中細菌過氧化氫酶多樣性的信息。實施例4I)使用正向簡并引物C3+: TTTYAAYCGAGARMGRGTNCCNGA和反向簡并引物C3-: AATCTTTATGAGGCCAAACTTTTGTNANRTCRAA，擴增過氧化氫酶基因片段。PCR使用12. 5微升反應(yīng)體系2. 5mM dNTP I微升，10 X TaqPCR緩沖液I. 25微升，50 μ M的兩種簡并引物各O. 15微升，Taq DNA聚合酶O. 625U，海水DNA I微升，加水至總體積12. 5微升。制備每種過氧化氫酶基因片段時每次使用6個12. 5微升PCR體系。PCR條件94°C 2min;94°C 30s, 60°C — 51°C Imin, 72°C lmin 30s, 10 循環(huán)，每循環(huán)降低退火溫度 1°C ；94°C 30s, 50°C lmin, 72°C lmin, 20· 循環(huán)；72°C 3min。反應(yīng)后合并6管PCR產(chǎn)物，使用膠回收試劑盒純化分子量在500bp至IOOObp的單ー PCR產(chǎn)物。2)、使用T載體試劑盒連接步驟I)的PCR產(chǎn)物，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞構(gòu)建過氧化氫酶的基因片段的T載體文庫。藍白斑篩選，挑取所有白色菌落，使用C3+和C3-引物進行菌落PCR尋找陽性克隆。瓊脂糖凝膠電泳確認目標PCR產(chǎn)物即過氧化氫酶基因片段。3)、向步驟2)的所有目的PCR產(chǎn)物中加入限制性核酸內(nèi)切酶MboI及其緩沖液，酶切后使用瓊脂糖凝膠電泳檢測所有酶切反應(yīng)液中的核酸片段，每ー種特異的不重復(fù)的電泳條帶類型對應(yīng)著一種過氧化氫酶基因。確定過氧化氫酶基因的種類數(shù)以及每種基因的數(shù)目。4)、對于步驟3)確定的每種過氧化氫酶基因，選擇ー個對應(yīng)的步驟2)中的PCR產(chǎn)物進行DNA測序，獲得所有種類的過氧化氫酶基因的序列。這些序列和過氧化氫酶基因種類及數(shù)目構(gòu)成了海水中細菌過氧化氫酶多樣性的信息。
權(quán)利要求
1.一種使用簡并引物檢測海水中細菌過氧化氫酶多樣性的方法，其特征在于包括下述步驟 1)、從GenBank搜集各類已知的細菌過氧化氫酶蛋白序列，進行多序列比對后，找出保守的氨基酸序列，由此獲得合適的四種簡并引物，四種簡并引物均根據(jù)過氧化氫酶蛋白序列的保守區(qū)設(shè)計，四種簡并引物序列包括兩種正向簡并引物序列(5’至3’)為C3+:TTTYAAYCGAGARMGRGTNCCNGARMGNG ；CA:GTACCTGAAMGRGTRGTSCAYGCNMRRGG ； 和兩種反向簡并引物序列(5’至3’)為CB:GAATATGCAAAAAGGCGNCCYTGNARNAKYTTRTC ； C3-:AATCTTTATGAGGCCAAACTTTTGTNANRTCR; 2)使用步驟I)中四種簡并引物任一組合，聚合酶鏈式反應(yīng)擴增過氧化氫酶基因片段，PCR擴增使用12. 5微升反應(yīng)體系所述反應(yīng)體系為2. 5mM脫氧核糖核苷三磷酸I微升，IOX水生棲熱菌DNA聚合酶PCR緩沖液I. 25微升，50 u M的兩種簡并引物各0. I至0. 2微升，水生棲熱菌DNA聚合酶0. 5至0. 7U，海水DNA I微升，加水至總體積12. 5微升；制備過氧化氫酶基因片段時每次使用4至8個12. 5微升PCR擴增體系；PCR擴增條件94°C I至2分；940C 20至40秒，60°C— 51°C 50至80秒，72°C I分30秒，10至15個循環(huán)，每循環(huán)降低退火溫度1°C -MV 20至40秒，500C 50至80秒，72°C I分，20循環(huán)；72°C 3分。反應(yīng)后合并各管PCR擴增產(chǎn)物，純化分子量在500bp至IOOObp的單一 PCR擴增產(chǎn)物； 3)使用T載體試劑盒連接步驟2)的PCR擴增產(chǎn)物，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞構(gòu)建過氧化氫酶的基因片段的T載體文庫，藍白斑篩選；挑取所有菌落擴增，使用相應(yīng)的過氧化氫酶簡并引物進行菌落PCR擴增尋找陽性克??；瓊脂糖凝膠電泳確認目標PCR擴增產(chǎn)物即過氧化氫酶基因片段； 4)向步驟3)的所有目的PCR擴增產(chǎn)物中加入限制性核酸內(nèi)切酶MboI及其緩沖液，酶切后使用瓊脂糖凝膠電泳檢測所有酶切反應(yīng)液中的核酸片段，每一種特異的不重復(fù)的電泳條帶類型對應(yīng)著一種過氧化氫酶基因，確定過氧化氫酶基因的種類數(shù)以及每種基因的數(shù)目； 5)對于步驟4)確定的每種過氧化氫酶基因，選擇一個對應(yīng)的步驟3)中的PCR擴增產(chǎn)物進行DNA測序，獲得所有種類的過氧化氫酶基因的序列；這些序列和過氧化氫酶基因種類及數(shù)目構(gòu)成了海水中細菌過氧化氫酶多樣性的信息。
全文摘要
本發(fā)明涉及使用簡并引物檢測海水中細菌過氧化氫酶多樣性的方法，以細菌過氧化氫酶保守區(qū)設(shè)計四種簡并引物的組合，以聚合酶鏈式反應(yīng)擴增海水總DNA中的過氧化氫酶基因片段，再以大腸桿菌構(gòu)建酶基因片段的文庫，使用限制性內(nèi)切酶對文庫中的酶基因進行酶切，電泳檢測片段的分子量分布，確定不同的電泳條帶類型，最后對不同類型的過氧化氫酶基因分別進行測序，可獲得過氧化氫酶基因多樣性的信息。該方法是一種精確、可靠、快速、使用簡并引物檢測海水中細菌過氧化氫酶多樣性的新方法,可用于檢測海水中細菌過氧化氫酶多樣性。
文檔編號C12Q1/68GK102851380SQ20121035214
公開日2013年1月2日 申請日期2012年9月20日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月20日
發(fā)明者王偉, 孫謐, 紀曉峰, 袁翠 申請人:中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所