專利名稱：11-氧乙酰鳥巢烷三醇和15-氧乙酰鳥巢烷三醇的生產(chǎn)方法及其專用菌株的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及cyathane類ニ職化合物11-氧こ酰鳥巢燒三醇(I l_0~acetylcyathatriol)和15-氧こ酰鳥巢燒三醇(15~0~acetylcyathatriol)的生產(chǎn)的方法及其專用菌株。
背景技術(shù)：
過去幾個世紀(jì)，來源于微生物的藥物在治療腫瘤和病原微生物感染等嚴(yán)重威脅人類健康的疾病方面發(fā)揮了巨大的作用。真菌是微生物的重要類群之一，其代謝產(chǎn)物種類豐富、結(jié)構(gòu)類型獨特，使其成為天然有機(jī)活性小分子的主要來源；真菌來源的活性物質(zhì)占微生物來源的50%以上(Journal of Antibiotics 2005, 58, I - 26)。來源于真菌的抗生素(如 青霉素等)、抗病原真菌制劑、免疫抑制劑以及降膽固醇制劑在過去幾十年已經(jīng)用于臨床，為人類抵抗疾病、延年益壽作出了巨大的貢獻(xiàn)。上世紀(jì)六十年代H. J. Brodie發(fā)現(xiàn)的一株被命名為Cyathus helenae Brodie的鳥巢菌新種，能夠很好的抑制細(xì)菌的生長(MastersThesis. University of Alberta, Sept. 1967);于是 W. A.Ayer 等人對其進(jìn)一步研究，發(fā)現(xiàn)該菌菌絲體的粗提物具有較好的抗生素活性，并從中分離得到幾個命名為“cyathin”的抗生素(該類化合物具有5/6/7三環(huán)骨架)，均具有很好的抗菌活性，能夠抑制細(xì)菌、放線菌、一些真菌和人類病原菌等生長(Canadian Journal of Chemistry 1971,17,1401-1407)。之后，W. A. Ayer等人利用生物活性跟蹤的方法又在其他Cyathus sp.中分離得到該類群的ニ職，使該類型的化合物數(shù)量不斷擴(kuò)增。Kawagishi等在上世紀(jì)九十年代從Hericiumernaceum 中分離得到 erinacine ；從 Sarcodon scabrosus 中分離得到 scabronine 和sarcoaonin (Canadian Journal of Cnemistry 1973,51,3842-3854 ；TetrahedronLett. 1971，13，1917-1920.)，這三類化合物同caythin具有相同5/6/7三環(huán)骨架，使該類ニ萜的分布范圍擴(kuò)大，對研究該類ニ萜的生物合成及其活性研究均具有重要意義?；衔?1-氧こ酰鳥巢燒三醇(ll-0-acetylcyathatriol)(式II)和15-氧こ酰鳥巢燒三醇(15-0-acetylcyathatriol)(式 III)最初是在 Cyathus earlei Lloyd 中被發(fā)現(xiàn)的(Canadian Journal of Chemistry 1979，57 (24)，3332-3337)，但純化合物產(chǎn)率較低(即純化合物與粗提物質(zhì)量比，7. 7g粗提物中分離得到132mg 11-0-acetylcyathatriol和 310mg 15-0-acetylcyathatriol)。之后又在 Hericium ernaceum 發(fā)現(xiàn)也具有 11-0-acetylcyathatriol (Bioscience, Biotechnology, ana Biochemistry2004，68 (8)，1786-1789.)，與 Cyathus earlei Lloyd ー樣純化合物產(chǎn)率較低(約 0. 6%,從46Img粗提物分離得到2. 8mg該化合物)。在文獻(xiàn)“Metabolites of bird，s nest fungi. Part 11. Diterpenoidmetabolites of Cyathusearlei.，Can. J. Chem. , 1979, 57, 3332-3337. ” 中，作者通過核磁共振等方法確定了活性化合物ll-0-acetylcyathatriol和15-0-acetylcyathatriol的結(jié)構(gòu)，并測試了它們對Staphyloccocus aureus的抗菌活性,結(jié)果表明，這兩個化合物對所測試菌株有一定的抑制活性。
腫瘤是眾所周知的嚴(yán)重危害人類健康的疾病之一(CA-CancerJ. Clin. 2011，61，69-90)。在目前眾多的治療方法中，由于化療藥物可以隨血液循環(huán)到達(dá)全身各部，故而化學(xué)療法(包括免疫療法)在原發(fā)癌、繼發(fā)轉(zhuǎn)移癌和白血病的治療中發(fā)揮著不可代替的作用(Nat. Rev. Cancer 2005, 5, 65-72) 理想的化療藥物應(yīng)具有作用靶點專一，體內(nèi)特異性祀向腫瘤組織，作用機(jī)制明確，對正常組織毒副作用小等特點(Science2001，293，58-59)。由于傳統(tǒng)化療藥物的毒性、副作用和耐藥性的不斷出現(xiàn)，使得抗腫瘤化療療效降低或療效失效，因此，尋找新型抗腫瘤藥物，已經(jīng)迫在眉睫。目前抗腫瘤藥物研發(fā)的焦點主要從傳統(tǒng)的細(xì)胞毒類藥物轉(zhuǎn)移到針對腫瘤信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的新型抗腫瘤藥物。在國內(nèi)外專利文獻(xiàn)報道中，均未涉及II-Oacetylcyathatriol 和 15~0~acetylcyathatriol化合物的抗腫瘤活性腿。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供ー種利用微生物發(fā)酵制備式II (I l-0-acetylcyathatriol)和/或式III (15-0-acetylcyathatriol)所示的化合物的方法及其專用菌株。
權(quán)利要求
1.非洲黑蛋巢(Cyathusafricanus)L38,其在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的保藏編號為CGMCC NO. 6259。
2.非洲黑蛋巢(Cyathusafricanus)L38 CGMCC NO. 6259在制備式II所示化合物和/或式III所示化合物中的應(yīng)用；
3.一種制備式II所示化合物和式III所示化合物的方法，包括以下步驟 1)將發(fā)酵非洲黑蛋巢(Cyathusafricanus) L38 CGMCC NO. 6259接種到固體培養(yǎng)基上進(jìn)行固體發(fā)酵培養(yǎng)； 2)在步驟I)發(fā)酵后的體系中加入有機(jī)溶劑浸泡提取得到含有式II所示化合物和式III所示化合物的提取液，將所述提取液減壓蒸餾，得到含有式II所示化合物和式III所示化合物的粗提物； 其中，步驟I)中，所述固體培養(yǎng)基由基材和水混合得到，所述基材選自小麥、粳米、玉米、糯米、芡實、秈米和薏米中的一種或兩種以上任意組合；所述固體培養(yǎng)基的含水量是所述的基材總重量的100-150%。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述步驟I)中，所述固體發(fā)酵培養(yǎng)的培養(yǎng)條件是18-28°C，避光靜止培養(yǎng)20-60天。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述步驟I)中，所述固體發(fā)酵培養(yǎng)的培養(yǎng)條件是25 °C，避光靜止培養(yǎng)30天。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的方法，其特征在于所述步驟2)中，所述有機(jī)溶劑是乙酸乙酯、丙酮、甲醇、乙醇、氯仿、異丙醇和正丁醇中的任意一種。
7.根據(jù)權(quán)利要求3-6中任意一項所述的方法，其特征在于所述方法中，還包括將步驟2獲得的粗提物用硅膠柱層析分離，以氯仿和丙酮的混合液為溶劑，按照溶劑中氯仿和丙酮的比例依次是100:0、100:1、50:1、30:1、20:1、10:1、5:1、3:1、2:1的洗脫梯度進(jìn)行梯度洗脫，每個梯度洗脫溶劑1500毫升，每350毫升收集為一個流份；將氯仿和丙酮的比例為10:1的洗脫溶劑洗脫的第二個流份減壓濃縮干燥后溶解于10毫升甲醇溶液中，室溫靜置，析出無色結(jié)晶，得到式II所示的化合物；將氯仿和丙酮的比例為10:1的洗脫溶劑洗脫的第三個流份減壓濃縮干燥后溶解于10毫升甲醇溶液中，室溫靜置過夜，析出無色結(jié)晶，得到式III所示的化合物。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于所述步驟I)中，還包括在固體發(fā)酵之前將非洲黑蛋巢(Cyathus africanus)L38 CGMCC NO. 6259在PDA固體培養(yǎng)基上進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)，取預(yù)培養(yǎng)后的菌絲體轉(zhuǎn)接到液體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)；預(yù)培養(yǎng)的條件為25-28°C，避光培養(yǎng)5-7天；液體培養(yǎng)的條件為25-28°C，避光培養(yǎng)7-10天；所述PDA培養(yǎng)基的組成為土豆200g，葡萄糖20g，瓊脂粉16g，水定容至IL ;所述液體培養(yǎng) 基的組成為葡萄糖4. Og/L，麥芽提取物10. Og/L，酵母4. Og/L，水定容至1L。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種利用微生物發(fā)酵制備式II和/或式III所示的化合物的方法及其專用菌株。該菌株為非洲黑蛋巢(Cyathus africanus)L38，其在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的保藏編號為CGMCC NO.6259。本發(fā)明的方法，包括以下步驟1)將發(fā)酵非洲黑蛋巢L38接種到固體培養(yǎng)基上進(jìn)行固體發(fā)酵培養(yǎng)；2)在發(fā)酵后的體系中加入有機(jī)溶劑浸泡提取得到提取液，將所述提取液減壓蒸餾，得到含有式II所示化合物和式III所示化合物的粗提物。本發(fā)明利用非洲黑蛋巢L38發(fā)酵制備化合物式II和式III所示化合物，并且對該菌采用多種條件進(jìn)行培養(yǎng)，檢測了該化合物的最佳獲取時期，均可得到較高的產(chǎn)率。(式Ⅱ)(式Ⅲ)
文檔編號C12P15/00GK102851218SQ20121035277
公開日2013年1月2日 申請日期2012年9月20日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月20日
發(fā)明者劉宏偉, 韓俊杰, 陳玉惠, 寶麗 申請人:中國科學(xué)院微生物研究所