專利名稱：檢測(cè)IL28B(rs8099917)和ITPA(rs1127354)的突變的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及檢測(cè)IL28B(rs8099917)和ITPA(rsl 127354)的突變方法以及用于該目的的核酸探針和試劑盒。
背景技術(shù)：
丙型肝炎是通過(guò)感染丙型肝炎病毒(HCV)而導(dǎo)致發(fā)病的一種病毒性肝炎。日本國(guó)HCV患者數(shù)達(dá)到約200萬(wàn)人，HCV患者中6 8成轉(zhuǎn)變?yōu)槁愿窝?。不?duì)其進(jìn)行治療的話，慢性肝炎的狀態(tài)經(jīng)過(guò)10 30年，3 4成轉(zhuǎn)變?yōu)楦斡不?肝癌。干擾素療法作為排除HCV的抗病毒療法，通過(guò)與利巴韋林(” ^ ^ )的聯(lián)用/干擾素的PEG化,改善了治療成績(jī)。
報(bào)道稱，針對(duì)PEG干擾素+利巴韋林的聯(lián)用療法有效的日本人患者和無(wú)效患者314人，分析了人基因中有個(gè)體差異的大約90萬(wàn)處，結(jié)果，作為干擾素(IFN)的一種的IL28B基因及其基因周圍存在的SNP與治療效果有關(guān)聯(lián)(Nature Genetics 41，1105-1109 (2009))。此外，報(bào)道稱，預(yù)測(cè)與PEG干擾素+利巴韋林聯(lián)用療法的效果相關(guān)的6個(gè)SNP內(nèi)，rs8099917是對(duì)治療效果最有影響的(PLoS One. 20100ct 29 ；5(10) :el3771.)。利巴韋林誘發(fā)性貧血是抗丙型肝炎病毒(HCV)療法治療中斷及減量的主要原因之一 (Hepatol Res. 2010Nov ；40(11) :1063-1071.)。報(bào)道稱，以接受PEG干擾素(PEG-1FN)/利巴韋林聯(lián)用療法的日本人丙型肝炎患者為對(duì)象，評(píng)價(jià)了 ITPA基因突變帶來(lái)的臨床意義，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，rsll27354 (其是ITPA外顯子內(nèi)功能性SNP)是利巴韋林誘發(fā)性貧血的有用的預(yù)測(cè)因子(Gastroenterology. 20100ct ；139(4) :1190-7. Epub 2010Jul 14·)。PLoS One. 20100ct 29 ；5(10) el3771.中報(bào)道IL28B(rs8099917)的突變與對(duì)丙型肝炎患者的PEG干擾素+利巴韋林療法強(qiáng)烈相關(guān)，是否有IL28B (rs8099917)的突變使用測(cè)序分析來(lái)檢測(cè)。HePAT0L0GY，Vol. 53，Issue 2，P. 415-421,2011 中報(bào)道，ITPA (rsl 127354)的突變與使用PEG干擾素/利巴韋林療法時(shí)的貧血強(qiáng)烈相關(guān)，ITPA(rsl 127354)的突變使用測(cè)序分析來(lái)檢測(cè)。但是，如PLoSOne. 20100ct 29 ；5(10) el3771.和HePATOLOGY，Vol. 53，Issue 2，P. 415-421,2011所述，為調(diào)查丙型肝炎患者的SNP突變而進(jìn)行的從全血提取基因組，在實(shí)際的臨床現(xiàn)場(chǎng)非常需要人力和成本。因此預(yù)計(jì)很需要從全血直接自動(dòng)測(cè)定是否有突變的技術(shù)。此外，因?yàn)槭褂肞EG干擾素+利巴韋林療法時(shí)，IL28B(rs8099917)和ITPA (rsl 127354)與效果相關(guān)，臨床領(lǐng)域非?？赡芎苄枰瑫r(shí)測(cè)定IL28B(rs8099917)和ITPA (rsl 127354)是否有突變的技術(shù)。但 PLoS One. 20100ct 29 ；5(10) el3771.和 HePATOLOGY, Vol. 53, Issue2,P. 415-421,2011 由于是進(jìn)行測(cè)序分析，來(lái)發(fā)現(xiàn) IL28B (rs8099917)和 ITPA(rsl 127354)有無(wú)突變，因此無(wú)法同時(shí)檢測(cè)兩種突變的有無(wú)。特開(kāi)2002-119291號(hào)公報(bào)中記載了使用經(jīng)熒光染料標(biāo)記的核酸探針、使其與靶標(biāo)核酸雜交、測(cè)定熒光染料發(fā)光的減少量的方法。但是，使用經(jīng)熒光染料標(biāo)記的核酸探針、使其與靶標(biāo)核酸雜交、測(cè)定熒光染料發(fā)光的減少量的過(guò)程實(shí)施時(shí)，并不能對(duì)任何任意序列均可實(shí)施,必須針對(duì)每種突變找到適當(dāng)?shù)男蛄小?br>
發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明要解決的問(wèn)題本發(fā)明以提供下述方法及用于其的試劑盒作為要解決的問(wèn)題，所述方法用于指定能有效檢測(cè)IL28B基因多態(tài)性的rs8099917和ITPA基因多態(tài)性的rsl 127354的探針、檢測(cè)IL28B基因多態(tài)性的rs8099917和ITPA基因多態(tài)性的rsl 127354。用于解決問(wèn)題的手段
本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，通過(guò)基于包含IL28B基因多態(tài)性的rs8099917的特定區(qū)域以及包含ITPA基因多態(tài)性的rsll27354的特定區(qū)域來(lái)設(shè)計(jì)探針，使用該探針，來(lái)通過(guò)檢測(cè)基于與靶標(biāo)核酸形成雜交體和/或雜交體解離的信號(hào)，可檢測(cè)所述的突變，從而實(shí)現(xiàn)本發(fā)明。SP，本發(fā)明如下所述。(I) 一種多態(tài)性檢測(cè)用探針，其是用于檢測(cè)IL28B基因的多態(tài)性的探針，其特征在于包含下述Pl或ΡΓ的熒光標(biāo)記寡核苷酸，(Pl)寡核苷酸，其具有包含序列編號(hào)I所示的堿基序列中的第301 307位的堿基的喊基長(zhǎng)為7 28的喊基序列或與之同源的序列，且與第307位的喊基對(duì)應(yīng)的喊基為胞嘧啶并用熒光染料標(biāo)記；(Pr )寡核苷酸，其具有在嚴(yán)格條件下與包含序列編號(hào)I所示的堿基序列中的第301 307位的堿基的堿基長(zhǎng)為7 28的堿基序列的互補(bǔ)鏈雜交的序列，且與第307位的堿基對(duì)應(yīng)的堿基為胞嘧啶并用熒光染料標(biāo)記。(2) 一種多態(tài)性檢測(cè)用探針，其是用于檢測(cè)TIPA基因的多態(tài)性的探針，其特征在于包含選自下述P2 P3 ’中的至少一種的熒光標(biāo)記寡核苷酸，(P2)寡核苷酸，其具有與包含序列編號(hào)2所示的堿基序列中的第239 251位的堿基的堿基長(zhǎng)為13 28的堿基序列互補(bǔ)的序列或與之同源的序列，且與第239位的堿基對(duì)應(yīng)(即，互補(bǔ))的堿基為胞嘧啶并用熒光染料標(biāo)記；(P2’ )寡核苷酸，其具有在嚴(yán)格條件下與包含序列編號(hào)2所示的堿基序列中的第239 251位的堿基的堿基長(zhǎng)為13 28的堿基序列雜交的序列，且與第239位的堿基對(duì)應(yīng)(即，互補(bǔ))的堿基為胞嘧啶并用熒光染料標(biāo)記；(P3)寡核苷酸，其具有包含序列編號(hào)2所示的堿基序列中的第251 256位的堿基的堿基長(zhǎng)為6 42的堿基序列或與之同源的序列，且第256位的堿基對(duì)應(yīng)的堿基為胞嘧啶，(P3’ )經(jīng)熒光染料標(biāo)記的寡核苷酸，其具有在嚴(yán)格條件下與包含序列編號(hào)2所示的堿基序列中的第251 256位的堿基的堿基長(zhǎng)為6 42的堿基序列的互補(bǔ)鏈雜交的序列，且第256位的堿基對(duì)應(yīng)的堿基為胞嘧啶。(3) (I)或(2)記載的探針，其中，Pl和ΡΓ的寡核苷酸在從3’末端起數(shù)第I位 第3位具有經(jīng)熒光染料標(biāo)記的第307位堿基對(duì)應(yīng)(即，互補(bǔ))的堿基，P2和P2’的寡核苷酸在從3’末端起數(shù)第I位 第3位中的任何的位置具有經(jīng)熒光染料標(biāo)記的第239位堿基對(duì)應(yīng)的堿基，
P3和P3’的寡核苷酸在從3’末端起數(shù)第I位 第3位中的任何的位置具有經(jīng)熒光染料標(biāo)記的第256位堿基對(duì)應(yīng)的堿基。(4) (I)或⑵記載的探針，其中，Pl和ΡΓ的寡核苷酸在3’末端具有經(jīng)熒光染料標(biāo)記的第307位堿基對(duì)應(yīng)的堿基，P2和P2’的寡核苷酸在3’末端具有經(jīng)熒光染料標(biāo)記的第239位堿基對(duì)應(yīng)(即，互補(bǔ))的堿基，P3和P3’的寡核苷酸在3’末端具有經(jīng)熒光染料標(biāo)記的第256位堿基對(duì)應(yīng)的堿基，(5) (I) (4)中任意一項(xiàng)記載的探針，所述熒光標(biāo)記寡核苷酸在不與靶標(biāo)序列雜 交的時(shí)候發(fā)出突光，并且與祀標(biāo)序列雜交的時(shí)候突光強(qiáng)度減少或增加。(6) (5)記載的探針，所述熒光標(biāo)記寡核苷酸在不與靶標(biāo)序列雜交的時(shí)候發(fā)出熒光，并且在與IE標(biāo)序列雜交的時(shí)候突光強(qiáng)度減少。(7) (I) (6)中任意一項(xiàng)記載的探針，其中，Pl和ΡΓ的寡核苷酸的堿基長(zhǎng)為7 23，P2和P2’的寡核苷酸的堿基長(zhǎng)為13 23，P3和P3’的寡核苷酸的堿基長(zhǎng)為6 27。(8) (I) (6)中任意一項(xiàng)記載的探針，其中，Pl和ΡΓ的寡核苷酸的堿基長(zhǎng)為7 18，P2和P2’的寡核苷酸的堿基長(zhǎng)為13 18，P3和P3’的寡核苷酸的堿基長(zhǎng)為6 22。(9)⑴ ⑶中任意一項(xiàng)記載的探針，所述探針是熔解曲線分析用的探針。(10) 一種方法，其是檢測(cè)IL28B基因或ITPA基因中的多態(tài)性的方法，其特征在于使用(I) (9)中任意一項(xiàng)記載的探針。所述方法針對(duì)可能含有所述多態(tài)性的核酸的試樣來(lái)進(jìn)行，包括通過(guò)使所述探針和所述試樣接觸，以及檢測(cè)所述多態(tài)性的有無(wú)。本發(fā)明還包括用于檢測(cè)所述多態(tài)性的探針的使用。(11) 一種方法，其是分別或在一個(gè)反應(yīng)體系中同時(shí)檢測(cè)IL28B基因或ITPA基因中的多態(tài)性的方法，其特征在于，包含下述步驟(I) (IV)，(I)向含有DNA的試樣中，添加⑴ (9)中任意一項(xiàng)記載的探針，使所述探針與所述DNA雜交的步驟，(II)使溫度變化，使所述DNA與所述探針的雜交體形成體解離，測(cè)定基于雜交體形成體的解離的信號(hào)變動(dòng)的步驟，(III)解析所述信號(hào)變動(dòng)以確定Tm值；以及(IV)步驟，基于所述Tm值來(lái)確定目標(biāo)多態(tài)性的有無(wú)或者具有多態(tài)性的堿基序列的豐度比。(12)根據(jù)(11)所述的方法，還包含在⑴步驟之前或與⑴步驟同時(shí)擴(kuò)增DNA。(13) 一種丙型肝炎病毒治療藥物的藥效判定(或預(yù)測(cè))方法，其包括根據(jù)
(10) (12)中任意一項(xiàng)所述的方法，分別或在一個(gè)反應(yīng)體系中同時(shí)檢測(cè)IL28B基因和ITPA基因中的多態(tài)性的步驟；以及基于多態(tài)性的有無(wú)來(lái)判定(或預(yù)測(cè))對(duì)藥劑的耐藥性或藥劑的藥效。所述方法，可在源自要進(jìn)行所述判定/預(yù)測(cè)的被驗(yàn)者(例如人)的試樣中實(shí)施。在本說(shuō)明書(shū)中使用的情況下，“試樣”是指包括可能含有所述多態(tài)性的核酸(例如DNA)。
(14) 一種包含(I) (9)中任意一項(xiàng)記載的探針的試劑盒，其是用于分別或在一個(gè)反應(yīng)體系中同時(shí)檢測(cè)IL28B基因和ITPA基因中的多態(tài)性的試劑盒。(15)根據(jù)(14)記載的試劑盒，其包含Pl或ΡΓ的寡核苷酸、和P2或P2’的寡核苷酸或者P3或P3’的寡核苷酸。(16)根據(jù)(14)或(15)記載的試劑盒，還包含用于擴(kuò)增包含IL28B基因的序列編號(hào)I所示的堿基序列中與Pl或Pr的寡核苷酸雜交的序列的區(qū)域的引物，和/或用于擴(kuò)增包含ITPA基因的序列編號(hào)2所示的堿基序列中與P2或P2’、或者P3或P3’的寡核苷酸雜交的序列的區(qū)域的引物。本發(fā)明還包括用于檢測(cè)所述多態(tài)性的試劑盒的使用。發(fā)明效果向PCR等基因擴(kuò)增體系中添加本發(fā)明的探針，基因擴(kuò)增反應(yīng)完成后，僅進(jìn)行Tm分析，即可對(duì)IL28B基因多態(tài)性的rs8099917和ITPA基因多態(tài)性的rsll27354進(jìn)行分型。并且，因?yàn)榭梢灾苯訖z查全血/ 口腔黏膜懸濁液等，可以減少人力和成本。本發(fā)明的探針具有高特異性。通過(guò)使用本發(fā)明的方法，即使進(jìn)行PCR的情況下，也不必移出擴(kuò)增產(chǎn)物，因此基本上沒(méi)有污染的危險(xiǎn)。此外，本發(fā)明的方法因?yàn)椴襟E簡(jiǎn)單，故而容易自動(dòng)化。通過(guò)本發(fā)明的方法，可以同時(shí)檢測(cè)IL28B基因多態(tài)性的rs8099917和ITPA基因多態(tài)性的rsll27354。使用PEG干擾素+利巴韋林療法，由于IL28B(rs8099917)和ITPA(rsl 127354)與治療的效果有很大關(guān)系，因此能夠同時(shí)檢測(cè)兩種突變?cè)谂R床上具有重大意義。



圖1示出了(A)核酸混合物的熔解曲線、和(B)微分熔解曲線的一個(gè)例子的圖。圖2為使用本發(fā)明的實(shí)施例1中所涉及的多態(tài)性檢測(cè)用探針得到的熔解曲線?？v軸是相對(duì)于單位時(shí)間而言的熒光強(qiáng)度的變化量(d熒光強(qiáng)度增加量/t)，橫軸是溫度(V )。方形示出了野生型，菱形示出了突變型，三角形示出了雜合型(下文中相同)。圖3是使用比較例I中所涉及的多態(tài)性檢測(cè)用探針得到的熔解曲線。圖4是使用本發(fā)明的實(shí)施例2中所涉及的多態(tài)性檢測(cè)用探針得到的熔解曲線。圖5是使用比較例2中所涉及的多態(tài)性檢測(cè)用探針得到的熔解曲線。圖6是使用本發(fā)明的實(shí)施例3的精制人基因組所涉及的多態(tài)性檢測(cè)用探針得到的熔解曲線。左圖是IL28B基因多態(tài)性檢測(cè)的熔解曲線，右圖是ITPA基因多態(tài)性檢測(cè)的熔解曲線(下文中相同)。圖7是使用本發(fā)明的實(shí)施例3的全血所涉及的多態(tài)性檢測(cè)用探針得到的熔解曲線。
具體實(shí)施例方式<1>本發(fā)明的探針和本發(fā)明的檢測(cè)方法本發(fā)明的(Pl)探針是用于檢測(cè)IL28B基因多態(tài)性的rs8099917的探針，其特征在于，包括下述寡核苷酸，所述寡核苷酸具有包含序列編號(hào)I所示的堿基序列中的第301 307位的堿基的堿基長(zhǎng)為7 28的堿基序列或與之同源的序列，且與第307位的堿基對(duì)應(yīng)的堿基為胞嘧啶并用熒光染料標(biāo)記。在參照該上下文時(shí)，“同源的序列”是指與序列編號(hào)I或序列編號(hào)I的所述記載部分同源的序列。堿基長(zhǎng)7 28的堿基序列的全部連續(xù)包含在序列編號(hào)I或“同源的序列”中。本發(fā)明的(ΡΓ )探針是用于檢測(cè)IL28B基因多態(tài)性的rs8099917的探針，其特征在于，包括下述寡核苷酸，所述寡核苷酸具有在嚴(yán)格條件下與包含序列編號(hào)I所示的堿基序列中的第301 307位的堿基的堿基長(zhǎng)為7 28的堿基序列的互補(bǔ)鏈雜交的序列，且與第307位的堿基對(duì)應(yīng)的堿基為胞嘧啶并用熒光染料標(biāo)記。在參照該上下文時(shí)，“雜交的序列”是與序列編號(hào)I或序列編號(hào)I的所述記載部分的互補(bǔ)鏈雜交。堿基長(zhǎng)7 28的堿基序列的全部連續(xù)包含在序列編號(hào)I或“雜交的序列”中。本文中，IL28B基因多態(tài)性的rs8099917是序列編號(hào)I的第301位的堿基。該rs編 號(hào)表不 National Center for Biotechnology Information 的 dbSNP 數(shù)據(jù)庫(kù)(//www. ncb1.nlm. nih. gov/projects/SNP/)的登錄編號(hào)。此外，雖然序列編號(hào)I的第301位示為k,但野生型的堿基為T(mén)，突變型的堿基為G。本發(fā)明的(Pl)或(ΡΓ )探針中，優(yōu)選地，序列編號(hào)I的第301位的堿基為突變型的堿基G。本發(fā)明的(Pl)或(ΡΓ)探針，除了具有序列編號(hào)I中所示的堿基序列中上述指定的序列之外，還可與特開(kāi)2002-119291號(hào)公報(bào)中記載的探針相同地來(lái)制造。(Pl)或(ΡΓ )探針的長(zhǎng)度例如為7 48個(gè)堿基長(zhǎng)、7 28個(gè)堿基長(zhǎng)、7 23個(gè)堿基長(zhǎng)、7 18個(gè)堿基長(zhǎng)。作為本發(fā)明中使用的(Pl)或(ΡΓ )探針的堿基序列的例子，可舉出5’ -ctgtgagcaatGtcaccc-3’ (序列編號(hào)3),大寫(xiě)字母的堿基G對(duì)應(yīng)第301位的堿基。本發(fā)明的(P2)探針是用于檢測(cè)ITPA基因多態(tài)性的rsl 127354的探針，其特征在于，包括下述寡核苷酸，所述寡核苷酸具有與包含序列編號(hào)2所示的堿基序列中的第239 251位的堿基的堿基長(zhǎng)為13 28的堿基序列互補(bǔ)的序列或與之同源的序列，且第239位的堿基對(duì)應(yīng)的堿基為胞嘧啶并用熒光染料標(biāo)記。在參照該上下文時(shí)，“同源的序列”是指與序列編號(hào)2或者序列編號(hào)2的所述記載部分同源的序列。即，所述寡核苷酸包含所述“同源的序列”的互補(bǔ)鏈。堿基長(zhǎng)13 28的堿基序列的全部連續(xù)包含在序列編號(hào)2或者“同源的序列”中。本發(fā)明的(P2’)探針是用于檢測(cè)ITPA基因多態(tài)性的rsll27354的探針，其特征在于，包括下述寡核苷酸，其具有在嚴(yán)格條件下與包含序列編號(hào)2所示的堿基序列中第239 251位的堿基的堿基長(zhǎng)為13 28的堿基序列雜交的序列，且與第239位的堿基對(duì)應(yīng)(即，互補(bǔ))的堿基為胞嘧啶并用熒光染料標(biāo)記。堿基長(zhǎng)13 28的堿基序列的全部連續(xù)包含在序列編號(hào)2中。本文中，ITPA基因多態(tài)性的rsll27354是序列編號(hào)2的第251位的堿基。此外，雖然序列編號(hào)2的第251位示為V，但野生型的堿基是C，突變型的堿基是A。此外，雖然NCBI的SNP站點(diǎn)中，ITPA基因多態(tài)性的rsll27354登錄了 C/A/G三種，但記載稱日本人的C的等位頻率為87. 5%，A的等位頻率為12.5% (沒(méi)有G型的日本人)。此外，僅測(cè)定了 I名報(bào)道G的人(組織)(關(guān)于P3的探針也相同)。優(yōu)選地，本發(fā)明的(P2)或(P2’)的探針與第251位的堿基為突變型的堿基A的序列編號(hào)2的堿基序列互補(bǔ)。本發(fā)明的(P2)或(P2’)探針，除了具有序列編號(hào)2中所示的堿基序列中上述指定的序列之外，還可與特開(kāi)2002-119291號(hào)公報(bào)中記載的淬滅探針相同地來(lái)制造。本發(fā)明的探針的長(zhǎng)度例如為13 48個(gè)堿基長(zhǎng)、13 28個(gè)堿基長(zhǎng)、13 23個(gè)堿基長(zhǎng)、13 18個(gè)堿基長(zhǎng)。作為本發(fā)明中使用的(P2)或(P2’)探針的堿基序列的例子，可舉出5’-gcatgTaaacttatctcc_3’ (序列編號(hào)4),大寫(xiě)字母的堿基T相當(dāng)于第251位的堿基(即，互補(bǔ))。本發(fā)明的(P3)探針是用于檢測(cè)ITPA基因多態(tài)性的rsl 127354的探針，其特征在于，包括寡核苷酸，所述寡核苷酸具有包含序列編號(hào)2所示的堿基序列中的第251 256位 的堿基的堿基長(zhǎng)為6 42的堿基序列或與之同源的序列，且與第256位的堿基對(duì)應(yīng)的堿基為胞嘧啶并用熒光染料標(biāo)記。在參照該上下文時(shí)，“同源的序列”是指與序列編號(hào)2或序列編號(hào)2的所述記載部分同源的序列。堿基長(zhǎng)6 42的堿基序列的全部連續(xù)包含在序列編號(hào)2或“同源的序列”中。本發(fā)明的(P3’)探針是用于檢測(cè)ITPA基因多態(tài)性的rsll27354的探針，其特征在于，包括下述寡核苷酸，所述寡核苷酸具有在嚴(yán)格條件下與包含序列編號(hào)2所示的堿基序列中的第251 256位的堿基的堿基長(zhǎng)為6 42的堿基序列的互補(bǔ)鏈雜交的序列，且與第256位的堿基對(duì)應(yīng)的堿基為胞嘧啶并用熒光染料標(biāo)記。在參照該上下文時(shí)，“雜交的序列”是指與序列編號(hào)2或者序列編號(hào)2的所述記載部分的互補(bǔ)鏈雜交的序列。堿基長(zhǎng)6 42的堿基序列的全部連續(xù)包含在序列編號(hào)2或者“雜交的序列”中。本文中，ITPA基因多態(tài)性的rsl27354是序列編號(hào)2的第251位的堿基。本發(fā)明的(P3)或(P3’ )探針中，優(yōu)選地，序列編號(hào)2的第251位的堿基是野生型的堿基C。本發(fā)明的(P3)或(P3’ )探針，除了具有序列編號(hào)2中所示的堿基序列中上述指定的序列之外，還可與特開(kāi)2002-119291號(hào)公報(bào)中記載的淬滅探針相同地來(lái)制造。本發(fā)明的探針的長(zhǎng)度例如為6 72個(gè)堿基長(zhǎng)、6 42個(gè)堿基長(zhǎng)、6 27個(gè)堿基長(zhǎng)、6 22個(gè)堿基長(zhǎng)。作為本發(fā)明中使用的(P3)或(P3’ )探針的堿基序列的例子，可舉出5’-tctaggagataagtttCcatgc_3’(序列編號(hào)5),大寫(xiě)字母的堿基C相當(dāng)于第251位的堿基。所述熒光染料無(wú)特別限制，例如可舉出熒光素、磷光體、羅丹明、聚甲炔染料衍生物等。作為熒光染料，例如可舉出BODIPY FL(商標(biāo)名，Molecular Probe公司制)、FluorePrime (商品名，Amersham Pharmacia 公司制)、Fluoredite (商品名，Millipore 公司制)、FAM(ABI 公司制)、Cy3 和 Cy5 (Amersham Pharmacia 公司制)、TAMRA(MolecularProbe公司制)等。探針的檢測(cè)條件無(wú)特別限制，可以根據(jù)使用的熒光染料適當(dāng)確定。例如Pacific Blue能夠在檢測(cè)波長(zhǎng)445 280nm下檢測(cè)，TAMRA能夠在檢測(cè)波長(zhǎng)585 700nm下檢測(cè)，BODIPY FL能夠在檢測(cè)波長(zhǎng)520 555nm下檢測(cè)。如果使用這種探針，則能夠根據(jù)信號(hào)的變動(dòng)來(lái)容易地確認(rèn)雜交和解離。熒光染料結(jié)合至寡核苷酸的結(jié)合方法可以按照通常的方法、例如日本專利文獻(xiàn)特開(kāi)2002-119291號(hào)公報(bào)中記載的方法來(lái)進(jìn)行。本申請(qǐng)中“同源的序列”指具有下述序列的堿基序列在指定的堿基序列中，與堿基序列(例如，序列編號(hào)I或者2或者所述記載部分)或堿基序列的互補(bǔ)鏈(或者所述記載部分)具有例如80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%以上的同一性的序列。本申請(qǐng)中，也可以有100%的同一性。
本申請(qǐng)中的雜交可以根據(jù)公知的方法或者基于公知方法的方法，例如MolecularCloning 3rd (J. Sambrook et al. , Cold Spring Harbor Lab. Press, 2001)中記載的方法等來(lái)進(jìn)行。該文獻(xiàn)通過(guò)引用被并入本說(shuō)明書(shū)中。所述雜交例如在嚴(yán)格條件下進(jìn)行。嚴(yán)格條件是指形成特異性雜交體但不形成非特異性雜交體的條件。典型的嚴(yán)格條件例如可以舉出在鉀濃度約25mM 約50mM以及鎂濃度約1. OmM 約5. OmM中進(jìn)行雜交的條件。作為本發(fā)明的條件的一個(gè)例子，可以舉出在Tris-HCl(pH8.6)、25mM的KCl以及1. 5mM的MgCl2下進(jìn)行雜交的條件,但是不限于此。此外,嚴(yán)格條件被記載在MolecularCloning3rd(J. Sambrook et al. ,Cold Spring Harbor Lab. Press, 2001)中。該文獻(xiàn)通過(guò)引用被并入本說(shuō)明書(shū)中。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠通過(guò)改變雜交反應(yīng)、雜交反應(yīng)液的鹽濃度等來(lái)容易地選擇這樣的條件。所述熒光標(biāo)記寡核苷酸中，作為寡核苷酸，除了包含寡核苷酸之外，還包含經(jīng)修飾的寡核苷酸。
作為所述寡核苷酸的構(gòu)成單位，可舉出核糖核苷酸、脫氧核糖核苷酸、人工核酸等。作為所述人工核酸，可舉出DNA、RNA、作為RNA類似物的LNA(鎖核酸，Locked NucleicAcid);作為妝核酸的PNA(Peptide Nucleic Acid);作為橋聯(lián)化核酸的BNA(BridgedNucleic Acid)等。所述寡核苷酸可以是所述構(gòu)成單位中的一種構(gòu)成的，也可以是多種構(gòu)成的。本發(fā)明的(Pl)及(ΡΓ )的探針是與包含序列編號(hào)I的第301 307位的堿基的堿基長(zhǎng)為7 28的堿基序列同源的序列，其顯示具有與序列編號(hào)I的同源性的序列。即，本發(fā)明的(Pl)及(ΡΓ )的探針與包含序列編號(hào)I的第301 307位的堿基的堿基長(zhǎng)為7 28的堿基序列同源，但也可以不完全同一。此外，對(duì)應(yīng)第307位的堿基是胞嘧啶，其被熒光
T 己 O本發(fā)明的(P2)及(P2’ )的探針是包含序列編號(hào)2的第239 251位的堿基的堿基長(zhǎng)為13 28的堿基序列，其顯示與和序列編號(hào)2互補(bǔ)的序列有同源性的序列。即，本發(fā)明的(P2)及(P2’ )的探針與包含序列編號(hào)2的第239 251位的堿基的堿基長(zhǎng)為13 28的堿基序列互補(bǔ)，但也可以不完全互補(bǔ)。此外，對(duì)應(yīng)第239位的堿基是胞嘧啶，其被熒光
T 己 O本發(fā)明的(P3)及(P3’ )的探針是包含序列編號(hào)2的第251 256位的堿基的堿基長(zhǎng)為6 42的堿基序列，其顯示與和序列編號(hào)2有同源性的序列。S卩，本發(fā)明的(P3)及(P3’ )的探針與包含序列編號(hào)2的第251 256位的堿基的堿基長(zhǎng)為6 42的堿基序列同源，但也可以不完全相同。此外，對(duì)應(yīng)第256位的堿基是胞嘧啶，其被熒光標(biāo)記。所述熒光標(biāo)記寡核苷酸例如是其與互補(bǔ)序列雜交時(shí)的熒光強(qiáng)度比未與互補(bǔ)序列雜交時(shí)的熒光強(qiáng)度減少(淬滅)或增加的熒光標(biāo)記寡核苷酸。例如，與互補(bǔ)序列雜交時(shí)的突光強(qiáng)度比未與互補(bǔ)序列雜交時(shí)的突光強(qiáng)度減少的突光標(biāo)記寡核苷酸。利用了這種突光淬滅現(xiàn)象(Quenchingphenomenon)的探針一般稱為鳥(niǎo)嘌呤淬滅探針，已知為所謂Q Probe (注冊(cè)商標(biāo))。例如是下述經(jīng)熒光染料標(biāo)記的寡核苷酸寡核苷酸被設(shè)計(jì)為3’末端或5’末端為C，并用熒光染料標(biāo)記該末端的C使其靠近G時(shí)發(fā)光變?nèi)?。此外，本發(fā)明的探針例如3’被用熒光染料標(biāo)記。此外，本說(shuō)明書(shū)中，“3’末端起數(shù)第I 3位”的情況下，以3’末端作為第I位來(lái)數(shù)。本發(fā)明的檢測(cè)方法為如下方法針對(duì)具有IL28B基因多態(tài)性的rs8099917和/或ITPA基因多態(tài)性的rsll27354的核酸，使用經(jīng)熒光染料標(biāo)記的核酸探針，通過(guò)測(cè)定熒光染料的熒光進(jìn)行熔解曲線分析，基于熔解曲線分析的結(jié)果來(lái)檢測(cè)多態(tài)性，其特征在于，核酸探針是本發(fā)明的探針。本發(fā)明的檢測(cè)方法，例如使用本發(fā)明的探針，其特征在于包括下述步驟。(I)步驟，向含有DNA的試樣中添加本發(fā)明的探針，使所述探針與所述DNA雜交；(II)步驟，使溫度變化，使所述DNA與所述探針的雜交體形成體解離，測(cè)定基于雜交體形成體的解離的信號(hào)變動(dòng)；
(III)步驟，分析所述信號(hào)變動(dòng)、確定Tm值；以及(IV)步驟，基于所述Tm值確定目標(biāo)多態(tài)性的有無(wú)或者具有多態(tài)性的堿基序列的豐度比。此外，(III)中對(duì)Tm值的評(píng)價(jià)中，不僅包括評(píng)價(jià)雜交體形成體的解離溫度,還包括評(píng)價(jià)雜交體形成體熔解時(shí)隨著溫度而變動(dòng)的熒光信號(hào)的微分值的大小。根據(jù)微分值的大小，能評(píng)價(jià)具有多態(tài)性的堿基序列(DNA)的豐度比。作為核酸擴(kuò)增的方法，例如是使用聚合酶的方法，作為其例子，可舉出PCR、I CAN,LAMP等。在通過(guò)使用聚合酶的方法進(jìn)行擴(kuò)增的情況下，例如，可在存在本發(fā)明探針的情況下，進(jìn)行擴(kuò)增。本領(lǐng)域技術(shù)人員易于根據(jù)使用的探針來(lái)調(diào)整擴(kuò)增的反應(yīng)條件等。由此，在核酸擴(kuò)增后僅分析探針的Tm值，因此在反應(yīng)結(jié)束之后不需要處理擴(kuò)增產(chǎn)物。由此，不用擔(dān)心擴(kuò)增產(chǎn)物帶來(lái)的污染。另外，由于能夠用與擴(kuò)增所需的儀器相同的儀器進(jìn)行檢測(cè)，因此不需要移動(dòng)容器。因此，容易自動(dòng)化。另外，作為PCR法中使用的DNA聚合酶，可以使用通常所用的DNA聚合酶，無(wú)特別限制。例如可以為 GeneTaq(Nippon Gene 公司制)、PrimeSTAR Max DNA 聚合酶(TakaraBio公司制)、Taq聚合酶等。作為聚合酶的使用量，只要是采用通常使用的濃度即可，無(wú)特別限制。例如在使用Taq聚合酶的情況下，相對(duì)于反應(yīng)溶液量50 μ 1，可以為O. OlU 100U的濃度。由此，具有能獲得充足的擴(kuò)增產(chǎn)物量等的優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明中，試樣中的DNA可以是單鏈DNA也可以是雙鏈DNA。在所述DNA為雙鏈DNA的情況下，例如可以包括在與所述雜交步驟之前，通過(guò)加熱使所述試樣中的雙鏈DNA解離的步驟。通過(guò)將雙鏈DNA解離成單鏈DNA，可與所述熒光標(biāo)記寡核苷酸進(jìn)行雜交。本發(fā)明中，本發(fā)明的探針相對(duì)于所述試樣中的DNA的添加比例(摩爾比)沒(méi)有限制，從充分確保檢測(cè)信號(hào)來(lái)說(shuō)，例如相對(duì)于試樣中的DNA而言為I倍以下或0.3倍以下。此時(shí)，試樣中的DNA例如可以是發(fā)生了檢測(cè)目標(biāo)多態(tài)性的檢測(cè)對(duì)象DNA和未發(fā)生所述多態(tài)性的非檢測(cè)對(duì)象DNA的合計(jì)，也可以是含有發(fā)生了檢測(cè)目標(biāo)多態(tài)性的檢測(cè)對(duì)象序列的擴(kuò)增產(chǎn)物和含有未發(fā)生所述多態(tài)性的非檢測(cè)對(duì)象序列的擴(kuò)增產(chǎn)物的合計(jì)。此外，試樣中的DNA中的所述檢測(cè)對(duì)象DNA的比例通常是不清楚的，但是結(jié)果上相對(duì)于檢測(cè)對(duì)象DNA (含有檢測(cè)對(duì)象序列的擴(kuò)增產(chǎn)物)而言，所述探針的添加比例(摩爾比)為100倍以下、50倍以下或者30倍以下。另外，其下限無(wú)特別限制，例如為O. 001倍以上、O. 01倍以上或O. 2倍以上。本發(fā)明的探針相對(duì)于所述DNA的添加比例例如可以是相對(duì)于雙鏈DNA的摩爾比，也可以是相對(duì)于單鏈DNA的摩爾比。對(duì)Tm值進(jìn)行說(shuō)明。當(dāng)加熱含有雙鏈DNA的溶液時(shí)，260nm處的吸光度上升。這是因?yàn)殡p鏈DNA中的兩條雙鏈之間的氫鍵由于加熱而斷裂，解離成單鏈DNA(DNA的熔解)。并且，當(dāng)所有的雙鏈DNA解離成為單鏈DNA時(shí)，其吸光度顯示為加熱開(kāi)始時(shí)的吸光度(僅雙鏈DNA的吸光度)的約1. 5倍左右，由此可以判斷熔解完成?；谠摤F(xiàn)象，Tm值一般被設(shè)定為吸光度達(dá)到吸光度總上升量的50%時(shí)的溫度。在本發(fā)明中，用于確定Tm值的、隨溫度變化的信號(hào)變動(dòng)的測(cè)定可以由前述那樣的原理，通過(guò)260nm的吸光度測(cè)定來(lái)進(jìn)行，例如可以測(cè)定如下信號(hào)所述信號(hào)是基于本發(fā)明的探針上添加的標(biāo)記的信號(hào)的信號(hào)，并且該信號(hào)根據(jù)DNA和探針的雜交體形成的狀態(tài)而變動(dòng)。因此，能夠使用例如前述的經(jīng)標(biāo)記探針來(lái)作為本發(fā)明的探針。作為所述經(jīng)標(biāo)記探針，例如可以舉出未與靶標(biāo)序列雜交時(shí)發(fā)出熒光且與靶標(biāo)序列雜交時(shí)熒光強(qiáng)度減少(淬滅)的熒光標(biāo)記寡核苷酸探針，或者未與靶標(biāo)序列雜交時(shí)發(fā)出熒光且與靶標(biāo)序列雜交時(shí)熒光強(qiáng)度增
加的熒光標(biāo)記寡核苷酸探針。如果是前者那樣的探針，與檢測(cè)對(duì)象序列形成雜交體(雙鏈DNA)的時(shí)候不顯示信號(hào)或者信號(hào)弱，而通過(guò)加熱、探針游離時(shí)則顯示出信號(hào)或者信號(hào)增加。另外，如果是后者的探針，通過(guò)與檢測(cè)對(duì)象序列形成雜交體(雙鏈DNA)而顯示出信號(hào)，而通過(guò)加熱、探針游離時(shí)信號(hào)減少(消失)。因此，通過(guò)在信號(hào)特有的條件(吸光度等)下檢測(cè)基于該標(biāo)記的信號(hào)的變化，能夠與所述260nm的吸光度測(cè)定同樣地進(jìn)行熔解以及Tm值的確定。標(biāo)記化探針中的標(biāo)記化物質(zhì)例如如前文所述，可使用熒光染料標(biāo)記化探針。下面，關(guān)于本發(fā)明的多態(tài)性檢測(cè)方法，關(guān)于檢測(cè)基于熒光染料的信號(hào)變化的方法，通過(guò)舉出具體例子來(lái)說(shuō)明。此外，本發(fā)明的多態(tài)性檢測(cè)方法特征在于使用所述多態(tài)性檢測(cè)用探針自身，對(duì)于其它步驟/條件沒(méi)有限制。對(duì)熒光強(qiáng)度的變動(dòng)進(jìn)行測(cè)定時(shí)的溫度范圍無(wú)特別限制，例如起始溫度可以為室溫 85°C，或25 70°C，結(jié)束溫度例如可以為40 105°C。另外，溫度的上升速度無(wú)特別限制，例如可以為O. 1°C /秒 20°C /秒，或O. 30C /秒 5°C /秒。下面，分析所述信號(hào)的變動(dòng)并確定Tm值。具體而言，基于所得的熒光強(qiáng)度來(lái)計(jì)算各溫度下的微分值(-d熒光強(qiáng)度/dt)，將顯示最低值的溫度確定為T(mén)m值。另外，可以將每單位時(shí)間的熒光強(qiáng)度增加量(熒光強(qiáng)度增加量/t)最高的點(diǎn)確定為T(mén)m值。此外，在標(biāo)記化探針采用由于雜交體形成而信號(hào)強(qiáng)度增加的探針而不采用淬滅探針的情況下，相反地測(cè)定熒光強(qiáng)度的減少量即可。另外，在本發(fā)明中，如前所述，對(duì)雜交體進(jìn)行加熱，并測(cè)定伴隨溫度上升的熒光信號(hào)變動(dòng)(例如熒光強(qiáng)度的增加)，但替代該方法，例如也可以測(cè)定雜交體形成時(shí)的信號(hào)變動(dòng)。即，也可以對(duì)降低添加了所述探針的試樣的溫度來(lái)形成雜交體形成體時(shí)隨所述溫度下降的熒光信號(hào)變動(dòng)進(jìn)行測(cè)定。作為具體例，在使用較之未和互補(bǔ)序列雜交時(shí)的熒光強(qiáng)度而言與互補(bǔ)序列雜交時(shí)熒光強(qiáng)度減少(淬滅)的熒光標(biāo)記寡核苷酸探針(例如QProbe)的情況下，當(dāng)在試樣中添加了所述探針時(shí)，所述探針處于解離狀態(tài)因此熒光強(qiáng)度大，當(dāng)由于溫度下降而形成雜交體形成體時(shí)，所述熒光減少(或淬滅)。因此，例如可以慢慢降低所述加熱的試樣的溫度，并測(cè)定伴隨溫度下降的熒光強(qiáng)度的減少。另一方面，在使用由于雜交體形成而信號(hào)增加的經(jīng)標(biāo)記探針的情況下，當(dāng)在試樣中添加了所述探針時(shí)，所述探針處于解離狀態(tài)因此熒光強(qiáng)度小(或淬滅)，但是在由于溫度下降而形成雜交體時(shí)，熒光強(qiáng)度增加。因此，例如可以慢慢降低所述試樣的溫度，并測(cè)定隨溫度下降的熒光強(qiáng)度的增加。作為進(jìn)行核酸擴(kuò)增時(shí)的模板的核酸，只要是含有核酸即可，無(wú)特別限制，例如血液、口腔粘膜懸浮液、指甲或毛發(fā)等體細(xì)胞、生殖細(xì)胞、乳汁、腹水液、石蠟包埋組織、胃液、胃洗滌液、腹膜液、羊水、細(xì)胞培養(yǎng)等任意的源自或者可以源自生物學(xué)起源的物質(zhì)。作為模板的核酸可以從該起源得到后直接使用，或者為了改變所述樣品的特性而經(jīng)預(yù)處理之后使用。例如，在將全血作為試樣的情況下，可以通過(guò)現(xiàn)有的公知方法來(lái)從全血中分離基因組DNA。例如，可以使用市售的基因組DNA分離盒(商品名GFX Genomic Blood DNAPurification kit ；GE Healthcare Bioscience 公司制造)等。應(yīng)用于PCR法的引物只要是能夠擴(kuò)增本發(fā)明的多態(tài)性檢測(cè)用探針能夠雜交的區(qū)域，則無(wú)特別限制，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠基于序列編號(hào)I或2所示的堿基序列來(lái)適當(dāng)設(shè)計(jì)。引物的長(zhǎng)度和Tm值可以設(shè)為12mer 40mer和40°C 70°C，或16mer 30mer和55°C ·60。。。另外，引物對(duì)的各引物的長(zhǎng)度也可以不相同，但是優(yōu)選兩引物的Tm值基本相同(或者，兩引物之間Tm值之差在5°C以內(nèi))。Tm分析除了用于測(cè)定本發(fā)明探針的熒光染料的熒光之外，可根據(jù)通常的方法來(lái)進(jìn)行。熒光的測(cè)定可以使用對(duì)應(yīng)于熒光染料的波長(zhǎng)的激發(fā)光，來(lái)測(cè)定發(fā)光波長(zhǎng)的光。Tm分析中的升溫速度通常為0.1 1°C/秒。進(jìn)行Tm分析時(shí)的反應(yīng)溶液的組成只要探針與具有和其堿基序列互補(bǔ)的序列的核酸雜交能雜交即可，并無(wú)特殊限制，但通常一價(jià)陽(yáng)離子濃度為1. 5 5mM，pH為7 9。PCR等應(yīng)用DNA聚合酶的擴(kuò)增方法的反應(yīng)溶液通常滿足該條件，因此擴(kuò)增后的反應(yīng)液可原樣用于Tm分析。基于Tm分析的結(jié)果，檢測(cè)IL28B基因多態(tài)性的rs8099917和/或ITPA基因多態(tài)性的rsll27354可按照通常的方法來(lái)進(jìn)行。本發(fā)明中的檢測(cè)包含檢測(cè)突變的有無(wú)。此外，因?yàn)橥ㄟ^(guò)本發(fā)明的探針和方法，能夠檢測(cè)突變的有無(wú)，因此本發(fā)明也包括基于突變的有無(wú)，來(lái)判斷或預(yù)測(cè)丙型肝炎病毒治療藥物的藥效和對(duì)丙型肝炎病毒治療藥物的耐藥性。具體而言，IL28B基因多態(tài)性的rs8099917的堿基是野生型的T的情況下(T/T)，提示PEG干擾素+利巴韋林聯(lián)用療法是有效的，而包含突變型的G的情況下(G/T或T/G)，提示為無(wú)效。另外，ITPA基因多態(tài)性的rsll27354的堿基包含突變型的A的情況下(A/A或C/A)，作為利巴韋林的副作用的重度貧血難于發(fā)病，提示利巴韋林的高用量施用是可能的。此外，根據(jù)本發(fā)明的方法，可同時(shí)檢測(cè)IL28B基因多態(tài)性的rs8099917和ITPA基因多態(tài)性的rsll27354?！?>本發(fā)明的試劑盒本發(fā)明的試劑盒是用于本發(fā)明的檢測(cè)方法的試劑盒。該試劑盒特征在于，包含包括所述寡核苷酸的核酸探針，所述核酸探針是經(jīng)熒光染料標(biāo)記、雜交時(shí)熒光染料的熒光變化的核酸探針(例如淬滅探針)。另外，本發(fā)明的試劑盒也能用于判斷或預(yù)測(cè)丙型肝炎病毒治療藥物的藥效和對(duì)丙型肝炎病毒治療藥物的耐藥性。本發(fā)明的檢測(cè)試劑盒除了探針之外還可包含進(jìn)行本發(fā)明的檢測(cè)方法中的核酸擴(kuò)增所必要的試劑類，特別是用于進(jìn)行使用DNA聚合酶的擴(kuò)增的引物。具體而言，本發(fā)明的引物是用于擴(kuò)增包含IL28B基因的序列編號(hào)I所示的堿基序列中與Pl或ΡΓ的寡核苷酸雜交的序列的區(qū)域的引物，和/或是用于擴(kuò)增包含ITPA基因的序列編號(hào)2所示的堿基序列中與P2或P2’、或者P3或P3’的寡核苷酸雜交的序列的區(qū)域的引物。本發(fā)明的檢測(cè)試劑盒中，探針、引物和其它試劑類可單獨(dú)收納，這些中的一部分作為混合物也是可以的。下面，根據(jù)實(shí)施例來(lái)具體說(shuō)明本發(fā)明。但是，這些實(shí)施例僅作示例用，并不被限于這些。本發(fā)明中，如無(wú)特別指明，關(guān)于作為檢測(cè)對(duì)象的試樣中的試樣核酸、多態(tài)性檢測(cè)用探針或引物的各條序列，基于它們之間的相互關(guān)系記述的事項(xiàng)，只要不特別指出，也適用于各個(gè)序列和相對(duì)各序列而互補(bǔ)的序列。本發(fā)明的事項(xiàng)適用于相對(duì)各序列而互補(bǔ)的所述序列時(shí)，由該互補(bǔ)的序列識(shí)別的序列，在本領(lǐng)域技術(shù)人員的技術(shù)常識(shí)的范圍內(nèi)，視為將說(shuō)明書(shū)全體替換為與對(duì)應(yīng)的本說(shuō)明書(shū)中記載的序列互補(bǔ)的序列。實(shí)施例實(shí)施例1 (以IL28B的模板寡核苷酸作為檢測(cè)對(duì)象，使用單一探針的情況)基于包含IL28B基因多態(tài)性的rs8099917的位點(diǎn)的堿基序列(序列編號(hào)I)，設(shè)計(jì)了表I所不的在3’末端具有C的探針。表I中，探針的位置表不序列編號(hào)I所不的喊基序列中的堿基編號(hào)。通過(guò)BODIPY FL的標(biāo)記按照常規(guī)方法來(lái)進(jìn)行。另外，作為檢測(cè)對(duì)象使用的模板寡核苷酸(突變型(序列編號(hào)I)和野生型(序列編號(hào)11))的序列在表I中不出。表I中，寡核苷酸的位置表不序列編號(hào)I所不的堿基序列中的堿基編號(hào)。此外，雜合型的時(shí)候，序列編號(hào)10、11的模板寡核苷酸以1:1混合用于試樣。表I
權(quán)利要求
1.一種多態(tài)性檢測(cè)用探針，其是用于檢測(cè)IL28B基因的多態(tài)性的探針，其特征在于包含下述Pl或ΡΓ的熒光標(biāo)記寡核苷酸，(PD寡核苷酸，其具有包含序列編號(hào)I所示的堿基序列中的第301 307位的堿基的堿基長(zhǎng)為7 28的堿基序列或與之同源的序列，且與第307位的堿基對(duì)應(yīng)的堿基為胞嘧啶并用熒光染料標(biāo)記；(ΡΓ)寡核苷酸，其具有在嚴(yán)格條件下與包含序列編號(hào)I所示的堿基序列中的第301 307位的堿基的堿基長(zhǎng)為7 28的堿基序列的互補(bǔ)鏈雜交的序列，且與第307位的堿基對(duì)應(yīng)的堿基為胞嘧啶并用熒光染料標(biāo)記。
2.一種多態(tài)性檢測(cè)用探針，其是用于檢測(cè)TIPA基因的多態(tài)性的探針，其特征在于包含選自下述P2 P3’中的至少一種的突光標(biāo)記寡核苷酸，(P2)寡核苷酸，其具有與包含序列編號(hào)2所示的堿基序列中的第239 251位的堿基的堿基長(zhǎng)為13 28的堿基序列互補(bǔ)的序列或與之同源的序列，且與第239位的堿基互補(bǔ)的堿基為胞嘧啶并用熒光染料標(biāo)記；(P2’)寡核苷酸，其具有在嚴(yán)格條件下與包含序列編號(hào)2所示的堿基序列中的第239 251位的堿基的堿基長(zhǎng)為13 28的堿基序列雜交的序列，且與第239位的堿基互補(bǔ)的堿基為胞嘧啶并用熒光染料標(biāo)記；(P3)寡核苷酸，其具有包含序列編號(hào)2所示的堿基序列中的第251 256位的堿基的堿基長(zhǎng)為6 42的堿基序列或與之同源的序列，且與第256位的堿基對(duì)應(yīng)的堿基為胞嘧啶并用熒光染料標(biāo)記；(P3’)寡核苷酸，其具有在嚴(yán)格條件下與包含序列編號(hào)2所示的堿基序列中的第251 256位的堿基的堿基長(zhǎng)為6 42的堿基序列的互補(bǔ)鏈雜交的序列，且與第256位的堿基對(duì)應(yīng)的堿基為胞嘧啶并用熒光染料標(biāo)記。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的探針，其中，Pl和ΡΓ的寡核苷酸在從3’末端起數(shù)第I位 第3位的位置具有經(jīng)熒光染料標(biāo)記的與第307位堿基對(duì)應(yīng)的堿基，P2和P2’的寡核苷酸在從3’末端起數(shù)第I位 第3位中的任何的位置具有經(jīng)熒光染料標(biāo)記的與第239位堿基互補(bǔ)的堿基，P3和P3’的寡核苷酸在從3’末端起數(shù)第I位 第3位中的任何的位置具有經(jīng)熒光染料標(biāo)記的與第256位堿基對(duì)應(yīng)的堿基。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的探針，其中，Pl和ΡΓ的寡核苷酸在3’末端具有經(jīng)熒光染料標(biāo)記的與第307位堿基對(duì)應(yīng)的堿基， P2和P2’的寡核苷酸在3’末端具有經(jīng)熒光染料標(biāo)記的與第239位堿基互補(bǔ)的堿基， P3和P3’的寡核苷酸在3’末端具有經(jīng)熒光染料標(biāo)記的與第256位堿基對(duì)應(yīng)的堿基。
5.根據(jù)權(quán)利要求1 4中任意一項(xiàng)所述的探針，所述突光標(biāo)記寡核苷酸在未與祀標(biāo)序列雜交的時(shí)候發(fā)出突光，并且與祀標(biāo)序列雜交的時(shí)候突光強(qiáng)度減少或增加。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的探針，所述熒光標(biāo)記寡核苷酸在未與靶標(biāo)序列雜交的時(shí)候發(fā)出突光，并且在與祀標(biāo)序列雜交的時(shí)候突光強(qiáng)度減少。
7.根據(jù)權(quán)利要求1 6中任意一項(xiàng)所述的探針，其中，Pl和Pr的寡核苷酸的堿基長(zhǎng)為7 23，P2和P2’的寡核苷酸的堿基長(zhǎng)為13 23，P3和P3’的寡核苷酸的堿基長(zhǎng)為6 27。
8.根據(jù)權(quán)利要求1 6中任意一項(xiàng)所述的探針，其中，Pl和ΡΓ的寡核苷酸的堿基長(zhǎng)為7 18，P2和P2’的寡核苷酸的堿基長(zhǎng)為13 18，P3和P3’的寡核苷酸的堿基長(zhǎng)為6 22。
9.根據(jù)權(quán)利要求1 8中任意一項(xiàng)所述的探針，所述探針是用于熔解曲線分析的探針。
10.一種IL28B基因或ITPA基因中的多態(tài)性的檢測(cè)方法，其特征在于使用權(quán)利要求1 9中任意一項(xiàng)所述的探針。
11.一種分別或在一個(gè)反應(yīng)體系中同時(shí)檢測(cè)IL28B基因和ITPA基因中的多態(tài)性的方法，其特征在于，包含下述步驟(I) (IV)，(I)步驟，向含有DNA的試樣中，添加權(quán)利要求1 9中任意一項(xiàng)所述的探針，使所述探針與所述DNA雜交；(II)步驟，使溫度變化，使所述DNA與所述探針的雜交體形成體解離，測(cè)定基于雜交體形成體的解離的信號(hào)變動(dòng)；(III)步驟，分析所述信號(hào)變動(dòng)以確定Tm值；以及(IV)步驟，基于所述Tm值來(lái)確定目標(biāo)多態(tài)性的有無(wú)或者具有多態(tài)性的堿基序列的豐 1匕。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，還包含在(I)步驟之前或與(I)步驟同時(shí)擴(kuò)增DNA。
13.一種丙型肝炎病毒治療藥物的藥效判定方法，其包括根據(jù)權(quán)利要求10 12中任意一項(xiàng)所述的方法，分別或在一個(gè)反應(yīng)體系中同時(shí)檢測(cè)IL28B基因和ITPA基因中的多態(tài)性的步驟；以及基于多態(tài)性的有無(wú)來(lái)判定對(duì)藥劑的耐藥性或藥劑的藥效。
14.一種包含權(quán)利要求1 9中任意一項(xiàng)所述的探針的試劑盒，其是用于分別或在一個(gè)反應(yīng)體系中同時(shí)檢測(cè)IL28B基因和ITPA基因中的多態(tài)性的試劑盒。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的試劑盒，其包含Pl或ΡΓ的寡核苷酸、以及P2或P2’的寡核苷酸或者P3或P3’的寡核苷酸。
16.根據(jù)權(quán)利要求14或15所述的試劑盒，還包含用于擴(kuò)增包含IL28B基因的序列編號(hào)I所示的堿基序列中與Pl或ΡΓ的寡核苷酸雜交的序列的區(qū)域的引物，和/或用于擴(kuò)增包含ITPA基因的序列編號(hào)2所示的堿基序列中與P2或P2’、或者P3或P3’ 的寡核苷酸雜交的序列的區(qū)域的引物。
全文摘要
本發(fā)明涉及檢測(cè)IL28B(rs8099917)和ITPA(rs1127354)的突變的方法，還涉及用于該目的的核酸探針和試劑盒。具體地，本發(fā)明提供一種多態(tài)性檢測(cè)用探針，其是用于檢測(cè)IL28B基因的多態(tài)性的探針，其特征在于包含下述P1或P1’的熒光標(biāo)記寡核苷酸，(P1)寡核苷酸，其具有包含序列編號(hào)1所示的堿基序列中的第301～307位的堿基的堿基長(zhǎng)為7～28的堿基序列或與之同源的序列，且與第307位的堿基對(duì)應(yīng)的堿基為胞嘧啶并經(jīng)熒光染料標(biāo)記；(P1’)寡核苷酸，其具有在嚴(yán)格條件下與包含序列編號(hào)1所示的堿基序列中的第301～307位的堿基的堿基長(zhǎng)為7～28的堿基序列的互補(bǔ)鏈雜交的序列，且與第307位的堿基對(duì)應(yīng)的堿基為胞嘧啶并經(jīng)熒光染料標(biāo)記。
文檔編號(hào)C12N15/11GK102994629SQ201210353290
公開(kāi)日2013年3月27日 申請(qǐng)日期2012年9月14日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月15日
發(fā)明者黑瀨薰, 細(xì)見(jiàn)敏也 申請(qǐng)人:愛(ài)科來(lái)株式會(huì)社