專利名稱：黃麻鏈霉菌nf0919菌株代謝產(chǎn)物在葡萄病害防治上的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種微生物及用途，更具體地說(shuō)涉及一種黃麻鏈霉菌iStreptomycesmrdor狀ii)NF0919菌株發(fā)酵液中代謝產(chǎn)物的提取方法，及提取物在葡萄病害防治上的應(yīng)用，屬于生物農(nóng)藥技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
由植物病原真菌圍小叢殼菌(Mlomerella ci/ 濟(jì)侵染引發(fā)的葡萄炭疽病、囊孢殼菌iPhysalospora侵染引發(fā)的葡萄房枯病、鏈格孢菌iAlternaria viticola)引發(fā)的葡萄穗軸褐腐(枯)病、Coniothyrium dlodiella侵染引發(fā)的葡萄白腐病、單軸霉屬iPlasmopara vi ticola)侵染引發(fā)的葡萄霜霉病、灰葡萄孢菌(此cinerea )侵染引發(fā)的葡萄灰霉病和痂囊腔菌ampelina)侵染引發(fā)的葡萄黑痘病是我國(guó)葡萄上發(fā)生的主要病害?！て咸巡『Ξ?dāng)前主要通過(guò)化學(xué)防治來(lái)防控，常用的化學(xué)藥劑有甲基硫菌靈(thiophanate-methyl)、波爾多液(bordeaux mixture)、五氯酌·鈉(sodiumpentachlorophenol)λ 乙酸銅(cupric acetate)、啼菌酯(azoxystrobin)、醚菌酯(kresoxim-methyl)、啼霉胺(pyrimethanil)、苯醚甲環(huán)唑(difenoconazole)、烯 B虧菌酯(enestroburin)、氟嗎啉(fIumorph)、卩定酸菌胺(boscalid)、甲霜靈(metalaxyl)、霜霉威(propamocarb)、多菌靈(carbendazim)、咪鮮胺(prochloraz)、卩比唑醚菌酯(pyraclostrobin)和烯酰嗎啉(dimethomorph)等。長(zhǎng)期以來(lái)，由于多頻次、多劑量施用化學(xué)藥劑，造成葡萄病原菌對(duì)常用化學(xué)藥劑都產(chǎn)生了不同程度的抗(耐)藥性，生產(chǎn)上屢屢出現(xiàn)防治失敗的事例。目前成功用于防治葡萄病害的生物農(nóng)藥專用制劑還沒(méi)有。文獻(xiàn)已報(bào)道生物防治控制葡萄病害的生防菌屬(種)主要有(I)木霉菌屬真菌Spp.)中的綠色木^ (Trichoderma viride )^ Pp1(Trichoderma harzianum)和長(zhǎng)枝木霉艦longi brachi a turn ) ； (2)芽抱桿菌屬細(xì)菌spp.)中的枯草芽抱桿菌
錯(cuò)質(zhì)芽抱桿菌{Bacillus cereus)、多粘芽抱桿菌(抱^77心polymyxa )、巨大芽抱桿菌和解淀粉芽抱桿菌amyloliquefaciens)； (3)單格孢菌(Ulocladium atrum) ; (4)鏈霉菌屬細(xì)菌焊c^spp.)中的灰綠鏈霉菌(Streptomyces griseovirides) λ{(lán)Streptomyces hygroscopicus)Λ(51 treptomyces aureochromogenes)矛口鏈霉菌(51 treptomyces kitasazwaensis) ； (5) {叚單胞菌屬細(xì)菌(戶似肌spp.)中的洋蔥假單胞菌(Pseudomonas、焚光假單胞
細(xì)菌(戶似肌和惡臭假單胞菌(戶似肌putida)； (6)酵母菌中的季也蒙畢赤氏酵母CPicAia guiIIiermondii)和羅倫隱球酵母Iaurentii)
坐寸O大多數(shù)菌株或制劑只能防治一種病害，而利用同一頡頏放線細(xì)菌同時(shí)兼治葡萄多種病害在現(xiàn)有技術(shù)中沒(méi)有提及和公開。

發(fā)明內(nèi)容
提供黃麻鏈霉菌iStreptomyces cor chorus ii ) NF0919菌株發(fā)酵液中產(chǎn)物的提取方法，及提取物在防治葡萄炭疽病、葡萄房枯病、葡萄穗軸褐腐病、葡萄灰霉病、葡萄黑痘病和葡萄白腐病上的應(yīng)用。本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的
本發(fā)明中提供用的黃麻鏈霉菌NF0919菌株的菌株特征，見(jiàn)專利ZL 201010236886. I。黃麻鏈霉菌(拉丁文學(xué)名為Streptomyces corchorusii) NF0919菌株，已于2010年7月8 日在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，保藏單位地址為北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，保藏編號(hào)為=CGMCC No. 3968。本發(fā)明的黃麻鏈霉菌NF0919菌株發(fā)酵液中代謝產(chǎn)物的提取方法，包括以下步驟
(A)菌株的活化與一級(jí)種子培養(yǎng)液的培養(yǎng)
將保存的NF0919菌株的斜面在高氏一號(hào)培養(yǎng)基上活化，30°C培養(yǎng)10 d，挑取I cm2大小的菌塊接種于50 mL—級(jí)種子培養(yǎng)液中(250 mL三角瓶裝培養(yǎng)液50 mL)，置于170 rpm搖床上30°C振蕩培養(yǎng)44 48 h，其中所述的50 mL—級(jí)種子培養(yǎng)液的成分為可溶性淀粉3%，葡萄糖2%，酵母粉1%，蛋白胨l%，NaCl O. 5%, K2HPO4 O. 2%，可溶性淀粉、葡萄糖、酵母粉、蛋白胨、NaCl和K2HPO4含量的單位比例為W/V;
(B)二級(jí)種子培養(yǎng)液的培養(yǎng)
將步驟(A)所得一級(jí)種子培養(yǎng)液按5% (V/V)的接種量接入50 mL 二級(jí)種子培養(yǎng)液中(250 mL三角瓶裝培養(yǎng)液50 mL),170 rpm,30 °C搖床上培養(yǎng)48 - 52 h，其中所述的5%的單位比例為V/V ;所述的50 mL 二級(jí)種子培養(yǎng)液的成分(W/V):馬鈴薯淀粉8. 5%，棉籽蛋白2. 2%, CaCO3 O. 1%，K2HPO4 O. 05%, MgSO4 O. 05%,淀粉酶 O. 01%,馬鈴薯淀粉、棉籽蛋白、CaCO3、K2HPO4^MgSO4和淀粉酶含量的單位比例為W/V ；
(C)發(fā)酵培養(yǎng)液的培養(yǎng)
將步驟(B)所得二級(jí)種子培養(yǎng)液按5% (V/V)的接種量接種于裝有160 L發(fā)酵培養(yǎng)液的容積為200 L的發(fā)酵罐中，其中所述的5%的單位比例為V/V，設(shè)置發(fā)酵參數(shù)為溶氧100%，消泡劑I. 6 L，攪拌速度為360 rpm,發(fā)酵溫度為36 °C，發(fā)酵時(shí)間為72 h，pH 6. 8 7. 2，所述的發(fā)酵培養(yǎng)液的成分為(W/V):馬鈴薯淀粉8. 5%，棉籽蛋白2. 6%，K2HPO4 O. 05%, NaClO. 2%, MgSO4 O. 05%, CaCO3 O. 1%，ρΗ7· 2-7. 4，馬鈴薯淀粉、棉籽蛋白、K2HPO4、NaCl、MgSO4和CaCO3含量的單位比例為W/V ;所述的消泡劑為XP-100F系列發(fā)酵用有機(jī)硅消泡劑；
(D)NF0919菌株發(fā)酵液中代謝產(chǎn)物分離方法
把步驟(C)所得發(fā)酵液在10000 rpm離心5 min得上清液，用濃鹽酸調(diào)節(jié)pH至2. 0，出現(xiàn)沉淀，再次離心，收集沉淀物，用乙酸乙酯萃取3次，35°C真空干燥得提取物。本發(fā)明的有益效果是
本發(fā)明提供黃麻鏈霉菌NF0919菌株發(fā)酵液中代謝產(chǎn)物的提取方法，并證明其提取物可同時(shí)防治葡萄的果實(shí)、葉柄和葉片上的多種病害。大田防治結(jié)果表明，該菌株代謝產(chǎn)物對(duì)葡萄炭疽病、葡萄房枯病、葡萄穗軸褐腐、葡萄灰霉病、葡萄黑痘病和白腐病等葡萄病害均有很好的防治效果。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例本發(fā)明中提供用的黃麻鏈霉菌NF0919菌株的菌株特征，見(jiàn)專利ZL201010236886. I。本發(fā)明黃麻鏈霉菌NF0919菌株發(fā)酵液中產(chǎn)物的提取方法，包括以下步驟
(A)菌株的活化與一級(jí)種子培養(yǎng)液的培養(yǎng)
將保存的NF0919菌株的斜面在高氏一號(hào)培養(yǎng)基上活化，30°C培養(yǎng)10 d，挑取I cm2大小的菌塊接種于50 mL—級(jí)種子培養(yǎng)液中(250 mL三角瓶裝培養(yǎng)液50 mL)，置于170 rpm搖床上30°C振蕩培養(yǎng)44 48 h，其中所述的50 mL—級(jí)種子培養(yǎng)液的成分為可溶性淀粉3%，葡萄糖2%，酵母粉1%，蛋白胨l%，NaCl O. 5%, K2HPO4 O. 2%，可溶性淀粉、葡萄糖、酵母粉、蛋白胨、NaCl和K2HPO4含量的單位比例為W/V?！?br> (B) 二級(jí)種子培養(yǎng)液的培養(yǎng)
將步驟(A)所得一級(jí)種子培養(yǎng)液按5% (V/V)的接種量接入50 mL 二級(jí)種子培養(yǎng)液中(250 mL三角瓶裝培養(yǎng)液50 mL),170 rpm,30 °C搖床上培養(yǎng)48 - 52 h，其中所述的5%的單位比例為V/V ;所述的50 mL 二級(jí)種子培養(yǎng)液的成分(W/V):馬鈴薯淀粉8. 5%，棉籽蛋白
2.2%, CaCO3 O. 1%，K2HPO4 O. 05%, MgSO4 O. 05%,淀粉酶 O. 01%,馬鈴薯淀粉、棉籽蛋白、CaCO3、K2HPO4^MgSO4和淀粉酶含量的單位比例為W/V。(C)發(fā)酵培養(yǎng)液的培養(yǎng)
將步驟(B)所得二級(jí)種子培養(yǎng)液按5% (V/V)的接種量接種于裝有160 L發(fā)酵培養(yǎng)液的容積為200 L的發(fā)酵罐中，其中所述的5%的單位比例為V/V，設(shè)置發(fā)酵參數(shù)為溶氧100%，消泡劑I. 6 L，攪拌速度為360 rpm,發(fā)酵溫度為36 °C，發(fā)酵時(shí)間為72 h，pH 6. 8 7. 2，所述的發(fā)酵培養(yǎng)液的成分為(W/V):馬鈴薯淀粉8. 5%，棉籽蛋白2. 6%，K2HPO4 O. 05%, NaClO. 2%, MgSO4 O. 05%, CaCO3 O. 1%，ρΗ7· 2-7. 4，馬鈴薯淀粉、棉籽蛋白、K2HPO4、NaCl、MgSO4和CaCO3含量的單位比例為W/V ;所述的消泡劑為XP-100F系列發(fā)酵用有機(jī)硅消泡劑。(D) NF0919菌株發(fā)酵液中代謝產(chǎn)物的提取方法
把步驟(C)所得發(fā)酵液在10000 rpm離心5 min得上清液，用濃鹽酸調(diào)節(jié)pH至2. 0，出現(xiàn)沉淀，再次離心，收集沉淀物，用乙酸乙酯萃取3次，35°C真空干燥得提取物。本實(shí)施例的實(shí)施效果
(I )NF0919菌株發(fā)酵液的提取物，對(duì)葡萄炭疽病菌、葡萄房枯病菌、葡萄穗軸褐腐病菌、葡萄灰霉病菌、葡萄黑痘病菌和葡萄白腐病菌的室內(nèi)毒力測(cè)定
NF0919菌株發(fā)酵液的提取物對(duì)葡萄炭疽病菌、葡萄房枯病菌、葡萄穗軸褐腐病菌、葡萄灰霉病菌、葡萄黑痘病菌和葡萄白腐病菌的室內(nèi)毒力測(cè)定方法如下
取適量提取物，用無(wú)菌水梯度稀釋，制成含提取物濃度分別10、5、2. 5、1.25、O. 625,0 mg/L的PDA平板，并設(shè)無(wú)菌水為空白對(duì)照，對(duì)照藥劑用化學(xué)藥劑為98%多菌靈(carbendazim)按上述相同稀釋濃度制成含藥PDA平板。用直徑為4 mm的打孔器分別在長(zhǎng)有葡萄炭疽病菌、葡萄房枯病菌、葡萄穗軸褐腐病菌、葡萄灰霉病菌、葡萄黑痘病菌和葡萄白腐病菌的PDA平板的邊緣打取菌餅，將菌餅接種到上述含藥(提取物和多菌靈)平板中央，每個(gè)病原菌的每個(gè)濃度設(shè)4個(gè)重復(fù)。將平板置于25°C保溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)72 h。用十字交叉法測(cè)定菌落凈生長(zhǎng)直徑(菌落凈生長(zhǎng)直徑=菌落直徑一菌餅直徑)，計(jì)算抑制率。抑制率=(空白對(duì)照菌落凈生長(zhǎng)直徑一含藥的菌落凈生長(zhǎng)直徑)/空白對(duì)照菌落凈生長(zhǎng)直徑X 100%。用DPS 13. O軟件計(jì)算毒力回歸方程。NF0919發(fā)酵液的提取物對(duì)葡萄炭疽病菌、葡萄房枯病菌、葡萄穗軸褐腐病菌、葡萄灰霉病菌、葡萄黑痘病菌和葡萄白腐病菌的室內(nèi)毒力測(cè)定結(jié)果
毒力測(cè)定結(jié)果表明，NF0919菌株發(fā)酵液的提取物對(duì)葡萄炭疽病菌、葡萄房枯病菌、葡萄穗軸褐腐病菌、葡萄灰霉病菌、葡萄黑痘病菌和葡萄白腐病菌菌絲的生長(zhǎng)均有強(qiáng)烈抑制作用(表 I)，對(duì) 6 個(gè)病原菌的 EC5tl 值(表 3)分別為 O. 5514 mg/L、0. 7529 mg/L、I. 4329 mg/L、1.1984 mg/LU. 9479 mg/L和0. 2876 mg/L。相比之下，相同稀釋倍數(shù)條件下98%多菌靈對(duì)葡萄炭疽病菌、葡萄房枯病菌、葡萄穗軸褐腐病菌、葡萄灰霉病菌、葡萄黑痘病菌和葡萄白腐病菌的菌絲生長(zhǎng)抑制率(表2)較低，其EC5tl值(表3)分別為1.6830 mg/L、3. 1266 mg/L、 5.2827 mg/LU. 5762 mg/L、7· 1469 mg/L 和 0. 6975 mg/L。NF0919 發(fā)酵液活性的提取物對(duì)葡萄病原菌的室內(nèi)毒力極顯著高于化學(xué)藥劑多菌靈。表I. NF0919菌株發(fā)酵液的提取物對(duì)葡萄病原菌的平均抑制率
權(quán)利要求
1.黃麻鏈霉菌(Streptomycescor chorus ii') NF0919菌株(該菌種特性見(jiàn)專利ZL201010236886. I)發(fā)酵液中代謝產(chǎn)物的提取方法。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的黃麻鏈霉菌NF0919菌株發(fā)酵液中代謝產(chǎn)物的提取物，在防治葡萄炭疽病、葡萄房枯病、葡萄穗軸褐腐病、葡萄灰霉病、葡萄黑痘病和葡萄白腐病上的應(yīng)用。
3.權(quán)利要求I所述的黃麻鏈霉菌NF0919菌株發(fā)酵液中代謝產(chǎn)物的提取方法，其特征在于包括以下步驟 (A)菌株的活化與一級(jí)種子培養(yǎng)液的培養(yǎng) 將保存的NF0919菌株的斜面在高氏一號(hào)培養(yǎng)基上活化，30°C培養(yǎng)10 d，挑取I cm2大小的菌塊接種于50 mL 一級(jí)種子培養(yǎng)液中，置于170 rpm搖床上30°C振蕩培養(yǎng)44 48 h,其中所述的50 mL—級(jí)種子培養(yǎng)液的成分為可溶性淀粉3%，葡萄糖2%，酵母粉1%，蛋白胨1%，NaCl 0.5%，K2HPO4 O. 2%，可溶性淀粉、葡萄糖、酵母粉、蛋白胨、NaCl和K2HPO4含量的單位比例為W/V ； (B)二級(jí)種子培養(yǎng)液的培養(yǎng) 將步驟(A)所得一級(jí)種子培養(yǎng)液按5%的接種量接入50 mL 二級(jí)種子培養(yǎng)液中，170rpm,30 °C搖床上培養(yǎng)48 - 52 h，其中所述的5%的單位比例為V/V ;所述的50 mL 二級(jí)種子培養(yǎng)液的成分:馬鈴薯淀粉8. 5%，棉籽蛋白2. 2%, CaCO3 O. 1%, K2HPO4 O. 05%，MgSO4 O. 05%,淀粉酶O. 01%,馬鈴薯淀粉、棉籽蛋白、CaCO3、K2HPO4, MgSO4和淀粉酶含量的單位比例為VV； (C)發(fā)酵培養(yǎng)液的培養(yǎng) 將步驟(B)所得二級(jí)種子培養(yǎng)液按5%的接種量接種于裝有160 L發(fā)酵培養(yǎng)液的容積為200 L的發(fā)酵罐中，其中所述的5%的單位比例為V/V，設(shè)置發(fā)酵參數(shù)為溶氧100%，消泡齊IJ(XP-100F系列發(fā)酵用有機(jī)硅消泡劑)1.6 L，攪拌速度為360 rpm,發(fā)酵溫度為36 V，發(fā)酵時(shí)間為72 h，pH 6. 8 7. 2，所述的發(fā)酵培養(yǎng)液的成分為馬鈴薯淀粉8. 5%，棉籽蛋白·2. 6%, K2HPO4 O. 05%, NaCl O. 2%, MgSO4 O. 05%, CaCO3 O. 1%，ρΗ7· 2-7. 4，馬鈴薯淀粉、棉籽蛋白、K2HPO4 ,NaCl、MgSO4和CaCO3含量的單位比例為W/V; (D)NF0919菌株發(fā)酵液中代謝產(chǎn)物提取方法 把步驟(C)所得發(fā)酵液在10000 rpm離心5 min得上清液，用濃鹽酸調(diào)節(jié)pH至2. 0，出現(xiàn)沉淀，再次離心，收集沉淀物，用乙酸乙酯萃取3次，35°C真空干燥得提取物。
全文摘要
本發(fā)明為黃麻鏈霉菌NF0919菌株(其在CGMCC的保藏編號(hào)為CGMCCNo.3968，菌種專利號(hào)為ZL201010236886.1)發(fā)酵液中活性代謝產(chǎn)物的提取方法。代謝產(chǎn)物能有效防治由植物病原真菌圍小叢殼菌(Glomerellacingulata)侵染引發(fā)的葡萄炭疽病、囊孢殼菌(Physalosporabaccae)侵染引發(fā)的葡萄房枯病、鏈格孢菌(Alternariaviticola)引發(fā)的葡萄穗軸褐腐(枯)病、Coniothyriumdlodiella侵染引發(fā)的葡萄白腐病、單軸霉屬(Plasmoparaviticola)侵染引發(fā)的葡萄霜霉病、灰葡萄孢菌(Botrytiscinerea)侵染引發(fā)的葡萄灰霉病和痂囊腔菌(Elsinaeampelina)侵染引發(fā)的葡萄黑痘病等多種植物病害。
文檔編號(hào)C12R1/465GK102899356SQ20121035462
公開日2013年1月30日 申請(qǐng)日期2012年9月23日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月23日
發(fā)明者楊敬輝, 陳宏州, 莊義慶 申請(qǐng)人:江蘇丘陵地區(qū)鎮(zhèn)江農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所